董海平 張高之 趙樂萍

1.浙江省樂清市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，浙江樂清325600；2.浙江省樂清市人民醫(yī)院藥劑科，浙江樂清325600

尿低分子量蛋白聯(lián)合視網(wǎng)膜血管定量參數(shù)用于評估2型糖尿病微血管病變的臨床價值研究

董海平1張高之1趙樂萍2

1.浙江省樂清市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，浙江樂清325600；2.浙江省樂清市人民醫(yī)院藥劑科，浙江樂清325600

目的探討尿低分子量蛋白及視網(wǎng)膜血管定量參數(shù)用于評估2型糖尿病微血管病變的臨床價值。方法將按標準納入的患者分為2型糖尿病正常蛋白尿組、微量蛋白尿組和大量蛋白尿組與健康對照組，測α1-MG、β2-MG和TRF/Cr及視網(wǎng)膜血管定量參數(shù)CRAE、CRVE和Df。結果α1-MG、β2-MG和TRF/Cr三項檢測指標各組各項檢測指標和陽性率組間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CRAE、CRVE和Df各組各項檢測指標組間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論聯(lián)合檢測尿低分子量蛋白質(zhì)α1-MG、β2-MG、TRF/Cr和視網(wǎng)膜血管定量參數(shù)，在診斷早期2型糖尿病患者微血管病變方面有顯著意義，比尿微量蛋白更早提示2型糖尿病微血管病變的發(fā)生，通過聯(lián)合檢測上述指標，對2型糖尿病微血管病變的早期發(fā)現(xiàn)與提早干預可能具有重要的臨床價值。

2型糖尿病微血管病變；評估；尿低分子量蛋白；視網(wǎng)膜血管定量參數(shù)

據(jù)WHO 2014年的最新統(tǒng)計，全球目前大約共有3.47億糖尿病患者[1]，糖尿病已經(jīng)成為全球人類第七大死亡原因。另有一項來自國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明[2]，近10年內(nèi)，中國糖尿病患者翻了近2倍，總人數(shù)已經(jīng)達1.14億，另外還有大約30%尚未得到診斷。目前中國已經(jīng)超過印度，成為世界第一糖尿病大國。

2型糖尿?。═2DM）占糖尿病總發(fā)病率的9.4成以上，隨著病程的進展，其胰島素抵抗為主伴胰島素分泌不足逐漸演變?yōu)橐葝u素分泌不足為主伴胰島素抵抗，期間多種慢性并發(fā)癥開始出現(xiàn)，其中糖尿病腎臟損害、神經(jīng)和各級血管病變是主要的慢性并發(fā)癥，也是2型糖尿病預防與控制的重點和難點之所在。尿微量白蛋白（microalbuminuria，MAU）是指患者尿樣中的MAU的濃度在（20~200）mg/L的亞臨床范圍內(nèi)，它們是患者腎臟微循環(huán)受損的早期敏感指標，表明全身血管內(nèi)皮廣泛受損已經(jīng)開始。國內(nèi)外的多項研究[3-5]提示，MAU的發(fā)生與2型糖尿病患者糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生呈正相關且是一種較強的危險因子，同時也是治療干預效果的優(yōu)良評估指標。近年的研究表明[6-9]，尿中一些低分子量蛋白質(zhì)，如尿α1微球蛋白（α1-MG）、β2微球蛋白（β2-MG）、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF）和視網(wǎng)膜血管直徑可能比尿微量白蛋白更早提示糖尿病患者糖尿病腎病及視網(wǎng)膜病變。尿低分子量蛋白及視網(wǎng)膜血管直徑是否能比MAU更提早的提示2型糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，一直是業(yè)界關注的問題。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選擇2013年3月～2014年9月間在我院內(nèi)分泌科住院的明確診斷的2型糖尿病患者210例，糖尿病病程3～18個月，其中男112例，女98例，年齡46～77歲，平均（60.3±2.9）歲。采用酶免疫法測定患者24 h尿微量白蛋白（MAU）及免散瞳眼底照相檢查，借助ImageJ軟件分析圖像，選擇同一時期門診70例，其中男40例，女30例，年齡45～79歲，平均（59.5±4.4）歲，為未患糖尿病及其他疾病的健康者，作為對照組進行比較。

1.2 診斷標準

2型糖尿病診斷標準：采用國際上通用的2002WHO糖尿病專家委員會提出的診斷標準，具體參照相關文獻[10]。本研究采用早期糖尿病腎病診斷標準以檢測24 h尿MAU定量[（30～300）mg/24 h]，低于30 mg/24 h為正常，＞300 mg/24 h為糖尿病腎病，輔以尿常規(guī)尿蛋白陽性為臨床糖尿病腎??；糖尿病視網(wǎng)膜病變以2002年糖尿病性視網(wǎng)膜病變的國際臨床分級標準為準則。

1.3 分組

24 h MAU＜30 mg/24 h者72例為第Ⅰ組（正常蛋白尿組），其中男38例，女34例，平均年齡（58.3±5.2）歲；30 mg≤24 h MAU≤300 mg者67例為第Ⅱ組（微量蛋白尿組），其中男36例，女31例，平均年齡（62.3± 6.4）歲；24 h MAU＞300 mg者71例為第Ⅲ組（大量蛋白尿組），其中男38例，女33例，平均年齡（61.1±5.9）歲；體檢健康者70例為第Ⅳ組（對照組)，其中男37例，女33例，平均年齡（60.5±6.6）歲。

1.4 排除標準

①2型糖尿病病程雖短卻出現(xiàn)大量蛋白尿、腎功能迅速惡化者；②1型糖尿病患者；③單純腎源性血尿或不明原因蛋白尿伴血尿者；④其他疾病引起的蛋白尿；⑤近期有視力急劇減退而無明顯常見病變者；⑥重度白內(nèi)障者；⑦空腹血糖受損（IFG）和糖耐量異常（IGT）患者。

1.5 標本采集與檢測

允許患者按慣例飲水、運動及攝入蛋白質(zhì)，晨6時至次日晨6時留24 h尿，混合均勻，放入4℃冰箱內(nèi)以待測，用邁瑞B(yǎng)S-800全自動生化析儀檢測MAU和TRF，使用美國貝克曼庫爾特IMMAGE800特種蛋白分析儀及配套專用試劑，采用全自動生化分析儀檢測MAU和TRF；放射免疫速率散射比濁法檢測α1-MG和β2-MG。

檢測尿β2微球蛋白（β2-MG）和尿轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF），β2-MG參考值為（1～2.52）mg/L，單項檢查結果超出參考值上限為陽性，為減少尿流率對檢測結果產(chǎn)生的影響，210例樣本同時采用酶法測定尿肌酐（Cr）做校正；選靜脈早期正位、放大、清晰的圖像，采用德國蔡司共焦激光眼底掃描計算機自動分析系統(tǒng)，在視網(wǎng)膜顳上、下動靜脈向黃斑區(qū)的2～3個細小分支中，本研究統(tǒng)一選擇測量第一個分支的血管直徑，即分別精確測量視網(wǎng)膜顳上、下動靜脈視盤邊界外1個視乳頭直徑處的血管直徑，測量由課題組3位同仁完成，每人測量3次取平均值。

1.6 統(tǒng)計學方法

應用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料中呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示，呈非正態(tài)分布的實驗數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，組間比較用非參數(shù)檢驗，以AUC判斷各指標的診斷價值，相關分析采用Pearson’s或者Spearman’s試驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組各項檢測指標結果與陽性率

2.1.1 各組各項檢測指標比較各組各檢測指標均為非正態(tài)分布，以中位數(shù)表示，經(jīng)非參數(shù)檢驗分析，各組各項指標間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.1.2 三項檢測指標敏感性比較（除外對照組）尿α1-MG的AUC>尿β2-MG的AUC>尿TRF/Cr的AUC。見表2。

2.2 各組視網(wǎng)膜血管參數(shù)的對比與陽性率的分析

210例患者及70例對照組的視網(wǎng)膜血管定量參數(shù)包括視網(wǎng)膜中央動脈直徑（central retinal arteriolar equivalent，CRAE）、視網(wǎng)膜中央靜脈直徑（central reti-nal venular equivalent，CRVE）和分形維數(shù)（fractal di mension，Df）均呈近似正態(tài)分布，CRAE均數(shù)為（133.7± 10.9）μm，CRVE的均數(shù)為（183.9.0±16.4）μm，Df均數(shù)為（1.354±0.061）μm。

表1 三組相關檢測指標比較

表2 各檢測指標AUC比較

各組各項檢測指標間差異有統(tǒng)計學意義，在MUA正常的2型糖尿病組，CRAE、CRVE和Df與正常對照組的差異及不同病程進展的組間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組視網(wǎng)膜血管參數(shù)比較

表3 各組視網(wǎng)膜血管參數(shù)比較

注：與第Ⅲ組（對照組）比較，*P＜0.05；與第Ⅰ組（正常蛋白尿組）比較，#P＜0.05；與第Ⅱ組（微量蛋白尿組）比較，☆P＜0.05

組別nCRAECRVEDf第Ⅰ組第Ⅱ組第Ⅲ組第Ⅳ組72 67 71 70 134.1±10.6*132.3±11.4#128.4±9.69☆136.2±10.5 182.6±17.4*180.4±18.2#177.0±15.6☆185.3±16.6 1.369±0.042*1.351±0.021#1.336±0.024☆1.388±0.0481

2.3 不同指標單獨及聯(lián)合使用檢測陽性率分析

將70例健康對照組的平均值加兩倍標準差確定為臨界值，高于此則為陽性，以對照組檢測結果加2倍標準差為臨界值，高于此臨界值判為陽性，各組各項檢測指標間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

上表表明：在DN患者中，無論正常蛋白尿組、微量蛋白尿組還是大量蛋白尿組，α1-MG、β2-MG、TRF/Cr單項指標檢測的陽性率均低于α1-MG、β2-MG、TRF/Cr與視網(wǎng)膜血管定量參數(shù)聯(lián)合檢測的陽性率，且同一組內(nèi)α1-MG、β2-MG、TRF/Cr聯(lián)合視網(wǎng)膜血管定量參數(shù)聯(lián)合檢測的陽性率組內(nèi)無統(tǒng)計學差異（均P>0.05）。

3 討論

糖尿病微血管病變在2型糖尿病的自然進程中，是危害最嚴重的并發(fā)癥之一，其中的糖尿病腎病將逐漸由早期的微量白蛋白尿期逐漸進展到臨床糖尿病腎病期，這時患者伴隨大量白蛋白尿，而糖尿病視網(wǎng)膜病變的逐漸加重也最終將導致患者失明。在糖尿病微血管病變早期，即微量白蛋白尿期進行干預性治療可逆轉(zhuǎn)疾病進展，改善糖尿病腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的預后。如未能及早發(fā)現(xiàn)并實施有效的干預，2型糖尿病患者中20%將發(fā)展為終末期腎病，靠血液透析或腎移植維持生命。早期糖尿病腎病的篩選對延緩2型糖尿病的自然進程至關重要[11]。

本研究結果顯示，210例早期2型糖尿病患者，無論是正常蛋白尿組、微量蛋白尿組還是大量蛋白尿組其血清α1-MG、β2-MG、TRF/Cr含量均顯著高于正常對照組。

α1-MG為小分子蛋白，在肝細胞和淋巴細胞中被合成，分子量26～33 KD，等電PI=4.5～5.0，α1-MG在正常人群尿中含量甚微，僅血液中的游離型能自由通過腎小球濾過膜，但在正常人體中絕大部分在近曲小管被重新吸收并代謝，目前的研究表明[12-13]，腎功能惡化的程度與腎小管間質(zhì)纖維化程度呈正關聯(lián)，腎小管間質(zhì)結構的損害程度情況在腎病的發(fā)展、預后和轉(zhuǎn)歸中起著決定性的作用，當腎小管受損時，在早期2型糖尿病患者尿微量蛋白正常組中，已經(jīng)有65.3%的患者尿中α1-MG排泌增高，可見α1-MG是近曲小管損害的敏感指標，且其測定較少受尿液pH變動的影響，在腎臟疾病診斷方面具有重要價值。

β2-MG是低分子蛋白質(zhì)，包括100個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為11800 D，主要由肝臟合成，在健康人體內(nèi)的生成和釋放速度恒定，是細胞膜上組織相容性抗原的組成部分，也是細胞表面人類淋巴細胞抗原（HLA）輕鏈蛋白組分，屬單鏈多肽低分子蛋白，能自由通過腎小球濾過膜，反映腎小管的重吸收功能，正常情況下，絕大部分的β2-MG在腎近曲小管在腎小管細胞的吞飲作用（pinocytosis）下進入胞漿，在胞漿內(nèi)被溶酶體降解為氨基酸，極少量從尿中排出，腎臟是代謝β2-MG主要器官，倘若腎臟發(fā)生輕微病變，腎小管吸收功能下降，腎小球濾過膜上合成硫酸乙酰素會減少，腎小球濾過膜電荷選擇屏障受損，β2-MG重吸收減少，則尿β2-MG濃度會升高，測定血和尿β2-MG能反映患者腎小球，腎小管的是否存在雙重損傷，即只有在病理狀態(tài)下，β2-MG才會升高，其中在腎小球早期損害中β2-MG可以顯著升高，β2-MG是一種比血清肌酐、尿素氮更靈敏的反映腎損傷的指標[14]。

表4 各項指標單獨及聯(lián)合使用對DN患者早期糖尿病腎損傷的檢出率比較[n（%）]

尿轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種性質(zhì)特殊性的單鏈糖蛋白，屬球蛋白中的一種，直徑約4 mm，分子量約77000，其蛋白質(zhì)等電點（isoelectric point，PI）為5.6~6.6，生物半衰期為7～10 d，在肝臟內(nèi)通過復雜的機理被合成，是一種具有高度敏感性的小分子循環(huán)內(nèi)臟蛋白，類似于人體白蛋白，但是其所帶負電荷和自身體積均遠小于人體白蛋白，正常人體的腎小球帶有大量負電荷，故絕大部分白蛋白和TRF均不能穿過腎小球濾過膜。對糖尿病腎病早期患者而言，一方面由于腎小球濾過膜上合成的帶有大量負電荷的硫酸乙酰肝素及唾液酸量逐漸減少，與白蛋白和尿轉(zhuǎn)鐵蛋白之間的同性電荷排斥力減小，電荷屏障作用明顯降低，帶較少負電荷的尿轉(zhuǎn)鐵蛋白比尿白蛋白更容易滲漏出來，比白蛋白能更早的提示病變的發(fā)生；另一方面，糖尿病腎病早期，病變的腎小球毛細血管內(nèi)皮細胞逐漸離開基底膜，相鄰上皮細胞足突融合在一起，導致腎小球系膜區(qū)面積增加，與腎小球毛細血管失聯(lián)的腎小球基底膜也出現(xiàn)孔徑增大的病理改變，體積較白蛋白大的微量尿轉(zhuǎn)鐵蛋白的滲出，可以比白蛋白的升高更早說明腎小球體積選擇屏障遭到破壞和損傷[15]。

本研究用尿肌酐（creatinine，Cre）作校正，檢測早期2型糖尿病患者尿α1-MG、β2-MG和TRF/Cr水平，結果發(fā)現(xiàn)早期2型糖尿病患者尿α1-MG、β2-MG和TRF/Cr水平也有明顯升高，表明α1-MG、β2-MG和TRF/Cr較其他指標更能敏感地反映早期2型糖尿病患者腎小球的損傷，可作為診斷早期2型糖尿病腎病早期損傷的靈敏指標。

Molnar等[16]的研究表明，早在2型糖尿病發(fā)生前2～3年，患者就已經(jīng)出現(xiàn)視網(wǎng)膜小動脈狹窄，視網(wǎng)膜小動脈擴張是2型糖尿病微血管功能障礙的特殊征兆，反映了早期微血管的病變，這種功能性的病變在這個階段通常是具有可逆性的，當高糖等危險因素得到有效控制后，這種病變會迅速改善。

血管直徑是了解血流量的狀況最可靠的依據(jù)，視網(wǎng)膜血流增大會使血管擴張，視網(wǎng)膜CRAE和CRVE增寬。Df是臨床測定中相對穩(wěn)定度非常好的數(shù)據(jù)，不受眼底照片分辨率、脈搏及血管數(shù)量的影響，主要數(shù)據(jù)依賴于分叉、分叉角度及分叉間血管長度等因素，多項研究[17、18]已經(jīng)證實，2型糖尿病患者在普通眼底檢查還觀察不到視網(wǎng)膜病變時，其視網(wǎng)膜中央動脈、靜脈、睫狀后動脈就已經(jīng)發(fā)生了血管形態(tài)學的改變，且血流速度及阻力指數(shù)也已發(fā)生了變化，本研究表明，在2型糖尿病患者出現(xiàn)MAU前的正常蛋白尿組CRAE、CRVE和Df就已經(jīng)與健康人群的對照組存在顯著性差異，并隨著2型糖尿病病理過程逐漸加重，CRAE、CRVE和Df的改變加劇，各組間存在的差異具有統(tǒng)計學意義。我們的研究證實，視網(wǎng)膜血管定量參數(shù)或許有望成為2型糖尿病臨床前期的標志。

聯(lián)合檢測尿低分子量蛋白質(zhì)α1-MG、β2-MG、TRF/ Cr和視網(wǎng)膜血管定量參數(shù)，在診斷早期2型糖尿病患者微血管病變方面優(yōu)于單項檢測，整個檢測過程操作方便、結果可靠、患者經(jīng)濟負擔小，設備要求不高，但卻能從腎小球、腎小管、腎功能改變和腎血流動力學改變等多方面監(jiān)測腎臟病變，比尿微量蛋白更早提示腎小球基底病變的發(fā)生及腎小球濾過率的損害，可以明確提示腎臟損傷的程度和準確部位，為干預效果的檢測提供可靠依據(jù)，通過聯(lián)合檢測上述指標，對預防2型糖尿病并發(fā)癥的早期發(fā)現(xiàn)與提早干預可能具有重要的臨床價值。

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Clinical value of urinary low molecular weight proteins combined with retinal vascular quantitative parameters in evaluation of type 2 diabetic microangiopathy

DONG Haiping1ZHANG Gaozhi1ZHAO Leping2

1.Department of Endocrinology,People's Hospital of Yueqing City in Zhejiang Province,Yueqing325600,China;
2.Department of Pharmacy,People's Hospital of Yueqing City in Zhejiang Province,Yueqing325600,China

ObjectiveTo probe into the clinical value of urinary low molecular weight proteins combined with retinal vascular quantitative parameters in evaluation of type 2 diabetic microangiopathy.MethodsThe included eligible patients were divided into the normal albuminuria group,the microalbuminuria group,the macroalbuminuria group according to their type 2 diabetic conditions and the healthy control group.α1-MG,β2-MG and TRF/Cr as well as retinal vascular quantitative parameters CRAE,CRVE and Df were determined in all groups.Results The differences in both detection indicators of α1-MG,β2-MG and TRF/Cr and the positive rate were statistically significant between different groups(P＜0.05);and the differences in detection indicators of CRAE,CRVE and Df were also statistically significant between different groups(P＜0.05).Conclusion The combination of urinary low molecular weight proteins α1-MG,β2-MG and TRF/Cr with retinal vascular quantitative parameters is of significant importance in the early diagnosis of microangiopathy in type 2 diabetic patients,which can earlier prompt the development of type 2 diabetic microangiopathy than microalbuminuria.The joint detection of above indicators may provide important clinical value in the early discovery and intervention of type 2 diabetic microangiopathy.

Type 2 diabetic microangiopathy;Evaluation;Urinary low molecular weight proteins;Retinal vascular quantitative parameters

R587.1

A

1673-9701（2015）18-0010-05

2015－02－14）

浙江省溫州市第一期科技計劃項目（Y20140214）；浙江省自然科學基金項目（LY12H07002）