黃威峰， 劉苗苗，2， 袁 丁， 彭 奔， 張長城*

（1.三峽大學醫(yī)學院，湖北宜昌443002；2.三峽大學化學與生命科學學院，湖北宜昌443002）

五子衍宗方對環(huán)磷酰胺致小鼠肝臟細胞DNA損傷的保護作用

黃威峰1， 劉苗苗1，2， 袁 丁1， 彭 奔1， 張長城1*

（1.三峽大學醫(yī)學院，湖北宜昌443002；2.三峽大學化學與生命科學學院，湖北宜昌443002）

目的研究五子衍宗方對環(huán)磷酰胺（CTX）誘導的小鼠肝臟細胞DNA損傷的保護作用。方法將BALB/c小鼠隨機分為正常對照組，模型組，五子衍宗方低、高劑量組，每組10只。五子衍宗方組預給藥一周之后，除正常對照組之外，其余各組注射CTX（100 mg/kg）隔天給藥共3次，末次注射CTX 12 h后處死小鼠。檢測小鼠的肝臟指數(shù)，血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （AST）活力。硫代巴比妥酸法檢測肝臟中丙二醛 （MDA）的量，ELISA檢測肝臟中8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的量，單細胞凝膠電泳技術檢測肝臟細胞的DNA損傷。結果五子衍宗方能夠升高小鼠的肝臟指數(shù)，降低ALT、AST的活力，降低肝臟中的8-OHdG、MDA的量，五子衍宗方組均可以使小鼠Olive尾矩、尾長、尾距和尾部DNA%降低。結論五子衍宗方能拮抗CTX造成的小鼠肝臟細胞的DNA損傷，提高肝臟的抗氧化能力。

五子衍宗方；環(huán)磷酰胺；DNA損傷；氧化損傷

環(huán)磷酰胺 （CTX）是臨床上廣泛使用的烷化劑類抗腫瘤藥和免疫抑制劑。CTX在體外沒有烷化活性，需在體內(nèi)經(jīng)肝臟的P-450混合功能氧化酶代謝生成具有烷化活性的4羥基環(huán)磷酰胺、磷酰胺氮芥、丙烯醛和大量的活性氧自由基。磷酰胺氮芥和丙烯醛能夠與DNA交聯(lián)，代謝產(chǎn)生的自由基也會和DNA發(fā)生結合，引起DNA單雙鏈的斷裂，從而抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，最終導致細胞的死亡。CTX在臨床上有廣泛的應用，但其同時也會對正常的細胞表現(xiàn)出嚴重的毒性，在用CTX治療的病人中出現(xiàn)二次癌癥的幾率非常高，國際癌癥研究機構（IARC）把CTX作為致癌物。CTX的臨床應用因?qū)φ＜毎亩拘远幌拗疲虼藴p少CTX引起的正常細胞的DNA損傷顯得非常重要［1］。

五子衍宗方是由菟絲子、枸杞子、五味子、車前子、覆盆子五味中藥組成，藥理研究發(fā)現(xiàn)五子衍宗丸具有抗自由基、抗衰老、增強免疫力等功效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，五子衍宗方具有提高環(huán)磷酰胺模型小鼠免疫功能、增強抗氧化損傷能力的藥理作用，對小鼠免疫低下、骨髓抑制、生精障礙等都有較好的防治作用。進一步研究顯示，五子衍宗方可提高環(huán)磷酰胺小鼠體內(nèi)的抗氧化能力，降低小鼠血漿、睪丸組織中MDA水平，增加SOD活力，提示五子衍宗方通過抗氧化損傷來拮抗環(huán)磷酰胺毒性［2-3］。近期研究證明，五子衍宗方、菟絲子和枸杞子可以減少自由基，提高機體的抗氧化能力，減少外周血白細胞線粒體的DNA缺失，保護老年大鼠骨骼肌線粒體DNA的損傷，說明五子衍宗方、菟絲子和枸杞子對DNA氧化損傷具有良好的保護作用［4-5］。但五子衍宗丸能否拮抗環(huán)磷酰胺造成的肝臟細胞DNA損傷仍有待進一步研究。

1 材料

1.1 實驗動物 8～9周齡的SPF級BALB/c種小鼠，體質(zhì)量22～25 g，由湖北省實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2008-0005。在相對濕度55%～65%，溫度 （20±2）℃的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)。

1.2 藥品 MDA、考馬斯亮藍試劑盒購自南京建成生物工程研究所。環(huán)磷酰胺購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。五子衍宗方由400 g枸杞子、400 g菟絲子、200 g覆盆子、100 g車前子、50 g五味子組成。按照傳統(tǒng)方法煎取，濃縮至浸膏，提取率為18.8%。

1.3 儀器 穩(wěn)流可調(diào)式電泳儀 （北京六一儀器廠），BX51型Olympus熒光顯微鏡并配有CCD攝像裝置（日本），紫外分光光度計。

2 方法

2.1 分組和給藥方法 40只雄性BALB/c小鼠，隨機分為空白組、模型組、五子衍宗方低、高劑量組每組10只。五子衍宗方組預給藥一周之后，除空白對照組腹腔注射生理鹽水，其余各組注射CTX100 mg/kg隔天給藥共3次，末次注射環(huán)磷酰胺12 h后處死小鼠。

2.2 指標檢測

2.2.1 小鼠肝臟指數(shù)的測定 末次給藥12 h后稱定質(zhì)量，處死小鼠，迅速取出肝臟，用生理鹽水洗凈之后，經(jīng)濾紙擦去表面的水分并稱定質(zhì)量，以肝臟質(zhì)量 （mg）/體質(zhì)量（g）來計算肝臟指數(shù)。

2.2.2 小鼠血清中生化指標的測定 各組小鼠取血后靜置30min，3 500 r/min離心10 min，常規(guī)分離血清，送至宜昌市中心醫(yī)院檢測血清ALT、AST水平。

2.2.3 肝臟中MDA和8-OHdG的測定 取0.1 g肝臟組織用PBS洗兩次，加入9倍的生理鹽水，倒入玻璃勻漿管中，在冰上勻漿5min，將組織勻漿以3 000 r/min離心15 min，棄下面的沉淀留上清。按照說明書，用比色法測定肝臟中MDA和組織中蛋白的水平，ELISA法檢測肝臟勻漿中8-OHdG水平。

2.2.4 堿性單細胞凝膠電泳 取0.1～0.3 g肝臟組織，加1 mL PBS用剪刀剪碎，200尼龍網(wǎng)過濾，用細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞密度至1×106個/mL。在載玻片上粘上小玻璃條制成微電泳槽，第1層膠是將PBS配制的1%正常熔點的瓊脂糖煮沸后取100μL鋪在微電泳槽內(nèi)，于4℃固化5 min。第2層膠是將100μL于37℃水浴中保溫的0.5%的低熔點的瓊脂糖與100μL的肝臟細胞懸液混勻后加到第1層膠上，4℃固化5 min。將載玻片浸入新鮮配制的4℃的裂解液，4℃避光裂解2 h。取出后用蒸餾水沖去多余的鹽分，將凝膠載玻片放入電泳槽中，加入4℃預冷的電泳液至蓋過膠面2～3 cm，4℃避光解旋20 min。調(diào)節(jié)至電壓25 V，電流300 mA，4℃避光電泳20 min。電泳結束后，將載玻片從電泳槽中取出浸入pH 7.0 Tris-HCl中和液中，中和15 min每5min換液1次。在凝膠上滴加EB（10 μg/L）100μL，2 min后用蒸餾水洗滌2次。將染色好的載玻片放在熒光顯微鏡的40倍鏡下拍照，采用casp彗星分析軟件對彗星圖像進行分析。選取彗星圖像的Olive尾矩、尾距、尾長和尾部DNA%進行分析。

2.3 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0軟件處理，實驗各個指標均用均數(shù) ±標準差表示 （x±s），以單因素方差分析（one-way ANOVA）進行多組間差異的比較，以Dunnett-t檢驗比較兩組間均數(shù)的差異。

3 結果

3.1 五子衍宗方對小鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響 模型組小鼠注射CTX以后有4只陸續(xù)死亡，其余體質(zhì)量明顯降低，肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)顯著低于正常對照組，五子衍宗方低、高劑量組均可增加小鼠的體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)。結果見表1。

表1 五子衍宗方對小鼠體質(zhì)量，肝臟質(zhì)量，肝臟指數(shù)的影響（x±s，n=6）

3.2 五子衍宗方對小鼠血清中ALT和AST變化影響 模型組中ALT、AST的活力較正常對照組顯著升高，五子衍宗方高劑量組可顯著降低ALT、AST的活力。結果見表2。

表2 五子衍宗方對小鼠ALT、AST活力的影響（x±s，n=6）

3.3 五子衍宗方對模型小鼠肝臟MDA、8-OHdG水平的影響 與正常對照組比較，模型組中MDA和8-OHdG的水平顯著升高。五子衍宗方組能夠顯著降低CTX引起的小鼠肝臟組織中MDA、8-OHdG水平。結果見表3。

3.4 五子衍宗方對小鼠肝臟DNA損傷的影響 模型組的小鼠肝臟細胞的彗星電泳圖像的Olive尾矩、尾距、尾長和尾部DNA%都有明顯增加，五子衍宗方低、高劑量組都能明顯降低小鼠肝臟細胞的彗星圖像的Olive尾矩、尾距、尾長和尾部DNA%。各組的單細胞凝膠圖像結果如圖1，五子衍宗方對CTX造成的小鼠肝臟細胞DNA損傷的指標的結果見表4。

表3 五子衍宗方對模型小鼠肝臟MDA、8-OHdG水平的影響（x±s，n=6）

圖1 肝臟細胞的彗星實驗圖像

表4 五子衍宗方對小鼠肝臟細胞中O live尾矩、尾距、尾長和尾部DNA%的影響（x±s，n=4）

4 討論

環(huán)鱗酰胺 （CTX）是常用的氮芥類的抗腫瘤藥物，常用來治療各種惡性腫瘤與非惡性腫瘤，也是臨床上常用的免疫抑制劑［6］。CTX代謝時會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，自由基能夠和體內(nèi)所有的生物分子如脂類，蛋白質(zhì)，碳水化合物和遺傳物質(zhì)DNA等發(fā)生結合，影響體內(nèi)生物酶的活性，從而影響DNA的正常合成和修復［7-8］。其活性代謝產(chǎn)物磷酰胺氮芥可引起DNA鏈內(nèi)和鏈間的交叉連接，丙烯醛也可以與DNA發(fā)生加成，同時丙烯醛也會干擾體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，引起氧化應激。研究表明，氧化應激是CTX導致正常細胞及組織DNA損傷的主要原因之一［9］。

肝臟是藥物代謝的重要器官，CTX經(jīng)肝臟的代謝產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物和自由基造成DNA損傷，因此肝臟既是CTX的代謝器官，也是CTX的毒性靶器官。藥物性肝損傷的臨床分析發(fā)現(xiàn)，74例藥物性肝損傷研究的患者有23例是腫瘤化療藥物引起的，占31.1% 居首位［10］。臨床研究發(fā)現(xiàn)CTX能夠引起血清中轉(zhuǎn)氨酶輕度升高，肝臟組織中GSH和SOD的活力降低，MDA的水平升高，肝臟組織形態(tài)發(fā)生變化，膽汁分泌發(fā)生異常［11］。Tripathi等研究發(fā)現(xiàn)CTX能夠降低肝臟中GSH、HO-1和NQO-1的水平，升高MDA的水平，升高P53和P38的蛋白表達，引起彗星實驗彗星數(shù)目和彗星尾距、尾長和尾部DNA%的增加，引起肝臟細胞氧化應激，DNA損傷和細胞的凋亡［12］。Ibrahim等發(fā)現(xiàn)CTX可以增加肝臟中8-OHdG和MDA的水平，增加肝臟細胞的DNA片段的比例，引起大鼠肝臟細胞的氧化應激及DNA損傷［13］。

8-OHdG是由活性氧引起的DNA中鳥嘌呤氧化損傷的產(chǎn)物，在體內(nèi)穩(wěn)定存在，是DNA的氧化損傷和突變的標志物，8-OHdG是最終代謝產(chǎn)物，能夠穩(wěn)定的存在，因此檢測肝臟組織的8-OHdG，可以檢測肝細胞DNA的氧化損傷［14-15］。單細胞凝膠電泳技術具有簡便快捷，靈敏度高、重復性好等優(yōu)點，目前常用的用來檢測真核細胞的單細胞的DNA鏈斷裂和修復的研究［16-17］。

本實驗結果表明，小鼠注射CTX后，小鼠的體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量以及肝臟指數(shù)顯著低于空白對照組，血清中ALT、AST的活力顯著降低，肝臟中MDA、8-OHdG的水平顯著增加，五子衍宗方組能顯著降低模型小鼠的MDA、8-OHdG的水平，說明五子衍宗方能夠減輕CTX引起的小鼠肝臟DNA的氧化損傷。通過單細胞凝膠電泳實驗我們發(fā)現(xiàn)五子衍宗方各組對模型組的Olive尾矩、尾距、尾長和尾部DNA%都有顯著提高，表明五子衍宗方能夠顯著減輕CTX造成的DNA損傷。因此，五子衍宗方能夠拮抗CTX引起的肝臟細胞的DNA損傷，其機制可能與五子衍宗方清除CTX代謝過程中產(chǎn)生的自由基，提高機體的抗氧化能力及增強損傷DNA修復的能力有關。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）05-1093-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.038

2014-03-15

國家自然科學基金項目 （81173375）

黃威峰（1989—），男，碩士生，主要從事中藥藥理方面的研究。E-mail：huangweifeng7120@sina.coM*通信作者：張長城（1973—），男，博士，教授，主要從事中藥藥理方面的研究。E-mail：greatwall@ctgu.edu.cn