譚 燕 吳曉鳳 翁 閆 紅

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第一研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042;2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所麻醉科，重慶 400042）

由創(chuàng)傷及感染引起的全身性炎癥反應(yīng)和膿毒癥是臨床中導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一,至今尚無(wú)有效的治療手段。目前其防治方法的研究焦點(diǎn)在于尋找治療膿毒癥和炎癥反應(yīng)后免疫抑制的有效方法。LPS對(duì)巨噬細(xì)胞的過(guò)度刺激是導(dǎo)致膿毒癥最常見(jiàn)的原因，LPS與巨噬細(xì)胞膜上Toll樣受體4（TLR4）的結(jié)合是啟動(dòng)巨噬細(xì)胞活化的關(guān)鍵因素[1-4]。然而TLR4與其他Toll樣受體識(shí)別配體的方式不一樣，它不能直接識(shí)別配體，需要與髓樣分化蛋白2（MD-2）形成異二聚體，借助MD-2結(jié)構(gòu)中的疏水口袋與LPS相互作用[5]。LPS激活TLR4信號(hào)通路的過(guò)程中形成了LPS/TLR4/MD-2復(fù)合體，因此通過(guò)拮抗MD-2與LPS的結(jié)合可從新的角度制備抗細(xì)菌感染免疫制劑[6]。在無(wú)LPS存在的時(shí)候，TLR4與MD-2蛋白相互連接；但在LPS存在的情況下，TLR4與MD-2形成更牢固的二聚體形式[7]。研究提示，阻斷LPS與MD-2的結(jié)合，比阻斷LPS與TLR4/MD-2復(fù)合物的結(jié)合要容易近100倍。這表明MD-2分子中與LPS結(jié)合的結(jié)構(gòu)域?qū)φ麄€(gè)復(fù)合體的功能乃至之后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)強(qiáng)度都有決定性的作用[8-10]，并且，MD-2與TLR4的胞外區(qū)相偶聯(lián)，是一個(gè)只含有160個(gè)氨基酸的分泌蛋白，具有分子質(zhì)量小，且為可分泌型等特點(diǎn)，對(duì)MD-2的調(diào)控更易操作。另外有研究發(fā)現(xiàn)，以MD-2作為靶點(diǎn)，一種查爾酮的衍生物（JSH）可與MD-2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合LPS，從而抑制LPS介導(dǎo)的TLR4活化[6]。如果可以開(kāi)發(fā)一種可以干擾LPS與MD-2結(jié)合的藥物，可能是控制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)更為有效、事半功倍的治療策略[6,11]。

本研究室前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功篩選出2條針對(duì)MD-2的拮抗多肽—T 6和T 11，可部分阻斷MD-2與LPS的結(jié)合，但效率不高[12]。研究證實(shí)，根據(jù)靶標(biāo)蛋白在噬菌體展示肽庫(kù)中篩選出陽(yáng)性序列，再依據(jù)陽(yáng)性序列構(gòu)建突變肽庫(kù)，進(jìn)一步篩選靶標(biāo)蛋白，篩選后得到的陽(yáng)性克隆效果更佳[13-15]。本研究旨在通過(guò)對(duì)原始多肽（MD-2拮抗多肽）進(jìn)行突變多肽庫(kù)的構(gòu)建、篩選和功能鑒定，最終獲得具有更高抗炎活性的多肽。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 MD2蛋白（1787-MD/CF，R&D System公司），佛波醇乙酯（PMA，P1585,Sigma公司)，回收試劑盒（Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System，Promega公司），限制性?xún)?nèi)切酶EagⅠ 和KpnⅠ（Thermo Scientific公司 ），Klenow Fragment（Thermo Scientific公司），T 4連接酶(New England Biolabs公司)和引物（蘇州金唯智生物科技有限公司），DNA ladder DL2000 和 λ –hind III digest DNA Marker（TAKARA公司）,M 13-HRP抗體(GE Healthcare公司),TMB顯色液（碧云天生物技術(shù)有限公司），小鼠TNF-αELISA試劑盒和IL-6 ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），內(nèi)毒素（LPS，O111B4, Sigma公司），巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株（ATCC），人單核細(xì)胞白細(xì)胞THP-1細(xì)胞株（第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所第四研究室饋贈(zèng)），C57小鼠（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）?；驍U(kuò)增儀（My Gene TM Series Peltier Thermal cycler，杭州朗基科技儀器有限公司），電泳儀（EPS100，上海天能科技有限公司），電轉(zhuǎn)儀（BIO-RAD， GENE PULSE II），酶標(biāo)儀（ELX800，Bioteck）。

1.2 噬菌體突變肽庫(kù)的構(gòu)建

1.2.1 基礎(chǔ)引物以及突變引物

1.2.1.1 基礎(chǔ)引物：①96Etp: 5’-CATGCCCGG GT ACCT T T CT AT T CT CA CT CT-3’(用于構(gòu)建和菌落PCR鑒定)；②T 6:5’-TTT CGGCCGAACCT CCACCAT GAT T AT CCG GCACCGT CT T AGAGT GAGAAT AGAAAG GT-3’； ③ T 11:5’-TTTCGGCCGAACCT CCACCATTCCTAGTCAACGGAGAATCAG AGTGAGAATAGAAAGGT-3’;④ 96g IIIsp:5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’ ( 用于測(cè)序和菌落PCR 鑒定)。

1.2.1.2 突變引物的合成策略 T 6和T 11結(jié)合多肽是針對(duì)人MD2蛋白（huMD2）模擬短肽（FSKGKYKCV）篩選得到，該序列位于hu MD2蛋白的β折疊鏈一端及相鄰的無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域，基本呈線性分布。為得到更高結(jié)合能力的多肽，分別以T 6和T 11序列為基礎(chǔ)，每次隨機(jī)突變相鄰的3～5個(gè)氨基酸，保留剩余的氨基酸，并同時(shí)在肽鏈的氨基端和羧基端引入額外的兩個(gè)氨基酸，以期望獲得更大的結(jié)合面。

引物中引入的氨基酸突變采用NNK策略，這種策略包含32個(gè)密碼子，20種氨基酸全包含，不含終止子。對(duì)應(yīng)的，因?yàn)檫@些密碼子在反向引物上都是MNN（M表示隨機(jī)突變里最常用的密碼子，此處堿基A/C出現(xiàn)的概率均等，N代表此處堿基A/T/C/G出現(xiàn)的概率均等）。共合成了10條突變引物，T 6和T 11突變引物各5條，分開(kāi)進(jìn)行DNA操作，最后每種等量合在一起，用于建庫(kù)。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行合成。

1.2.2 目的基因片段的合成 分別直接退火96Etp及等摩爾的T 6和T 11突變引物（T 6am、T 11am，各約3 mol），50 μl體系,直接從96 ℃退火，直到最后保溫于35 ℃；再用DNA聚合酶I大片段（klenow酶）補(bǔ)平兩端得到目的基因片段（100 μl體系，37 ℃ 30 min，75 ℃ 10 min）。

1.2.3 用KpnI/Eag I對(duì)目的基因和載體M13KE進(jìn)行雙酶切，后再進(jìn)行膠回收。150 μl目的基因酶切體系：補(bǔ)平的目的片段100 μl，10倍濃度的酶切緩沖液 15 μl，KpnI酶 3 μl，EagI酶 3 μl，水 29 μl；反應(yīng)條件：37 ℃ 4 h，65 ℃ 5 min。100 μl載體酶切體系：M13KE載體60 μl，10倍濃度的酶切緩沖液 10 μl，KpnI酶 5 μl，Eag I酶 5 μl，水 20 μl。反應(yīng)條件：37 ℃ 過(guò)夜，65 ℃ 5 min。

1.2.4 連接以及純化 將M 13KE噬菌體與目的基因片段的酶切產(chǎn)物按照1:5的比例用T 4連接酶進(jìn)行連接，16 ℃ 過(guò)夜。連接產(chǎn)物用PCR-clean up試劑盒進(jìn)行清潔，用100 μl 水洗脫，備用。

1.2.5 制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)ER2738并電轉(zhuǎn) 將連接產(chǎn)物約100 μl加入到制備好的電轉(zhuǎn)感受態(tài)大腸桿菌ER2738中，輕輕混勻，每電轉(zhuǎn)杯70 μl分裝，靜置10 min，開(kāi)始電擊，立即加入400 μl SOC培養(yǎng)基混勻，吸出于37 ℃水浴中；提前取10μl（記為10-2）進(jìn)行梯度稀釋并涂板，依次稀釋為10-3、10-4、10-5、10-6倍， 37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜；計(jì)數(shù)。

1.3 噬菌體肽庫(kù)的篩選 用無(wú)菌 TBS 緩沖液稀釋抗原h(huán)uMD2 10 μg 至1 ml，4 ℃過(guò)夜包被免疫 管（Nunc，Max iSorp）。 用 5 ml 1% BSA封閉液封閉免疫管，37 ℃保溫2 h。棄封閉液，用 TBST（T: 0.1% Tw een-20）洗滌免疫管3次。加入噬菌體樣品（含0.5%的BSA 和0.1%的Tw een-20）3 ml，37 ℃保溫2 h，每30 min混勻1次。用 TBST（T: 0.1% Tween-20）洗滌免疫管6 次，洗去未結(jié)合的phage。用 Glycine-HCl（p H 2.1）洗脫結(jié)合的phage，每次1 ml，每次5 min，再加入Tris中和液160 μl。重復(fù)洗脫1次，然后合并。從洗脫的phage 樣品中取10 μl用于梯度稀釋和計(jì)數(shù)，感染對(duì)數(shù)中期的大腸桿菌ER2738后，涂LB/IPTG/Xgal 的Top-Agar 平板，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜，第2天計(jì)數(shù)。其余的2.3 ml phage 洗脫樣品用于感染50 ml 對(duì)數(shù)早期的ER2738，37 ℃劇烈震蕩培養(yǎng)4.5 h，收集phage上清，沉淀濃縮后，用作下一輪篩選。重復(fù)2次，并將抗原h(huán)u MD2依次降低為5 μg、1 μg。 共篩選3輪。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞和THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。THP-1經(jīng)培養(yǎng)和計(jì)數(shù)后，加入PMA100 ng/ml共同培養(yǎng)24 h（THP-1細(xì)胞需經(jīng)PMA刺激后才能分化為單核/巨噬樣細(xì)胞），調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為1×105個(gè)/孔。RAW264.7直接調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為1×105個(gè) /孔。

1.5 噬菌體克隆結(jié)合活性測(cè)定 取2個(gè)96孔板，分別包被MD2蛋白（實(shí)驗(yàn)組）和BSA蛋白（對(duì)照組）,4 ℃過(guò)夜，再?gòu)氖删w突變肽庫(kù)中篩選出的克隆中挑選94個(gè)噬菌體克?。ㄆ渲邪ˋ 8、F5、H2、H5、H9),連同T 6、T 11展示多肽噬菌體,共96個(gè)克隆，將克隆擴(kuò)增后，純化出噬菌體顆粒，每種噬菌體均分為2份，分別與MD2蛋白和BSA蛋白結(jié)合,37 ℃孵育2 h，PBST洗去未結(jié)合噬菌體后，再向包被板中加入二抗M13-HRP,37 ℃孵育1.5 h，PBST洗去未結(jié)合的二抗，加入TMB顯色液避光顯色15 min，最后加入終止液，酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm處的吸光度(A450值)。

1.6 噬菌體克隆對(duì)RAW264.7細(xì)胞以及PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞的細(xì)胞因子生成抑制作用的觀察 實(shí)驗(yàn)分8組：對(duì)照組(RAW264.7/誘導(dǎo)后的THP-1) ，LPS組(RAW264.7/誘導(dǎo)后的THP-1+LPS) ，M13組(RAW264.7/誘導(dǎo)后的THP-1 +LPS +對(duì)照組噬菌體M13) , A8、F5、H2、H5、H9組（RAW264.7/誘 導(dǎo) 后 的 THP-1 +LPS + 噬菌體克隆A8、F5、H2、H5、H9)。各組LPS的終濃度均為1 μg/ml。處理方法：先用噬菌體克隆對(duì)細(xì)胞預(yù)孵育2 h，再用LPS刺激6 h后收集上清液, - 20 ℃冰箱保存待測(cè)。按ELISA試劑盒說(shuō)明測(cè)定TNF-α的表達(dá)。從中選出比T 6、T 11抗炎效果更好的克隆進(jìn)行多肽合成。

1.7 優(yōu)化多肽A8、H2和原始多肽T 6、T 11對(duì)RAW264.7細(xì)胞和PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞的細(xì)胞因子生成抑制作用的比較 優(yōu)化多肽A8和H2合成后，均為200 μg/ml。實(shí)驗(yàn)分組分為6組。對(duì)照組(RAW264.7/誘導(dǎo)后的THP-1) ，LPS組(RAW264.7/誘 導(dǎo) 后 的 THP-1+LPS) ，A8組(RAW264.7/誘導(dǎo)后的THP-1 +LPS +A8多肽), H2組（RAW264.7/誘導(dǎo)后的THP-1 + LPS +H2多肽), T 6組(RAW264.7/誘導(dǎo)后的THP-1+LPS +T 6多肽), T 11組(RAW264.7/誘導(dǎo)后的THP-1 +LPS +T 11多肽)。處理方法：先用多肽分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)孵育2 h，再用LPS(終濃度均為1 μg/ml)刺激6 h，收集上清液, - 20 ℃冰箱保存待測(cè)。按ELISA 試劑盒說(shuō)明測(cè)定TNF-α和IL-6的表達(dá)。

1.8 優(yōu)化多肽A 8、H2和原始多肽T 6、T 11對(duì)小鼠細(xì)胞因子生成的影響 6～8周齡雄性C57小鼠，體重20～22 g，隨機(jī)分為6組（n=5）：空白對(duì)照組每只小鼠腹腔注射1 ml 生理鹽水；陰性對(duì)照組每只小鼠腹腔注射 1 ml LPS（400 μg /ml）鹽溶液；4 個(gè)多肽組（T 6、T 11、A8、H2組）每只小鼠分別腹腔注射T 6、T 11、A8或H2多肽200 μg/ml，并于1 h后腹腔注射LPS鹽溶液1 m（l400 μg /ml）。注射LPS（陰性對(duì)照組和4個(gè)多肽組）或生理鹽水（空白對(duì)照組）后6 h脫頸處死，取眼血,血清貯存于-20 ℃，待測(cè)TNF-α和IL-6含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件包處理各組數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以± s表示，采用單因素方差分析和組間兩兩比較LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體突變肽庫(kù)的構(gòu)建

2.1.1 M13KE與目的片段酶切結(jié)果 突變引物共合成10條，T 6、T 11突變的各5條，分別標(biāo)記為 T 6am1、T 6am2、T 6am3、T 6am4、T 6am5和 T 11am1、T 11am2、T 11am3、T 11am4、T 11am5。分別直接退火96Etp與等摩爾的引物T 6am、T 11am后，獲得需要的目的片段。再用KpnI/Eag I對(duì)目的基因和載體M13KE進(jìn)行雙酶切,目的基因酶切后成功得到70 bp左右的目的片段，載體M13KE酶切后成功得到7 200 bp左右的片段。見(jiàn)圖1。

圖1 M 13KE與目的片段酶切結(jié)果

2.1.2 突變肽庫(kù)滴度測(cè)定結(jié)果 匯總?cè)颗囵B(yǎng)基（約38 ml），于37 ℃ 、150 r/min搖床中1 h孵育，涂平板(直徑15 cm)19個(gè)，提前取10 μl（記為10-2）進(jìn)行梯度稀釋 (10-3、10-4、10-5、10-6）并涂板，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜計(jì)數(shù)，10-6長(zhǎng)了100個(gè)藍(lán)斑克隆，計(jì)算庫(kù)容約為100×106×38=3.8×109。

2.2 噬菌體突變肽庫(kù)的篩選

2.2.1 肽庫(kù)篩選 進(jìn)行3輪篩選,每一輪結(jié)束后均記錄噬菌體投入量及回收量,計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，富集率隨著篩選輪數(shù)的增加而增加，說(shuō)明與MD-2蛋白具有結(jié)合活性的特異性噬菌體克隆得到有效富集。見(jiàn)表1。

表1 用MD-2蛋白進(jìn)行3輪親和篩選中噬菌體回收率的改變

2.2.2 噬菌體克隆結(jié)合活性測(cè)定 以噬菌體展示多肽為實(shí)驗(yàn)組，BSA為對(duì)照組，鑒定噬菌體展示多肽與MD-2的結(jié)合力。3 輪淘選后,挑選94個(gè)克隆,ELISA 鑒定噬菌體展示多肽與MD-2的結(jié)合力,結(jié)果顯示5 個(gè)噬菌體克隆所展示的多肽與MD-2全長(zhǎng)蛋白有較高的結(jié)合力，A450值高于0.5，且均高于原始展示多肽T 6、T 11的克隆。見(jiàn)圖2。

圖2 篩選出的陽(yáng)性結(jié)合多肽與T6、T11原始多肽和MD2親和力的比較

2.2.3 陽(yáng)性克隆DNA序列測(cè)定 從結(jié)合活性A450高于BSA對(duì)照組的5個(gè)噬菌體克隆中，提取單鏈DNA進(jìn)行測(cè)序，并推導(dǎo)DNA序列編碼的氨基酸，即為噬菌體表達(dá)的多肽序列。5個(gè)克隆呈現(xiàn)出5種不同編碼的氨基酸序列。

測(cè) 序 結(jié) 果：A8：5’-AGGCGGCGCAAC ACT AGGACCACT CT T AT ACGG-3’；F5：5’-AGTAAAAGTAGTATTCCAACCAGGAT GCTGATG-3’；H2：5’-AAGCGCAAGATG AGGATGAATACGAGGCGCCTG-3’；MDH 5：5’-CGCAAACCTAAGCTTAGCCGTAG GCATATTCGA-3’；MD-H9：5’-CATACA CGCATGACGAGGAGCCGGCTTCACACA-3’

編碼蛋白序列：A8：RRRNTRTTLIR； F5：SKSSIPT RMLM； H 2：KRKMRMNT RRL；H5：RKPKLSRRHIR； H9：HTRMTRSRLHT

2.3 抗炎活性的測(cè)定

2.3.1 初篩5個(gè)克隆對(duì)RAW264.7以及THP-1細(xì)胞因子生成的抑制效果 以RAW264.7和THP-1為靶細(xì)胞，對(duì)初篩出的5個(gè)克隆進(jìn)行抑制炎癥效果的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，檢測(cè)其TNF-α的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，A8、H2有較好的抑炎作用，而F5、H5、H9均無(wú)明顯抑制炎癥的效果。見(jiàn)圖3。

圖3 初篩克隆對(duì)RAW264.7（A）以及THP-1（B）細(xì)胞因子生成的影響

2.3.2 優(yōu)化多肽A8、H2與原始多肽T 6、T 11對(duì)RAW264.7以及THP-1細(xì)胞因子生成抑制效果的比較 將初步篩選出的優(yōu)化多肽A8、H2以及原始多肽T 6、T 11序列送往上海銳勁生物技術(shù)有限公司進(jìn)行多肽合成。以RAW264.7以及THP-1細(xì)胞模型為靶細(xì)胞，多肽濃度采用200 μg/ml。結(jié)果，A8、H2對(duì)兩種細(xì)胞的細(xì)胞因子抑制效果比原始多肽更好，提高了近1倍。見(jiàn)圖4。

2.3.3 動(dòng)物模型中優(yōu)化多肽A8、H2與原始多肽T 6、T 11抗炎活性的比較 C57小鼠實(shí)驗(yàn)中，優(yōu)化多肽A8、H2中只有H2有明顯強(qiáng)于原始多肽T 6、T 11的抑炎效果。見(jiàn)圖5。

3 討 論

目前創(chuàng)建與靶分子親和力高的抗原或其他蛋白的方法主要包括：通過(guò)大量免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的變異體篩選；通過(guò)構(gòu)建的肽庫(kù)進(jìn)行篩選；利用計(jì)算機(jī)，通過(guò)找出游離氨基酸殘基與靶分子表面的交互作用區(qū)域以及改變空間構(gòu)象設(shè)計(jì)等[16-18]。鑒于多肽的特點(diǎn)及可行性，本研究采用對(duì)原始多肽（MD-2拮抗多肽）進(jìn)行突變多肽庫(kù)的構(gòu)建、篩選和功能鑒定，最終獲得具有更高抗炎活性的多肽。

圖4 優(yōu)化多肽A8、H2與原始多肽T6、T11對(duì) RAW264.7和THP-1細(xì)胞因子生成的影響

圖5 動(dòng)物模型中優(yōu)化多肽A8、H2與原始多肽T6、T11抗炎活性的比較

本研究以本實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的拮抗多肽T 6、T 11為基礎(chǔ)，采用NNK策略成功構(gòu)建突變肽庫(kù)，對(duì)突變肽庫(kù)進(jìn)行3輪親和篩選（以MD-2全長(zhǎng)蛋白為靶蛋白并且MD-2全長(zhǎng)蛋白包被量逐輪減少）,以得到高親和力的噬菌體克隆。我們隨機(jī)挑取94個(gè)克隆,通過(guò)細(xì)胞因子生成抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),其中5個(gè)克隆與MD2全長(zhǎng)蛋白的結(jié)合高于原始T 6、T 11克隆，其中2個(gè)可顯著減輕LPS刺激巨噬細(xì)胞合成和釋放炎癥介質(zhì)，這2個(gè)噬菌體克隆所展示的融合肽可以模擬MD2的抗炎多肽。將這2個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，并人工合成。最后通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)動(dòng)物血清中炎性介質(zhì)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)最終只有1條優(yōu)化多肽具有明顯強(qiáng)于原始多肽的抑炎效果。

本研究經(jīng)過(guò)構(gòu)建突變肽庫(kù)對(duì)原始多肽T 6、T 11進(jìn)行優(yōu)化，成功得到一條在細(xì)胞水平以及動(dòng)物水平上抑制炎癥效果均強(qiáng)于原始多肽的MD2拮抗多肽H2。該優(yōu)化多肽較原始多肽T 6、T 11雖在細(xì)胞抗炎效果上有明顯提高，但在動(dòng)物模型上抗炎效果并非特別理想?？紤]原因可能為，優(yōu)化后的多肽仍為小分子肽，其在體內(nèi)代謝較快，如果想進(jìn)一步提升靶向MD2特異性多肽的效果，多肽作為潛在藥物，其給藥方式以及藥物的穩(wěn)定性值得進(jìn)一步研究。但同時(shí)，膿毒癥是一個(gè)全身的綜合反應(yīng)，包含了多種信號(hào)通路參與其中，目前過(guò)分強(qiáng)調(diào)了炎癥反應(yīng)在膿毒性損害中的作用,忽視了嚴(yán)重創(chuàng)傷本身對(duì)抗感染免疫防御功能的削弱。在臨床創(chuàng)傷患者治療中更多注重的是如何通過(guò)各種措施進(jìn)行相應(yīng)的抗炎抗感染策略,而對(duì)機(jī)體免疫防御功能的調(diào)理重視不夠。如果能把握好抑制炎癥的度，將能更好指導(dǎo)臨床膿毒癥患者的用藥治療。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建以T 6、T 11多肽為基礎(chǔ)的突變肽庫(kù)，進(jìn)行二次篩選的方法可成功獲得與MD2全長(zhǎng)蛋白親和力更高的多肽，該多肽對(duì)細(xì)胞以及動(dòng)物均有比原始多肽T 6、T 11更佳的抗炎效果，這為MD2抗炎藥物的進(jìn)一步優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

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