阮麗萍， 劉 健 ， 王亞黎， 葉文芳， 萬(wàn) 磊

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥230038;2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥230031)

新風(fēng)膠囊是基于新安思想“健脾治痹”上研制的中成藥［1-3］。經(jīng)過(guò)多年的臨床療效檢驗(yàn)，并進(jìn)行了大量的藥理實(shí)驗(yàn)研究。既往臨床研究亦表明［4］，中藥新風(fēng)膠囊具有明顯改善膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)患者膝骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度指數(shù)(LequesneMG)及生活質(zhì)量的作用，且療效優(yōu)于氨基葡萄糖對(duì)照組。

骨關(guān)節(jié)炎是力學(xué)與生物學(xué)因素共同作用的結(jié)果，目前認(rèn)為主要涉及的機(jī)制是關(guān)節(jié)軟骨、細(xì)胞外基質(zhì)、軟骨下骨的合成和降解的紊亂［5］。IgG 在臨床上有一定的價(jià)值，其升高與病程和疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。TNF-α、IL-4 是一對(duì)經(jīng)典的炎性細(xì)胞因子，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中研究相對(duì)較為成熟［6］。自噬是機(jī)體的一種穩(wěn)態(tài)機(jī)制，在免疫和炎癥以及抵抗微生物感染中起著至關(guān)重要的作用［7-8］。本文旨在通過(guò)觀察新風(fēng)膠囊對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠外周血免疫球蛋白、軟骨及免疫器官胸腺、脾臟中Atg 的表達(dá)以及外周血TNF-α、IL-4 的影響，從而分析其治療骨關(guān)節(jié)炎的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)(SPF)雄性Wistar 大鼠40只，鼠齡5 ～6 月，體質(zhì)量(170.0 ±20.5)g，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK (皖)2011-002。清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，供試前常規(guī)飼養(yǎng)7 d，觀察無(wú)異常者入組實(shí)驗(yàn)。

1.2 材料 新風(fēng)膠囊:由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，批號(hào)110521 (HPLC 指紋圖譜見(jiàn)圖1);氨基葡萄糖，由浙江海正醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20110411;木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸，美國(guó)MERK 公司(批號(hào)MB3052;MB4036)。

圖1 新風(fēng)膠囊HPTLC 指紋圖譜(A)，新風(fēng)膠囊HPTLC指紋圖譜三維圖(B)［9］Fig.1 HPTLC fingerprints chromatogram of Xinfeng Capsules (A)，Three-dimensional thin-layer chromatogram of Compound Xinfeng Capsules (B)

IL-4、TNF-α、IgG1、IgG2α ELISA 試 劑 盒(批號(hào) E-30418;E-30633;E-30677;E-30766);瓊脂糖凝膠(批號(hào)111860);DL2000 DNA Marker由日本TaKaRa 公司提供(批號(hào)B7301A);Trizol由美國(guó)Invitrogen 公司提供(批號(hào)14105);氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇由上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司提供 (批 號(hào) 20120320;20120320;20120210 );DEPC 由 美 國(guó) Sigma 公 司 提 供 (批 號(hào)20130119215);QuantiFast SyBr Green PCR kit 由德國(guó)Qiagen 公司提供(批號(hào)No 204054);6 ×Loading buffer 由 日 本 TaKaRa 公 司 提 供 (批 號(hào)A5201A);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由美國(guó)Thermo 公司提供(批號(hào)00145205);GoldView 核酸染料由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司提供(批號(hào)130618)。

1.3 設(shè)備 酶標(biāo)儀(雷杜RT6000);普通PCR 儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)K960);電泳儀(Tanon EPS 300 型);紫外凝膠成像系統(tǒng)(北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司);熒光定量PCR 儀(Thermo PIKOREAL 96);微孔板迷你離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司，型號(hào)MINI-P25);光鏡(日本產(chǎn)OLYMPUS 光學(xué)顯微鏡)，日產(chǎn)JEM-1230 型透射觀察攝片(日本電子公司)。

1.4 方法

1.4.1 膝骨關(guān)節(jié)炎模型復(fù)制及給藥 按隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分4 組:正常對(duì)照組 (Normal control group，NC)，模型對(duì)照組 (Model control group，MC)，氨基葡萄糖對(duì)照組 (Glucosamine control group，GS)以及新風(fēng)膠囊組，每組10 只。除正常對(duì)照組外，向其余各組大鼠右膝關(guān)節(jié)注射4%木瓜蛋白酶溶液與0.03 mol/L L-半胱氨酸溶液混合液20 μL，分別于第3、7 天加強(qiáng)，造成KOA 模型［10］。造模后第14 天開(kāi)始給藥，劑量相當(dāng)于臨床病人用量的10 倍。各組給藥量如下:正常組與模型組，給予生理鹽水灌胃0.01 g/kg，1 mL/100 g;氨基葡萄糖組，氨基葡萄糖細(xì)末加生理鹽水，配制成混懸液，按0.098 g/kg，1 mL/100 g 劑量灌胃;新風(fēng)膠囊組，新風(fēng)膠囊去膠囊殼，加生理鹽水，配制成混懸液，按0.375 g/kg，1 mL/100 g 劑量灌胃。1 次/日，連續(xù)給藥30 d，造模后第49 天取材。

1.4.2 病理觀察 取3 ～6 脛骨內(nèi)側(cè)、脛骨外側(cè)處標(biāo)本。標(biāo)本固定72 h，脫鈣48 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，5 μm 厚度連續(xù)切片。HE 染色后，根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(Mankin’s Score)進(jìn)行分級(jí)評(píng)定。

1.4.3 透射電鏡觀察軟骨自噬情況 (1)取軟骨組織1 mm3大小，固定于2.5%戊二醛(4 ℃)4 ～6 h;(2)PBS (pH 7.2)洗2 ～12 h;(3)將組織后固定于1%鋨酸1 h;(4)4.30%、50%乙醇脫水各15 min; (5)70%醋酸鈾乙醇飽和液中6 ～12 h; (6)80%、95%乙醇脫水各15 min;(7)無(wú)水乙醇×2 次，每次40 min; (8)環(huán)氧丙烷30 min;(9)環(huán)氧炳烷∶環(huán)氧樹(shù)脂(1 ∶1)2 h;(10)環(huán)氧炳烷∶環(huán)氧樹(shù)脂(1 ∶2)1 h;(11)浸環(huán)氧樹(shù)脂(Epon812)2 h; (12)環(huán)氧樹(shù)脂包埋，后入45 ℃烤箱中12 h; (13)65 ℃烤箱中48 h;(14)取出包埋好的組織進(jìn)行超薄切片(片厚70 nm，切片機(jī)型號(hào)為L(zhǎng)KB-NOVA 型，瑞典產(chǎn));(15)將切好的片子水洗后放入醋酸鈾飽和水溶液中30 min; (16)雙蒸水洗×3 次，每次15 min;(17)入枸櫞酸鉛染液15 min;(18)雙蒸水洗×3次，每次10 min;(19)透射觀察攝片。

1.4.4 ELISA 法檢測(cè)IL-4、TNF-α、IgG1、IgG2α動(dòng)物處死后，行腹主動(dòng)脈采血，將所采血液3 000 r/min 離心5 min，取血清，置-80 ℃冰箱保存待測(cè)。具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果判定:在波長(zhǎng)450 nm 的酶標(biāo)儀上讀取各孔的光密度(optical density，OD)值;以O(shè)D 值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制曲線圖，根據(jù)樣品的OD 值查找對(duì)應(yīng)的濃度范圍。

1.4.5 RT-PCR 檢測(cè)脾臟、胸腺、軟骨自噬相關(guān)基因 Atg5 熒光定量引物序列為:正向5’-ATTCCAACGTGCTTTACTCTCTATC-3’，反向5’-AAACCAAATCTCACTAACATCTTCT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度165 bp。大鼠ATG7 熒光定量引物序列:正向5’-GTGTACGATCCCTGTAACCTAACCC-3’，反 向 5’-CGAAAGCAGAGAACTTCAACAGACT-3’，產(chǎn) 物 長(zhǎng)度116 bp。大鼠ATG12 熒光定量引物序列:正向5-GGCACCAGCTCTAGGCTTATAGTTG-3 ’， 反 向5’-GTTGTTCCACAGCATTTTCCATG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度124 bp。β-actin:正向5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，反向5-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，擴(kuò)增序列150 bp。提取總RNA 后，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):(1)在0.2 mL EP 管中，加入總RNA (質(zhì)量為3 μg)、10 μM Oligo (dT)1 μL，DEPC 水補(bǔ)足至12 μL，輕輕混勻、點(diǎn)動(dòng)離心; (2)PCR 儀上65 ℃加熱5 min，立即冰浴3 min;(3)在上述EP管中加入5 ×反應(yīng)緩沖液4.0 μL、10 mM dNTP 混合物2 μL、核糖核酸酶抑制劑1 μL、反轉(zhuǎn)錄酶1 μL; (4)PCR 儀上42 ℃60 min，70 ℃5min;(5)取出上述反應(yīng)液，即為cDNA， -80℃保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR 反應(yīng):取出上述反應(yīng)液1 μL作為熒光定量的模板，反應(yīng)體系如下，2 ×核酸染料混合物5 μL，10 μM 正向引物1 μL，10 μM 反向引物1 μL，DNA 模板1 μL，滅菌水2 μL，反應(yīng)總體積為10 μL。反應(yīng)條件如下:95 ℃5 min (步驟1)，95 ℃10 s (步驟2);60 ℃30 s (步驟3)。步驟2 和3 40 循環(huán)。結(jié)果及分析包括擴(kuò)增曲線、熔解曲線以及相對(duì)表達(dá)量。本次實(shí)驗(yàn)所使用的分析方法為relative quantification study，分析所采用的指標(biāo)為2-△△Ct。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，連續(xù)性變量用±s 表示，樣本符合正態(tài)性分布，正常組和模型組組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Spearman 分析，以P ＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新風(fēng)膠囊對(duì)KOA 大鼠軟骨自噬超微結(jié)構(gòu)的影響 正常組細(xì)胞形態(tài)良好，細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)脂滴，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，集中于靠核區(qū)域，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜較清晰，胞漿內(nèi)可見(jiàn)豐富的細(xì)胞器，并可見(jiàn)豐富的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體;模型組可見(jiàn)細(xì)胞器減少，胞漿內(nèi)可見(jiàn)空泡變性，線粒體腫脹，雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體極少。新風(fēng)膠囊組及氨基葡萄糖組細(xì)胞形態(tài)良好，胞漿內(nèi)可見(jiàn)豐富的細(xì)胞器，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)尚可，并可見(jiàn)到自噬小體。見(jiàn)圖2。

圖2 電鏡下各組大鼠軟骨自噬泡及細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)表現(xiàn)(×20K)Fig.2 Autophagy and cell substructure under the electron microscope (×20K)

2.2 新風(fēng)膠囊對(duì)KOA 大鼠體質(zhì)量及關(guān)節(jié)軟骨病理評(píng)分的影響 造模前各組大鼠體質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。與正常組比較，氨基葡萄糖組、新風(fēng)膠囊組給藥前1 d 體質(zhì)量顯著下降，關(guān)節(jié)軟骨病理評(píng)分顯著上升(P ＜0.05 或P ＜0.01)，模型組給藥后30 d 體質(zhì)量明顯下降，軟骨病理評(píng)分明顯升高;與模型組比較，新風(fēng)膠囊組給藥30 d后體質(zhì)量明顯升高，軟骨病理評(píng)分明顯降低;氨基葡萄糖組軟骨病理評(píng)分明顯降低(P ＜0.01);與氨基葡萄糖組比較，新風(fēng)膠囊組給藥30 d 后體質(zhì)量明顯升高，軟骨病理評(píng)分明顯降低(P ＜0.01)，見(jiàn)圖3，表1。

圖3 各組大鼠軟骨HE 染色(×200)Fig.3 Cartilage morphological observation of KOA rats (HE staining，×200)

表1 新風(fēng)膠囊對(duì)各組KOA 大鼠體質(zhì)量及關(guān)節(jié)軟骨病理評(píng)分的影響(±s，n=10)Tab.1 The effects of XFC on the body mass and Mankin in KOA rats (±s，n=10)

表1 新風(fēng)膠囊對(duì)各組KOA 大鼠體質(zhì)量及關(guān)節(jié)軟骨病理評(píng)分的影響(±s，n=10)Tab.1 The effects of XFC on the body mass and Mankin in KOA rats (±s，n=10)

注:與正常組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01;與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與氨基葡萄糖組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 體質(zhì)量/g造模前1 d 給藥前1 d 給藥后30 d 軟骨病理評(píng)分正常組 172.00 ±14.21 250.80 ±21.89 318.80 ±31.67 1.14 ±0.40模型組 179.20 ±8.79 229.20 ±13.83 274.80 ±22.07▲ 5.72 ±0.86▲▲氨基葡萄糖組 172.40 ±10.81 211.20 ±13.39▲▲ 294.80 ±15.59 2.94 ±0.42▲▲＊＊新風(fēng)膠囊組 164.40 ±15.32 212.80 ±13.31▲ 345.60 ±24.88＊＊△△ 2.02 ±0.35▲▲＊＊△△

2.3 新風(fēng)膠囊對(duì)KOA 大鼠免疫球蛋白及細(xì)胞因子的影響 與正常組比較，模型組血清IgG1、IgG2α、TNF-α 升高，IL-4 降低，(P ＜0.05 或P ＜0.01);與模型組比較，新風(fēng)膠囊組IgG1、IgG2α、TNF-α 降低，IL-4 升高(P ＜0.05 或P ＜0.01)，氨基葡萄糖組IL-4 明顯升高(P ＜0.01)，TNF-α、IgG1 降低(P ＜0.05 或P ＜0.01);與氨基葡萄糖組比較，新風(fēng)膠囊組給藥30 d 后，IL-4 升高(P ＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2 新風(fēng)膠囊對(duì)KOA 大鼠外周血免疫球蛋白細(xì)胞因子的影響(±s，n=10)Tab.2 Effects of XFC on the IgG and cytokines in KOA rats (±s，n=10)

表2 新風(fēng)膠囊對(duì)KOA 大鼠外周血免疫球蛋白細(xì)胞因子的影響(±s，n=10)Tab.2 Effects of XFC on the IgG and cytokines in KOA rats (±s，n=10)

注:與正常組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01;與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與氨基葡萄糖組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 IL-4/(pg·mL -1) TNF-α/(ng·L -1) IgG1/(μg·mL -1) IgG2α/(μg·mL -1)正常組 166.84 ±17.34 207.46 ±15.28 115.85 ±10.83 44.67 ±6.94模型組 31.85 ±1.75▲▲ 252.56 ±11.59▲▲ 148.28 ±14.35▲▲ 55.46 ±8.66▲氨基葡萄糖組 58.52 ±13.57▲▲＊＊ 207.92 ±10.19* 125.19 ±18.03* 50.14 ±13.44新風(fēng)膠囊組 121.98 ±14.43▲▲＊＊△△ 208.67 ±37.98* 127.9 ±9.8* 37.96 ±9.14＊＊

2.4 新風(fēng)膠囊對(duì)KOA 大鼠軟骨、胸腺、脾臟Atg的影響 與正常組比較，在胸腺、脾臟、軟骨等各組織中，模型組Atg 存在不同程度的降低(P ＜0.05 或P ＜0.01);與模型組比較，氨基葡萄糖軟骨Atg5、Atg7，脾臟Atg12，胸腺中Atg7、Atg12存在不同程度升高(P ＜0.01 或P ＜0.05)，新風(fēng)膠 囊 組 軟 骨 Atg5、Atg7、Atg12、脾 臟 Atg5、Atg12，胸腺中Atg7、Atg12 存在不同程度升高(P ＜0.01 或P ＜0.05);與氨基葡萄糖組比較，新風(fēng)膠囊組給藥30 d 后，Atg5、Atg7 在軟骨、胸腺中升高(P ＜0.05 或P ＜0.01)，Atg12 在軟骨、胸腺、脾臟中均升高(P ＜0.01)，見(jiàn)表3。

表3 新風(fēng)膠囊對(duì)KOA 大鼠軟骨、胸腺、脾臟Atg 的影響(±s，n=10)Tab.3 Effects of XFC on the Atg of cartilage，thymus and spleen in KOA rats (±s，n=10)

表3 新風(fēng)膠囊對(duì)KOA 大鼠軟骨、胸腺、脾臟Atg 的影響(±s，n=10)Tab.3 Effects of XFC on the Atg of cartilage，thymus and spleen in KOA rats (±s，n=10)

注:與正常組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01;與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與氨基葡萄糖組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別軟骨 胸腺 脾臟Atg5 Atg7 Atg12 Atg5 Atg7 Atg12 Atg5 Atg7 Atg12正常組 0.86±0.21 1.01±0.14 1.01±0.11 1.00±0.02 1.00±0.06 1.00±0.11 1.01±0.18 1.02±0.24 1.00±0.09模型組 0.16±0.01▲▲ 0.46±0.06▲▲ 0.49±0.04▲▲ 0.73±0.05▲▲ 0.56±0.04▲▲ 0.33±0.22▲▲ 0.43±0.05▲▲0.73±0.04▲0.46±0.04▲▲氨基葡萄糖組 0.25±0.08▲▲＊ 0.53±0.08▲▲＊＊ 0.59±0.03▲▲ 0.81±0.08▲▲ 0.71±0.04▲▲＊＊ 0.66±0.24▲▲＊ 0.44±0.09▲▲0.89±0.05 0.75±0.08▲▲＊＊新風(fēng)膠囊組 0.58±0.33＊△ 0.9±0.05＊＊△ 0.97±0.13＊△△ 0.87±0.07▲△△ 1.03±0.16＊＊△△ 0.91±0.14＊＊△△0.65±0.07＊＊ 0.79±0.13 0.94±0.12＊＊△△

2.5 KOA 大鼠軟骨病理評(píng)分、免疫球蛋白細(xì)胞因子及軟骨胸腺脾臟Atg 等指標(biāo)的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示:IL-4 與軟骨病理評(píng)分、TNF-α、胸腺Atg12 呈負(fù)相關(guān)，與脾臟Atg5、Atg7 呈正相關(guān);TNF-α 與軟骨病理評(píng)分呈正相關(guān);IgG1 與軟骨病理評(píng)分、TNF-α 呈正相關(guān)，與IL-4、脾臟Atg7 呈負(fù)相關(guān);IgG2α 與軟骨病理評(píng)分評(píng)分、TNF-α、胸腺Atg12 呈正相關(guān)，與IL-4 呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)表4。

3 討論

本次研究中我們發(fā)現(xiàn)在KOA 大鼠的模型中，IgG1、IgG2α、TNF-α 的表達(dá)升高，IL-4 及Atg 在胸腺、軟骨、脾臟中表達(dá)整體呈降低趨勢(shì)，而新風(fēng)膠囊組以及氨基葡萄糖組的各組指標(biāo)趨向正常組，在降低軟骨Mankin 評(píng)分及升高IL-4 方面，新風(fēng)膠囊組優(yōu)于氨基葡萄糖組。說(shuō)明在骨關(guān)節(jié)炎中確實(shí)存在著體液免疫及自噬的紊亂，而新風(fēng)膠囊及氨基葡萄糖均可通過(guò)對(duì)自噬水平及細(xì)胞因子的調(diào)控，改善軟骨代謝。相關(guān)性分析顯示:IgG1 與Mankin 評(píng)分、TNF-α 呈正相關(guān)，與IL-4、脾臟Atg7 呈負(fù)相關(guān);IgG2α 與Mankin 評(píng)分、TNF-α、胸腺Atg12 呈正相關(guān)，與IL-4 呈負(fù)相關(guān)。就組織而言，自噬基因與細(xì)胞因子及免疫球蛋白的相關(guān)性主要表現(xiàn)在脾臟和胸腺，而與軟骨Atg 無(wú)相關(guān)性。

表4 KOA 大鼠軟骨病理評(píng)分、免疫球蛋白細(xì)胞因子及Atg 等指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis between Mankin scores and levels of IgG、Atg in KOA rat

IgG 是一種糖蛋白，依據(jù)其糖鏈的不同，分為IgG1 ～4 型。IgG2 “雙天線”末端都具有半乳糖，主要的抗原為糖蛋白，IgG1 則有一個(gè)半乳糖缺失，是蛋白類抗原的抗體的主要成分［11］。IgG 糖鏈結(jié)構(gòu)的變化在風(fēng)濕類疾病中的研究集中在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，以IgG0 的作用較為突出，主要表現(xiàn)為量的增加和對(duì)免疫球蛋白Fc 片段結(jié)合能力的下降。對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎免疫球蛋白的研究目前尚少，而在對(duì)免疫球蛋白的相關(guān)研究認(rèn)為，IgG 糖鏈結(jié)構(gòu)的變化使IgG 自身成為免疫中的異己成分被識(shí)別，與抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，沉積于關(guān)節(jié)滑膜、軟骨，刺激活化補(bǔ)體，促發(fā)一系列的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子破壞侵蝕關(guān)節(jié)軟骨，刺激骨質(zhì)的增生［12］。

TNF-α 參與了KOA 的滑膜組織變性、炎癥反應(yīng)和自身免疫應(yīng)答3 個(gè)病理生理過(guò)程，其作用地位僅次于IL-1β。TNF-α 通過(guò)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化反應(yīng)，增加骨、軟骨的破壞的同時(shí)，還能夠激活破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨吸收，抑制成骨細(xì)胞形成Ⅰ型骨膠原。臨床觀察［13］也證實(shí)KOA 患者的血清及關(guān)節(jié)滑液中細(xì)胞因子水平均明顯高于正常水平，其中關(guān)節(jié)液水平高于血清水平。TNF-α 還具有誘導(dǎo)人體滑液中的成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌化學(xué)吸收蛋白的作用。通過(guò)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞體系檢測(cè)到TNF-α可下調(diào)KOA 軟骨細(xì)胞蛋白聚糖mRNA 的表達(dá)，而蛋白聚糖是軟骨外基質(zhì)的主要成分之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，白介素-4 (IL-4)在軟骨代謝過(guò)程中起重要的軟骨保護(hù)作用［14］。

自噬在生理狀態(tài)下保護(hù)機(jī)體，但是一旦被過(guò)分激活，對(duì)機(jī)體又是一種損傷［15］。自噬在免疫和炎癥以及抵抗微生物感染中起著至關(guān)重要的作用，其參與到機(jī)體免疫中并促進(jìn)了炎癥性疾病的發(fā)展［16-17］。自噬是天然免疫的重要部分，細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞可通過(guò)分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)自噬，進(jìn)而調(diào)控獲得性免疫應(yīng)答。自噬的形成依賴于兩個(gè)泛素樣結(jié)合系統(tǒng):Atg12/Atg5、Atg8/LC3。其中Atg12 泛素樣蛋白可被Atg7 活化，然后與Atg5 或磷脂酰乙醇胺結(jié)合。在細(xì)胞內(nèi)微生物的免疫反應(yīng)中，TNF-α能激活細(xì)胞自噬，IL-4 能抑制細(xì)胞自噬，進(jìn)而控制胞內(nèi)微生物的傳播［18］。而本研究的結(jié)果顯示IL-4胸腺的Atg12 呈負(fù)相關(guān)，與脾臟Atg、Atg7 呈正相關(guān)。我們思考可能的原因有兩方面:首先，骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠本身出現(xiàn)自噬水平的降低，反饋性上升了TNF-α，降低了IL-4，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞及單核細(xì)胞分泌化學(xué)可吸收蛋白，使軟骨細(xì)胞及基質(zhì)破壞，蛋白抗原及糖蛋白暴露于免疫系統(tǒng)，刺激了IgG 的釋放。另外也可能是微生物的免疫與自身免疫中的體液免疫及細(xì)胞免疫處于不同的調(diào)控通路，故對(duì)自噬水平的調(diào)控作用亦不相同。相關(guān)性主要表現(xiàn)在胸腺及脾臟，可能是因?yàn)檫@二者為免疫器官，與相關(guān)免疫指標(biāo)關(guān)系更為密切。但并不能說(shuō)明軟骨中的自噬與炎癥無(wú)關(guān)，軟骨中自噬基因的變化也較為明顯，它可能受到更多因素的調(diào)控。

新風(fēng)膠囊主要由黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣等組成。諸藥［19］都有不同程度的抗炎鎮(zhèn)痛的作用。其中黃芪、薏苡仁益氣健脾，能調(diào)節(jié)雷公藤具有免疫抑制造成的免疫力低下等不良反應(yīng)?，F(xiàn)代藥理研究表明［20］，黃芪能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的數(shù)量以及吞噬能力。雷公藤能祛風(fēng)濕、活血通絡(luò)、消腫止痛，現(xiàn)代藥理研究表明，雷公藤具有抗炎鎮(zhèn)痛、促進(jìn)腎上腺合成皮質(zhì)激素樣作用，對(duì)免疫系統(tǒng)主要表現(xiàn)為抑制作用，抑制白介素等細(xì)胞因子的表達(dá)，從而達(dá)到治療效果［21］。

既往的研究表明，中藥新風(fēng)膠囊具有提高SOD，降低MDA，清除氧自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷，降低炎癥反應(yīng)損傷等作用［22］。新風(fēng)膠囊可能通過(guò)上調(diào)自噬水平，抑制免疫炎癥反應(yīng)，而達(dá)到改善軟骨代謝的作用。

骨關(guān)節(jié)炎一直以來(lái)作為一種退行性病變，免疫機(jī)制研究較少。而中醫(yī)及中成藥治療骨關(guān)節(jié)炎的優(yōu)勢(shì)因現(xiàn)代分子證據(jù)的支持而無(wú)法凸顯。我們將對(duì)新風(fēng)膠囊治療痹癥的機(jī)制作更深入的研究。

［1］ 劉 健，鄭志堅(jiān). 從《內(nèi)經(jīng)》痹證理論探討類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的中醫(yī)病機(jī)［J］. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24(4):8-10.

［2］ 劉 健. 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎從脾論治探討［J］. 安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，23(1):1-3.

［3］ 劉 健，鄭志堅(jiān)，方朝暉，等. 新風(fēng)膠囊對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞及脾臟淋巴細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001，21(12):917-919.

［4］ 劉 健，張金山，汪四海. 新風(fēng)膠囊對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎患者嚴(yán)重程度指數(shù)及生活質(zhì)量的影響［J］. 中醫(yī)藥臨床雜志，2011，23(5):429-431.

［5］ Uchida K，Baba H，Maczawa Y，et al. Progressive changes in neurofilament proteins and growth associated protein-43 immunoreactivities at the site of cervical spinal cord compression in spinal hyerostoticmice［J］. Spine，2002，27(5):480-487.

［6］ 張金山，劉 健. 骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制及中醫(yī)藥研究進(jìn)展［J］. 河南中醫(yī)，2011，31(2):201-203.

［7］ Levine B，Mizushima N，Virgin H W. Autophagy in immunity and inflammation［J］. Nature，2011，469(7330):323-335.

［8］ Deretic V. Autophagy in immunity and cell-autonomous defense against intracellular microbes［J］. Immunol Rev，2011，40(1):92-104.

［9］ Wang F，Meng M，Chen L，et al. Development and validation of a high-performance thin-layer chromatographic fingerprint method for the evaluation of QiYi Capsules with the reference of myotonin［J］. J Planar Chromatogr-Mod TLC，2014，27(3):199-203.

［10］ 尹 明，熊 輝，賀荔枝. 用木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸建立大鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型的研究［J］. 中國(guó)科技論文在線精品論文，2009，2(23):2474-2479.

［11］ 孫文才，白玉江，李玉成，等. 骨關(guān)節(jié)炎患者血清及關(guān)節(jié)滑液中細(xì)胞因子的表達(dá)水平研究［J］. 中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2012，15(27):3185-3186.

［12］ 曾常茜，王振明. IgG 糖鏈異常與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［J］. 國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)，2004，25(2):166-168.

［13］ Rudd P M ，Elliott T ，Cresswell P ，et al. Glycosylation and the immune system ［J］. Science，2001，291 (5512 ):2370-2376.

［14］ Silvestri T，Pulsateli L，Dolzani P，et al. Brief report:elevated serum levels of soluble interleukin-4 receptor in osteoarthritis［J］. Osteoarthritis Cartilage，2006，14(3):717-719.

［15］ Levine B. Eating oneself and uninvited guests:autophagyrelated pathways in cellular defense［J］. Cell，2005，120 (6):159-162.

［16］ Deretic V. Autophagy in immunity and cell-autonomous defense against intracellular microbes［J］. Immunol Rev，2011，240(1):92-104.

［17］ Saitoh T，Akira S. Regulation of innate immune responses by autophagy-related proteins［J］. J Cell Biol，2010，189(6):925-935.

［18］ Harris J. T helper 2 cytokines inhibit autophagic control of intracellular Mycobacterium tuberculosis［J］. Immunity，2007，27(2):505-517.

［19］ 劉 健. 新風(fēng)膠囊對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1、TNF-α、IL-4 及IL-10 的影響［J］. 安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，21(2):44-47.

［20］ 牛小飛，王宏艷，郭琛琛，等. 黃芪多糖對(duì)小鼠免疫細(xì)胞活性研究［J］. 北京農(nóng)業(yè)，2012(5):124-126.

［21］ 袁文旗，王 洪，趙玉鑫，等. 黃芪關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射后兔骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨退行性變及滑膜組織中氧化物歧化酶活性的變化［J］. 中國(guó)臨床康復(fù)，2006，39(10):92-94.

［22］ 程園園，劉 健，萬(wàn) 磊，等. 新風(fēng)膠囊對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎患者B、T 淋巴細(xì)胞衰減因子及氧化應(yīng)激的影響［J］. 免疫學(xué)雜志，2013，2(5):416-421.