徐曉雪， 李曉鵬， 鐘 旭， 韓偉健， 郭 娜， 林曉彤， 許 枬

（遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連116600）

手參奶制工藝

徐曉雪， 李曉鵬， 鐘 旭， 韓偉健， 郭 娜， 林曉彤， 許 枬*

（遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連116600）

目的依據(jù)炮制工藝參數(shù)優(yōu)化蒙藥手參的奶制工藝。方法采用浸出物測定法測定手參奶制品的浸出物；用HPLC法測定手參制品中的天麻素、4-羥基苯甲醇、militarine、loroglossin的含有量；通過水迷宮實驗考察手參對衰老小鼠學習記憶能力的影響；采用ELISA法檢測小鼠腦組織中丙二醛 （MDA）水平和超氧化物歧化酶 （SOD）活力。結(jié)果綜合各因素的影響，手參奶制的最佳炮制工藝為加入手參質(zhì)量30%的鮮牛奶悶潤12 h后，于120℃烘制法6 min。結(jié)論優(yōu)化手參奶制工藝穩(wěn)定，重復性好，與生品比手參奶制品的抗衰老和抗氧化活性明顯增強。

手參；炮制；高效液相色譜；m ilitarine；浸出物

KEY WORDS：Gymnadenia conpsea R.Br.；milk processing；HPLC；militarine；ethanol-soluble extraction

民族藥炮制具有鮮明的民族特色和優(yōu)勢，但隨著科技的發(fā)展，民族藥炮制工藝的不規(guī)范、不統(tǒng)一，甚至誤傳誤用的現(xiàn)象逐漸暴露出來，嚴重影響了其繼承和創(chuàng)新［1］。蒙藥手參Gymnadenia conopsea（L.）R.Br.，為蘭科手參屬多年生草本植物手參的干燥根莖，具有增力生精、溫腎暖腎、大補元氣、安神增智等功效［2-3］，用于治療腎虛、失眠、記憶力減退等病癥［4］，由于其良好的抗衰老和抗疲勞作用而備受關(guān)注［5］。手參在蒙醫(yī)臨床上常以奶制法炮制［6-7］，以增強其補益作用。目前關(guān)于手參奶制工藝研究較少，實際工業(yè)生產(chǎn)中工藝粗放，多憑經(jīng)驗操作，缺乏嚴格工藝參數(shù)控制，難以保證飲片質(zhì)量穩(wěn)定性和臨床有效性。手參的醇浸出物和天麻素、4-羥基苯甲醇、militarine、loroglossin單體均具有抗氧化和抗衰老活性［8］，且4種成分在手參中含有量較高。因此，本實驗以醇浸出物、4種活性成分含有量、抗衰老活性等多種與質(zhì)量密切相關(guān)的參數(shù)為指標，系統(tǒng)地考察各炮制工藝參數(shù)對手參奶制品質(zhì)量的影響，優(yōu)化輔料用量 （鮮奶用量）、干燥溫度及時間等工藝參數(shù)，為手參奶制工藝的規(guī)范化生產(chǎn)提供科學數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1100型高效液相色譜儀 （美國安捷倫公司，包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、檢測器、工作站）；Sartorius CP225D十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Morris水迷宮MS-1（成都儀器廠）；天麻素、4-羥基苯甲醇、militarine和loroglossin均為本實驗室自制（純度分別為98.3%，97.4%，97.9%，98.7%）；甲醇（色譜純，美國天地試劑公司）；水為高純水 （自制），其余試劑均為分析純 （國藥集團化學試劑有限公司）。超氧化物歧化酶 （SOD）試劑盒 （批號20140313GT）；丙二醛 （MDA）試劑盒 （批號20140313FV）；NIH小鼠購于大連醫(yī)科大學，合格證號SCXK（遼）2008-0002；手參飲片購自安國藥材市場，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學王冰教授鑒定為手參Gymnadenia conpsea R.Br.的干燥根莖。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 奶制手參的制備 參照 《中華本草》 （蒙藥卷）［9］，取手參生品飲片，加入不同體積分數(shù)的牛奶，拌勻，室溫浸潤12 h，按正交實驗設(shè)計，將潤透后的手參在設(shè)定的溫度下采用烘制法進行干燥，得不同工藝的手參奶制品。

2.2 醇浸出物測定 照 《中國藥典》的醇浸出物測定法 （熱浸法）［10］，測定手參奶制品的醇浸出物得率。

2.3 活性成分測定

2.3.1 色譜條件考察 Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇 （A）-0.1%磷酸水溶液 （B），梯度洗脫 （0～10 min，10% ～30%A；10～15 min，30% ～45%A；15～25 min，45% ～85%A）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長220 nm，柱溫25℃。被測成分的色譜峰分離度好，基線平穩(wěn)，見圖1。

圖1 手參供試品（A）和對照品（B）HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram s of sam p le（A）and reference substances（B）

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取天麻素、4-羥基苯甲醇、militarine、loroglossin對照品適量，加甲醇制成每1 m L含天麻素0.359 1 mg、4-羥基苯甲醇0.403 8mg、militarine0.657 2mg、loroglossin 1.411 mg的對照品貯備液。精密量取各對照品貯備液5 mL，置25 m L量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取手參生品 （批號130428）及9份奶制手參粉末1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理 （功率250 W，頻率45 kHz）30 min，濾過，用75%甲醇20 mL分次洗滌容器和藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 線性范圍考察 分別精密吸取上述混合對照品溶液2、4、8、12、16、20μL注入液相色譜儀，測定峰面積。以進樣量 （μg）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標 （Y），繪制標準曲線。天麻素回歸方程為Y=2.128 4×103X+0.965 4，r= 0.999 5，線性范圍0.144～1.44μg；4-羥基苯甲醇回歸方程為Y=1.591 6×103X-26.504，r= 0.999 7，線性范圍為0.162～1.62μg；militarine回歸方程為Y=1.4219×103X-6.119 1，r= 0.999 4，線性范圍0.263～2.63μg；loroglossin回歸方程為Y=1.2672×103X-21.131，r=0.999 8，線性范圍0.564～5.64μg。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液20 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。計算混合對照品中天麻素、4-羥基苯甲醇、militarine、loroglossin峰面積的RSD分別為1.2%、0.8%、1.0%、1.3%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 按 “2.3.3”項下方法制備手參生品飲片 （批號130428）的供試品溶液，分別于樣品制備后的0、2、4、8、12、24、48 h進樣分析，測定峰面積。結(jié)果天麻素、4-羥基苯甲醇、militarine、loroglossin峰面積的RSD分別為1.5%、1.4%、1.3%、1.6%。說明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復性試驗 取手參生品飲片 （批號130428）1 g，共6份，按 “2.3.3”項下的方法分別制備供試品溶液，照 “2.3.1”項的色譜條件進樣分析，測定天麻素、4-羥基苯甲醇、militarine、loroglossin峰面積的RSD分別為1.5%、1.3%、0.9%、1.6%。結(jié)果表明，本方法重復性較好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知天麻素、4-羥基苯甲醇、militarine、loroglossin含有量分別為0.360 mg/g、0.404 mg/g、0.657 mg/g、1.411 mg/g的手參生品飲片 （批號130428）粉末0.5 g，共6份，分別精密加入上述含天麻素0.071 8 mg/mL、4-羥基苯甲醇0.080 8 mg/mL、militarine 0.131 4 mg/mL、loroglossin 0.282 2 mg/mL的混合對照品溶液2.5 mL，置于具塞錐形瓶中，按 “2.3.3”項下方法制備供試品溶液，照 “2.3.1”項下色譜條件進行測定，進樣量為20μL，結(jié)果天麻素、4-羥基苯甲醇、militarine、loroglossin峰面積的RSD分別為1.2%、1.3%、1.1%、1.5%，見表1。

表1 天麻素、4-羥基苯甲醇、m ilitarine和loroglossin的加樣回收率（n=6）Tab.1 Results of recovery tests for four constituents（n= 6）

2.4 正交試驗

2.4.1 因素水平設(shè)計 依據(jù)預試驗的結(jié)果，以牛奶用量、干燥溫度、干燥時間為考察因素，每個因素設(shè)定三個水平，按照正交試驗設(shè)計L9（34）進行試驗。以浸出物和活性成分天麻素、4-羥基苯甲醇、militarine和loroglossin的量為考察指標，因素水平見表2。

表2 奶制手參炮制工藝正交試驗因素水平Tab.2 Factors and levels in orthogonal design

2.4.2 綜合加權(quán)評分法評價 將手參奶制品的醇浸出物 （m1）、天麻素 （m2）、4-羥基苯甲醇（m3）、militarine（m4）、loroglossin（m5）的量進行綜合評分［10］，即以1個綜合指標（overalldesir-ability，OD）進行統(tǒng)計分析，考察炮制工藝參數(shù)對手參制品質(zhì)量的總體影響。因醇浸出物和天麻素、4-羥基苯甲醇、militarine、loroglossin單體均具有抗氧化和抗衰老活性［6］，因此權(quán)重值各為20%。綜合評分OD=0.20×m1/mmax1×100+0.20×m2/ mmax2×100+0.20×m3/mmax3×100+0.20×m4/ mmax4×100+0.20×m5/mmax5，正交試驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 正交試驗結(jié)果Tab.3 Results of orthogonal test

表4 正交試驗方差分析Tab.4 Results of analysis of variance

由表4可見，干燥溫度與干燥時間對手參制品質(zhì)量影響顯著，鮮牛奶用量對手參制品質(zhì)量影響較小。考慮節(jié)省的原則，最佳工藝確定為 A1B2C2，即手參生品飲片用體積分數(shù)30%的牛奶悶潤12 h后，取出，于120℃加熱干燥6 min。

2.5 抗衰老試驗［11-12］取雌性NIH小鼠 （普通級，6周齡，體質(zhì)量20～22 g）120只適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為12組 （每組10只）：空白組、衰老模型組、手參生品組、手參不同工藝炮制品組（共9組，見表3）。給藥組小鼠灌胃給予相應受試藥物8 g/kg，衰老模型組和空白組小鼠灌胃等量的生理鹽水溶液，連續(xù)給藥30 d。用水迷宮實驗法測定各組小鼠游出迷宮所用的時間 （潛伏期）以及全身進入盲端的次數(shù) （錯誤次數(shù)）。并測定小鼠腦組織中丙二醛 （MDA）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活力。結(jié)果見表5。

由表5可見，兩個顯著影響手參奶制品質(zhì)量的工藝參數(shù) （干燥溫度和時間）中的B2（120℃）和C2（6 min）系列工藝的手參奶制品分別較B1（80℃）、B3（160℃）和C1（2 min）、C3（10 min）系列工藝的制品抗衰老作用有顯著提高（P＜0.05），且B2C2（120℃，6 min）工藝制品的抗衰老作用最佳。由此提示，優(yōu)化的炮制工藝確實能提高手參奶制品的補益作用，工藝具有合理性。

表5 手參生制品對衰老小鼠各項指標的影響 （，n= 10）Tab.5 Results of anti-aging parameters of the processed products of Gymnadenia conopsea（，n=10）

表5 手參生制品對衰老小鼠各項指標的影響 （，n= 10）Tab.5 Results of anti-aging parameters of the processed products of Gymnadenia conopsea（，n=10）

注：與空白對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與生品組比較，*P＜0.05

編號 組別 潛伏期/ s 錯誤次數(shù) MDA/（nmol/mg·Pr）SOD/（U/mg·Pr）34.5±2.0 21.4±7.1 5.0±0.5 0.30±0.03 36.5±2.6 2 模型 120.5±13.3#15.4±0.9# 0.38±0.02# 31.7±1.5#3 生品 85.6±7.2△11.8±1.1 0.36±0.03△ 33.5±2.0 4 A1B1C1 77.6±9.7△10.5±1.4 0.36±0.02△ 33.8±1.7 5 A1B2C2 20.5±6.5*△2.3±0.6*△0.30±0.01*△36.8±2.5△6 A1B3C3 62.7±8.4*△8.4±1.1 0.35±0.01△ 34.3±1.8 7 A2B1C2 46.2±7.4*△6.1±1.3 0.33±0.02*△35.0±1.9 8 A2B2C3 34.5±6.8*△2.9±0.7*△0.32±0.01*△36.3±2.1△9 A2B3C1 45.6±7.9*△5.9±1.5 0.33±0.02*△34.9±1.7 10 A3B1C3 81.3±6.9△11.0±1.8 0.36±0.02△ 33.7±1.6 11 A3B2C1 35.0±7.0*△3.1±0.8*△0.32±0.01*△36.5±0.7△12 A3B3C2 53.1±8.2*△7.1±1.8 0.34±0.01*△1 空白

2.6 工藝驗證試驗 以最佳工藝平行制備3批手參奶制品，照 “2.3.3”項和 “2.3.1”項的方法制備供試品溶液，并分別測定其醇浸出物和天麻素、4-羥基苯甲醇、militarine和loroglossin的量（見表6）。結(jié)果表明，各被測指標成分的RSD分別為1.6%、2.0%、1.7%、1.9%、1.6%，說明優(yōu)化出的炮制工藝穩(wěn)定可行。

表6 炮制工藝驗證Tab.6 Results of process validation

3 討論

奶制是蒙藥的特色炮制方法，主要用于補益藥物的炮制，目的是增加補益作用。但相關(guān)工藝研究鮮有報道，難以實現(xiàn)此炮制方法在實踐中的規(guī)范化生產(chǎn)。為此，本實驗采用多項與質(zhì)量有關(guān)的指標探討炮制工藝參數(shù)對手參奶制品質(zhì)量的影響，并優(yōu)化出手參奶制的最佳工藝及參數(shù)，為工業(yè)生產(chǎn)規(guī)范化提供了科學數(shù)據(jù)。本實驗所制定的炮制工藝經(jīng)證實穩(wěn)定可行，且藥效學實驗表明，優(yōu)化工藝制品的抗衰老和抗氧化活性強于生品 （P＜0.05），說明所建立的工藝能夠提高制品的補益作用。

現(xiàn)代藥理學研究表明，具有補益氣血、安神增智功效的中草藥多具有良好的抗衰老作用。石建功等［5］對手參的活性研究發(fā)現(xiàn)，其醇提取物可明顯改善長期腦供血不足，能夠顯著增強衰老小鼠腦內(nèi)與清除自由基有關(guān)的SOD的活力，抑制衰老引起的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平的增加，且能改善癡呆模型動物的學習記憶能力障礙。因安神增智作用與抗衰老作用有明確的相關(guān)性，故本實驗選擇抗衰老活性評價炮制工藝對其制品質(zhì)量的影響。

奶制法的工藝流程由悶潤工藝和干燥工藝組成，即先用鮮牛奶悶潤藥材飲片至透，再進行加熱干燥。經(jīng)單因素預試驗確定，手參飲片在加入足量牛奶后12 h即可完全潤透，故手參奶制工藝考察時未單獨設(shè)計悶潤工藝的考察，而是將悶潤時間固定為12 h，綜合考察悶潤工藝 （牛奶用量）和干燥工藝 （干燥溫度和時間），優(yōu)選最佳炮制工藝及參數(shù)。實驗結(jié)果表明，炮制溫度和時間對手參炮制品的質(zhì)量影響較大，當炮制溫度達到160℃時，醇浸出物、活性成分的量均顯著降低，提示手參中的成分在高溫條件下不穩(wěn)定，故炮制過程中應嚴格控制加熱干燥溫度。

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M ilk processing of Gymnadenia conpsea R.Br.

XU Xiao-xue， LIXiao-peng， ZHONG Xu， HANWei-jian， GUO Na， LIN Xiao-tong， XU Nan*

（College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

文獻標志碼：A

1001-1528（2015）04-0831-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.031

2014-06-09

國家科技支撐計劃課題 （2012BAI28B00）

徐曉雪（1990—），女，碩士生，從事天然藥物的活性成分研究。Tel：（0411）87586014，E-mail：xiaoxue29@icloud.com

*通信作者：許 枬 （1968—），女，教授，從事天然藥物的活性成分研究。Tel：（0411）87586014，E-mail：xudanbs@163.com