張銀霞

摘要：為了建立秈稻KraDangNgah的再生體系，以其成熟胚作為試驗材料，研究不同種類植物激素及其濃度配比對誘導愈傷率、愈傷組織形態(tài)學特征、分化及植株再生的影響。結果表明：2，4-D可誘導愈傷組織產(chǎn)生，但愈傷組織誘導率極低；2，4-D和其他植物激素配合使用顯著提高了誘導率，在2mg/L2，4-D、1mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和0.5mg/LKN的條件下可獲得較高的愈傷組織誘導率，為56.3%。繼代培養(yǎng)基中添加激素濃度為誘導培養(yǎng)基中的一半可獲得較好的增生的胚性愈傷組織，形態(tài)學特征為淡黃色，比較致密、較硬、呈顆粒狀結構，沒有褐化出現(xiàn)，表現(xiàn)出很強的分化能力。再生培養(yǎng)中，MS培養(yǎng)基中添加0.5mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和2mg/LKN可獲得較高的分化率（達到75.5%）和再生率（33.3%），表明6-BA和Kn的配合使用顯著提高了分化率。

關鍵詞：秈稻；成熟胚；愈傷組織；再生植株

中圖分類號：S511.2+10.43文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0045-03

利用轉基因技術進行遺傳改良是改善秈稻品質、提高抵抗病蟲害能力、培育新品種的重要手段之一，而高效的再生體系是遺傳轉化成功的先決條件。近年來，研究者從幼穗、幼胚、花藥等部位誘導出愈傷組織和再生植株，愈傷組織誘導率高、質量好，被廣泛用于水稻的遺傳轉化、品種培育中[1]。但是，上述材料多受季節(jié)限制，取材不便，阻礙了水稻組織培養(yǎng)的進一步發(fā)展。從胚性愈傷中首先獲得再生植株的是在粳稻中[2]，在秈稻中由于受到許多因素的限制，比如品種具有倔強的對抗外來刺激的特性[3]和具有基因型專一性[4-5]，使從成熟胚中誘導胚性愈傷組織率和植株再生率很低，導致了秈稻遺傳轉化很困難。

秈稻KraDangNgah是泰國南部的當?shù)仄贩N，因營養(yǎng)價值很高且具有特殊香味而深受人們喜歡，但容易遭受病蟲害的危害。到目前為止沒有關于秈稻KraDangNgah再生體系的研究報道。本研究為了建立KraDangNgah再生體系，為遺傳轉化打好基礎，以成熟胚作為試驗材料，對其在不同激素及濃度配比條件下的出愈率、愈傷組織狀態(tài)及再生率進行研究，以期獲得狀態(tài)較好的愈傷組織，建立高效的再生體系。

1材料與方法

1.1試驗材料及種子滅菌

秈稻KraDangNgah（OryzasativaL.）種子由泰國宋卡王子大學自然資源學院提供。健康成熟的種子剝?nèi)ネ鈿ず蠼?0%乙醇中1min進行表面消毒，然后放入20%次氯酸鈉溶液中，滴入2～3滴Tween205min；最后在超凈工作臺中用無菌蒸餾水洗4～5次；再將種子放在無菌濾紙上吸干水分，備用。

1.2試驗方法

1.2.1愈傷組織的誘導

滅菌的種子接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，即MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0.75%瓊脂糖+1～4mg/L2，4-D，pH值調節(jié)到5.7。愈傷組織誘導在25～27℃、16h光照條件下培養(yǎng)30d后，調查誘導率及愈傷組織的狀態(tài)，愈傷組織誘導率=誘導出愈傷組織的種子數(shù)/接種的種子數(shù)×100%。然后將愈傷組織轉接到繼代培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)。

1.2.2愈傷組織誘導率的提高及優(yōu)化

為了提高愈傷組織誘導率和質量，將滅菌種子接種到經(jīng)“1.2.1”節(jié)試驗篩選出的較好的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，同時加入其他激素[（1）1mg/L2，4-D+1.5mg/LTDZ；（2）2mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA；（3）2mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKN；（4）2mg/L2，4-D+1.0mg/LIAA+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LKN；（5）4mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKN；（6）4mg/L2，4-D+1.0mg/LIAA+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LKN]和1g/L水解酪蛋白（CH），愈傷組織誘導的培養(yǎng)條件如“1.2.1”節(jié)所述。經(jīng)過30d培養(yǎng)后調查愈傷組織的大小、形態(tài)和誘導率，然后轉接到繼代培養(yǎng)基中。

1.2.3愈傷組織的繼代培養(yǎng)

為了選取質量好的胚性愈傷組織，將從成熟胚中誘導出的愈傷組織轉接到添加激素及濃度配比與愈傷組織誘導培養(yǎng)基相同或減半的MS培養(yǎng)基中，所有繼代培養(yǎng)基中添加1g/LCH。培養(yǎng)30d后記錄胚性愈傷組織的誘導率和褐化率，并在立體顯微鏡下鑒別胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織，然后轉接到再生培養(yǎng)基中。

1.2.4植株再生培養(yǎng)

選取好的胚性愈傷組織，轉接到添加不同細胞分裂素及濃度配比的MS培養(yǎng)基中，30d后調查再生情況。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)采用Execl和DPS統(tǒng)計軟件對愈傷組織誘導率、褐化率和分化率進行統(tǒng)計分析。

2結果與分析

2.12，4-D濃度對愈傷組織誘導的影響

滅菌的水稻種子接種到含1～4mg/L2，4-D的MS培養(yǎng)上培養(yǎng)7d后，種子開始膨脹，逐漸開始出現(xiàn)白色愈傷。30d后統(tǒng)計愈傷組織情況見表1。結果表明，培養(yǎng)基中不添加2，4-D時，沒有愈傷組織形成；當2，4-D的濃度從1mg/L增加到3mg/L時，誘導率從20.0%提高到33.9%，且愈傷組織的形態(tài)也隨之變化，從緊密黃褐色、緊密黃色到顆粒狀微黃色；當2，4-D的濃度增加到4mg/L時，誘導率又降低到31.2%，且形態(tài)變?yōu)辄S色松散狀，有的黏液化（圖1），說明高濃度的2，4-D抑制愈傷組織的形成。本試驗結果表明，單獨使用2，4-D誘導愈傷組織的誘導率很低，不適宜秈稻KraDongNgah愈傷組織的誘導。

2.2NAA、6-BA、KN和TDZ對愈傷組織誘導率的影響

滅菌的種子接種到添加不同種類激素和濃度配比的MS培養(yǎng)基上后，3～4d后就開始膨脹，7d后愈傷組織形成，這些愈傷組織隨著培養(yǎng)時間延長不斷增生，30d后調查愈傷組織誘導率和形態(tài)，結果（表2）表明，培養(yǎng)基中加NAA、6-BA、KN可以顯著提高誘導率，最高可以達到56.3%；此外還可以改進愈傷組織質量。從外形上看，這些愈傷組織量大、比較致密、較硬，呈顆粒狀結構較多，易于分化，在立體顯微鏡下觀察呈胚性愈傷組織（圖2、圖3）。而在只有2，4-D的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織比較松軟，有的黏液化，有的有水泡，一般不易于分化（圖1）。當在MS培養(yǎng)基中加入1mg/L2，4-D和1.5mg/LTDZ時，形成極少的愈傷組織（誘導率23.3%），其形態(tài)特征為緊密、硬且為白色，與其他激素濃度配比誘導愈傷組織較難增生。因此，2，4-D和NAA這2種細胞分裂素結合6-BA和KN2種生長素可以獲得最高的愈傷組織誘導率和最好質量的愈傷組織，比單獨使用2，4-D更能有效提高愈傷組織誘導率。

當MS培養(yǎng)基中加入2mg/L2，4-D和其他生長素、細胞分裂素時，形成大量的愈傷組織，形態(tài)學特征為致密、呈白色、帶有一些綠點，這些綠點最終發(fā)育成芽，經(jīng)過立體顯微鏡觀察為胚性愈傷組織（圖2）；當MS培養(yǎng)基中加入4mg/L2，4-D和其他生長素、細胞分裂素時，誘導的愈傷組織形態(tài)學特征為有些緊密、顏色從黃到白、比較小且有些褐化，只有少數(shù)的愈傷組織發(fā)展成胚性（圖3）。進一步證明，2mg/L2，4-D配合其他植物激素更適合愈傷組織的誘導。因此MS+2mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKN是最好的愈傷組織誘導培養(yǎng)基。

2.3不同激素濃度及配比對胚性愈傷組織的影響

繼代培養(yǎng)3周后，發(fā)現(xiàn)誘導培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基對愈傷組織的褐化和胚性愈傷組織的發(fā)育影響很大。結果（表4）表明，愈傷組織轉接到只添加2，4-D的MS培養(yǎng)基上褐化很嚴重，隨著2，4-D濃度增加，褐化率從100%減少到0，但其胚性愈傷的增殖很慢，表現(xiàn)出分化越來越困難。培養(yǎng)基中添加1mg/L或2mg/L2，4-D配合其他激素，褐化率比單獨使用2，4-D低，為0～27.2%。當培養(yǎng)基中添加1mg/L2，4-D、0.5mg/LNAA、0.25～0.50mg/L6-BA和0.25mg/LKN時，愈傷組織沒有褐化且出現(xiàn)更多綠芽（圖4），表明激素濃度減半更能促進胚性愈傷組織的發(fā)育和分化。說明NAA、6-BA

和KN能有效抑制愈傷組織的褐化，促進胚性愈傷發(fā)育，從而提高分化能力。因此，這種培養(yǎng)基最適宜于愈傷組織繼代和分化培養(yǎng)。

2.4不同配比的生長素和細胞分裂素對植株再生的影響

當胚性愈傷組織轉接到表5中激素配比的培養(yǎng)基后，其分化和再生情況如表5所示。結果發(fā)現(xiàn)，與其他激素相比，TDZ可以加快胚性愈傷組織的分化，縮短再生時間，但分化率和再生率較低（圖4），分別為29.6%、21.5%。NAA、6-BA和KN配合使用顯著提高了分化率，達45.8%～75.5%，說明不同配比的細胞分裂素和生長素對植株再生有顯著影響，當細胞分裂素高于生長素時，促進植株的再生。因此，0.5mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和2mg/LKN是最適宜愈傷組織分化和再生的激素配比。

3討論與結論

秈稻的組織培養(yǎng)因品種不同，培養(yǎng)條件差異較大[6]，愈傷組織的質量是影響秈稻再生頻率的關鍵因素，而2，4-D濃度對愈傷組織的數(shù)量及質量影響均較大。一般認為水稻愈傷組織誘導必須在培養(yǎng)基中添加2，4-D，以提高內(nèi)源ABA的水平，促進胚性能力表達[7]，但僅添加2，4-D往往出愈率較低，特別是秈稻。本研究結果也表明，在誘導培養(yǎng)基中僅使用2，4-D時，誘導率比較低，說明秈稻HomKraDong具有基因型專一性。相同的結果在2010年被Zuraida等報道[8]。

田文忠在提高秈稻愈傷組織誘導率的研究中指出，在誘導培養(yǎng)基或繼代培養(yǎng)基中加入KN和NAA能顯著改善愈傷組織的質量，提高分化率[9]。本研究證實了這一點，當MS培養(yǎng)基中加入2，4-D配合NAA、6-BA和KN能夠顯著提高誘導率和改善愈傷組織的質量，說明細胞分裂素KN和6-BA可以改善愈傷組織的質量并促其分化。因此本研究以2mg/L2，4-D、1.0mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和0.5mg/LKN為最適宜的愈傷組織誘導培養(yǎng)基。

Zuraida等對秈稻MR219的研究結果表明，細胞分裂素6-BA和生長素NAA均對秈稻的分化培養(yǎng)有極顯著的影響[8，10]。本研究在分化培養(yǎng)基中加入6-BA濃度在1.0～1.5mg/L時，能夠顯著提高分化率；NAA是一種生長素，濃度過低則生長緩慢，濃度過高則在基部產(chǎn)生大量的愈傷組織且分化率下降，當NAA和KN配合使用時可以改進愈傷組織質量。因此，0.5mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和2mg/LKN濃度配比適合秈稻幼苗分化。本研究初步建立起了秈稻Kra

DangNgah的再生體系，為遺傳轉化奠定了基礎。

參考文獻：

[1]郭曉麗.水稻愈傷組織培養(yǎng)研究[J].衡水學院學報，2009，11（1）：48-49，70.

[2]NishiT，YamadaY，TakahishiE.Theroleofauxinsindifferentiationofricetissuecultureinvitro[J].BotanicalMagazine，1973，86：183-188.

[3]KyozukaJ，OtooE，ShimamotoK.Plantregenerationfromprotoplastofindicarice：genotypedifferencesincultureresponse[J].TheoreticalAppliedGenetics，1988，76：887-890.

[4]RamanR，ChahalGS，DhaliwalHS.Screeningofgenotypeforcallusinductionandplantregenerationinrice[J].CropImprovement，1994，21：1-2.

[5]HieiY，KomariT.Agrobacterium-mediatedtransformationofriceusingimmatureembryosorcalliinducedfrommatureseed[J].NatureProtocols，2008，3（5）：824-834.

[6]閻麗娜，李霞，吳丹.不同類型水稻材料成熟胚組織培養(yǎng)力的比較[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2010，43（6）：1127-1135.

[7]張東向，張崇浩，李杰芬.玉米葉片胚性愈傷組織誘導及其與內(nèi)源IAA和ABA關系的初步研究[J].作物學報，2000，26（2）：195-199.

[8]ZuraidaAR，SuriR，WanZ.RegenerationofMalaysianindicarice（Oryzasativa）varietyMR232viaoptimizedsomaticembryogenesissystem[J].JournalofPhytology，2010，2（3）：30-38.

[9]田文忠.提高秈稻愈傷組織再生頻率的研究[J].遺傳學報，1994，21（3）：215-221，254.

[10]SyaifulBP，SitiNA，MaheranAA，et.al.SomaticembryogenesisfromscutellarembryoofOryzasativaL.var.MR219[J].PertanikaJournalofTropicalAgricultureScience，2009，32（2）：185-194.

滅菌的種子接種到添加不同種類激素和濃度配比的MS培養(yǎng)基上后，3～4d后就開始膨脹，7d后愈傷組織形成，這些愈傷組織隨著培養(yǎng)時間延長不斷增生，30d后調查愈傷組織誘導率和形態(tài)，結果（表2）表明，培養(yǎng)基中加NAA、6-BA、KN可以顯著提高誘導率，最高可以達到56.3%；此外還可以改進愈傷組織質量。從外形上看，這些愈傷組織量大、比較致密、較硬，呈顆粒狀結構較多，易于分化，在立體顯微鏡下觀察呈胚性愈傷組織（圖2、圖3）。而在只有2，4-D的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織比較松軟，有的黏液化，有的有水泡，一般不易于分化（圖1）。當在MS培養(yǎng)基中加入1mg/L2，4-D和1.5mg/LTDZ時，形成極少的愈傷組織（誘導率23.3%），其形態(tài)特征為緊密、硬且為白色，與其他激素濃度配比誘導愈傷組織較難增生。因此，2，4-D和NAA這2種細胞分裂素結合6-BA和KN2種生長素可以獲得最高的愈傷組織誘導率和最好質量的愈傷組織，比單獨使用2，4-D更能有效提高愈傷組織誘導率。

當MS培養(yǎng)基中加入2mg/L2，4-D和其他生長素、細胞分裂素時，形成大量的愈傷組織，形態(tài)學特征為致密、呈白色、帶有一些綠點，這些綠點最終發(fā)育成芽，經(jīng)過立體顯微鏡觀察為胚性愈傷組織（圖2）；當MS培養(yǎng)基中加入4mg/L2，4-D和其他生長素、細胞分裂素時，誘導的愈傷組織形態(tài)學特征為有些緊密、顏色從黃到白、比較小且有些褐化，只有少數(shù)的愈傷組織發(fā)展成胚性（圖3）。進一步證明，2mg/L2，4-D配合其他植物激素更適合愈傷組織的誘導。因此MS+2mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKN是最好的愈傷組織誘導培養(yǎng)基。

2.3不同激素濃度及配比對胚性愈傷組織的影響

繼代培養(yǎng)3周后，發(fā)現(xiàn)誘導培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基對愈傷組織的褐化和胚性愈傷組織的發(fā)育影響很大。結果（表4）表明，愈傷組織轉接到只添加2，4-D的MS培養(yǎng)基上褐化很嚴重，隨著2，4-D濃度增加，褐化率從100%減少到0，但其胚性愈傷的增殖很慢，表現(xiàn)出分化越來越困難。培養(yǎng)基中添加1mg/L或2mg/L2，4-D配合其他激素，褐化率比單獨使用2，4-D低，為0～27.2%。當培養(yǎng)基中添加1mg/L2，4-D、0.5mg/LNAA、0.25～0.50mg/L6-BA和0.25mg/LKN時，愈傷組織沒有褐化且出現(xiàn)更多綠芽（圖4），表明激素濃度減半更能促進胚性愈傷組織的發(fā)育和分化。說明NAA、6-BA

和KN能有效抑制愈傷組織的褐化，促進胚性愈傷發(fā)育，從而提高分化能力。因此，這種培養(yǎng)基最適宜于愈傷組織繼代和分化培養(yǎng)。

2.4不同配比的生長素和細胞分裂素對植株再生的影響

當胚性愈傷組織轉接到表5中激素配比的培養(yǎng)基后，其分化和再生情況如表5所示。結果發(fā)現(xiàn)，與其他激素相比，TDZ可以加快胚性愈傷組織的分化，縮短再生時間，但分化率和再生率較低（圖4），分別為29.6%、21.5%。NAA、6-BA和KN配合使用顯著提高了分化率，達45.8%～75.5%，說明不同配比的細胞分裂素和生長素對植株再生有顯著影響，當細胞分裂素高于生長素時，促進植株的再生。因此，0.5mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和2mg/LKN是最適宜愈傷組織分化和再生的激素配比。

3討論與結論

秈稻的組織培養(yǎng)因品種不同，培養(yǎng)條件差異較大[6]，愈傷組織的質量是影響秈稻再生頻率的關鍵因素，而2，4-D濃度對愈傷組織的數(shù)量及質量影響均較大。一般認為水稻愈傷組織誘導必須在培養(yǎng)基中添加2，4-D，以提高內(nèi)源ABA的水平，促進胚性能力表達[7]，但僅添加2，4-D往往出愈率較低，特別是秈稻。本研究結果也表明，在誘導培養(yǎng)基中僅使用2，4-D時，誘導率比較低，說明秈稻HomKraDong具有基因型專一性。相同的結果在2010年被Zuraida等報道[8]。

田文忠在提高秈稻愈傷組織誘導率的研究中指出，在誘導培養(yǎng)基或繼代培養(yǎng)基中加入KN和NAA能顯著改善愈傷組織的質量，提高分化率[9]。本研究證實了這一點，當MS培養(yǎng)基中加入2，4-D配合NAA、6-BA和KN能夠顯著提高誘導率和改善愈傷組織的質量，說明細胞分裂素KN和6-BA可以改善愈傷組織的質量并促其分化。因此本研究以2mg/L2，4-D、1.0mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和0.5mg/LKN為最適宜的愈傷組織誘導培養(yǎng)基。

Zuraida等對秈稻MR219的研究結果表明，細胞分裂素6-BA和生長素NAA均對秈稻的分化培養(yǎng)有極顯著的影響[8，10]。本研究在分化培養(yǎng)基中加入6-BA濃度在1.0～1.5mg/L時，能夠顯著提高分化率；NAA是一種生長素，濃度過低則生長緩慢，濃度過高則在基部產(chǎn)生大量的愈傷組織且分化率下降，當NAA和KN配合使用時可以改進愈傷組織質量。因此，0.5mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和2mg/LKN濃度配比適合秈稻幼苗分化。本研究初步建立起了秈稻Kra

DangNgah的再生體系，為遺傳轉化奠定了基礎。

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[8]ZuraidaAR，SuriR，WanZ.RegenerationofMalaysianindicarice（Oryzasativa）varietyMR232viaoptimizedsomaticembryogenesissystem[J].JournalofPhytology，2010，2（3）：30-38.

[9]田文忠.提高秈稻愈傷組織再生頻率的研究[J].遺傳學報，1994，21（3）：215-221，254.

[10]SyaifulBP，SitiNA，MaheranAA，et.al.SomaticembryogenesisfromscutellarembryoofOryzasativaL.var.MR219[J].PertanikaJournalofTropicalAgricultureScience，2009，32（2）：185-194.

滅菌的種子接種到添加不同種類激素和濃度配比的MS培養(yǎng)基上后，3～4d后就開始膨脹，7d后愈傷組織形成，這些愈傷組織隨著培養(yǎng)時間延長不斷增生，30d后調查愈傷組織誘導率和形態(tài)，結果（表2）表明，培養(yǎng)基中加NAA、6-BA、KN可以顯著提高誘導率，最高可以達到56.3%；此外還可以改進愈傷組織質量。從外形上看，這些愈傷組織量大、比較致密、較硬，呈顆粒狀結構較多，易于分化，在立體顯微鏡下觀察呈胚性愈傷組織（圖2、圖3）。而在只有2，4-D的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織比較松軟，有的黏液化，有的有水泡，一般不易于分化（圖1）。當在MS培養(yǎng)基中加入1mg/L2，4-D和1.5mg/LTDZ時，形成極少的愈傷組織（誘導率23.3%），其形態(tài)特征為緊密、硬且為白色，與其他激素濃度配比誘導愈傷組織較難增生。因此，2，4-D和NAA這2種細胞分裂素結合6-BA和KN2種生長素可以獲得最高的愈傷組織誘導率和最好質量的愈傷組織，比單獨使用2，4-D更能有效提高愈傷組織誘導率。

當MS培養(yǎng)基中加入2mg/L2，4-D和其他生長素、細胞分裂素時，形成大量的愈傷組織，形態(tài)學特征為致密、呈白色、帶有一些綠點，這些綠點最終發(fā)育成芽，經(jīng)過立體顯微鏡觀察為胚性愈傷組織（圖2）；當MS培養(yǎng)基中加入4mg/L2，4-D和其他生長素、細胞分裂素時，誘導的愈傷組織形態(tài)學特征為有些緊密、顏色從黃到白、比較小且有些褐化，只有少數(shù)的愈傷組織發(fā)展成胚性（圖3）。進一步證明，2mg/L2，4-D配合其他植物激素更適合愈傷組織的誘導。因此MS+2mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKN是最好的愈傷組織誘導培養(yǎng)基。

2.3不同激素濃度及配比對胚性愈傷組織的影響

繼代培養(yǎng)3周后，發(fā)現(xiàn)誘導培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基對愈傷組織的褐化和胚性愈傷組織的發(fā)育影響很大。結果（表4）表明，愈傷組織轉接到只添加2，4-D的MS培養(yǎng)基上褐化很嚴重，隨著2，4-D濃度增加，褐化率從100%減少到0，但其胚性愈傷的增殖很慢，表現(xiàn)出分化越來越困難。培養(yǎng)基中添加1mg/L或2mg/L2，4-D配合其他激素，褐化率比單獨使用2，4-D低，為0～27.2%。當培養(yǎng)基中添加1mg/L2，4-D、0.5mg/LNAA、0.25～0.50mg/L6-BA和0.25mg/LKN時，愈傷組織沒有褐化且出現(xiàn)更多綠芽（圖4），表明激素濃度減半更能促進胚性愈傷組織的發(fā)育和分化。說明NAA、6-BA

和KN能有效抑制愈傷組織的褐化，促進胚性愈傷發(fā)育，從而提高分化能力。因此，這種培養(yǎng)基最適宜于愈傷組織繼代和分化培養(yǎng)。

2.4不同配比的生長素和細胞分裂素對植株再生的影響

當胚性愈傷組織轉接到表5中激素配比的培養(yǎng)基后，其分化和再生情況如表5所示。結果發(fā)現(xiàn)，與其他激素相比，TDZ可以加快胚性愈傷組織的分化，縮短再生時間，但分化率和再生率較低（圖4），分別為29.6%、21.5%。NAA、6-BA和KN配合使用顯著提高了分化率，達45.8%～75.5%，說明不同配比的細胞分裂素和生長素對植株再生有顯著影響，當細胞分裂素高于生長素時，促進植株的再生。因此，0.5mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和2mg/LKN是最適宜愈傷組織分化和再生的激素配比。

3討論與結論

秈稻的組織培養(yǎng)因品種不同，培養(yǎng)條件差異較大[6]，愈傷組織的質量是影響秈稻再生頻率的關鍵因素，而2，4-D濃度對愈傷組織的數(shù)量及質量影響均較大。一般認為水稻愈傷組織誘導必須在培養(yǎng)基中添加2，4-D，以提高內(nèi)源ABA的水平，促進胚性能力表達[7]，但僅添加2，4-D往往出愈率較低，特別是秈稻。本研究結果也表明，在誘導培養(yǎng)基中僅使用2，4-D時，誘導率比較低，說明秈稻HomKraDong具有基因型專一性。相同的結果在2010年被Zuraida等報道[8]。

田文忠在提高秈稻愈傷組織誘導率的研究中指出，在誘導培養(yǎng)基或繼代培養(yǎng)基中加入KN和NAA能顯著改善愈傷組織的質量，提高分化率[9]。本研究證實了這一點，當MS培養(yǎng)基中加入2，4-D配合NAA、6-BA和KN能夠顯著提高誘導率和改善愈傷組織的質量，說明細胞分裂素KN和6-BA可以改善愈傷組織的質量并促其分化。因此本研究以2mg/L2，4-D、1.0mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和0.5mg/LKN為最適宜的愈傷組織誘導培養(yǎng)基。

Zuraida等對秈稻MR219的研究結果表明，細胞分裂素6-BA和生長素NAA均對秈稻的分化培養(yǎng)有極顯著的影響[8，10]。本研究在分化培養(yǎng)基中加入6-BA濃度在1.0～1.5mg/L時，能夠顯著提高分化率；NAA是一種生長素，濃度過低則生長緩慢，濃度過高則在基部產(chǎn)生大量的愈傷組織且分化率下降，當NAA和KN配合使用時可以改進愈傷組織質量。因此，0.5mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和2mg/LKN濃度配比適合秈稻幼苗分化。本研究初步建立起了秈稻Kra

DangNgah的再生體系，為遺傳轉化奠定了基礎。

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