顏貴明， 戴 敏， 宣自華， 李月月

（新安醫(yī)學(xué)省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230012）

［科研報(bào)道］

丹皮酚對急性肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

顏貴明， 戴 敏*， 宣自華， 李月月

（新安醫(yī)學(xué)省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230012）

目的在乙醇誘導(dǎo)的體外大鼠肝細(xì)胞急性損傷導(dǎo)致谷草轉(zhuǎn)氨酶 （AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （ALT）、丙二醛 （MDA）水平升高的模型基礎(chǔ)上，探討丹皮酚對大鼠肝細(xì)胞的直接保護(hù)作用。方法分別將肝細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)傳代，利用50mmol/L乙醇處理12 h建立急性大鼠體外肝細(xì)胞急性損傷模型，用含不同濃度丹皮酚（250、125、62.5、31.25、15.625μmol/L）的培養(yǎng)液與急性損傷肝細(xì)胞共孵育不同時(shí)間 （0.5、1、3、6、12、24 h），MTT比色法測定丹皮酚對肝細(xì)胞損傷的預(yù)防作用，賴氏法測定上清液ALT和AST的水平，硫代巴比妥法測定上清液MDA水平。結(jié)果丹皮酚（125μmol/L，12 h）可抑制乙醇對肝細(xì)胞的損傷，并明顯降低乙醇致急性損傷肝細(xì)胞的ALT、AST釋放量和MDA水平。結(jié)論丹皮酚體外給藥抑制乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞的ALT、AST和MDA釋放，提示其具有對肝細(xì)胞損傷的直接保護(hù)作用。

乙醇；酒精性脂肪肝；丹皮酚（Pae）；ALT；AST；MDA；保護(hù)作用

酒精濫用與酒精依賴已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)一個(gè)重要的社會(huì)和醫(yī)學(xué)問題。過量酒精的攝入嚴(yán)重影響肝臟的功能，鑒于此探索對酒精性肝細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用的中藥顯得非常必要。任何新藥的研究都需要選擇合適的模型，現(xiàn)有報(bào)道的酒精性肝細(xì)胞損傷模型，慢性居多，并且大多數(shù)以酒精代謝指標(biāo)、體內(nèi)抗氧化指標(biāo)、酶組織化學(xué)或病理學(xué)檢查作為衡量依據(jù)，但關(guān)于酒精對體外肝細(xì)胞膜急性影響的研究很少。建立在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的實(shí)用性受一定的限制。

大量酒精進(jìn)人機(jī)體后，在乙醇脫氫酶的作用下大量脫氫氧化，使三梭酸循環(huán)過程障礙和抑制脂肪酸氧化而影響脂質(zhì)代謝。乙醇可致磷酸甘油增多導(dǎo)致甘油三酯合成增加，促進(jìn)脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積，同時(shí)乙醇能激活氧分子，氧自由基的產(chǎn)生導(dǎo)致肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化以及體內(nèi)還原型谷胱甘肽的大量耗竭［1］。一般認(rèn)為，氧化損傷、脂質(zhì)過氧化損傷及免疫功能損傷等在乙醇導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷機(jī)制中起主要作用，并且由乙醛所致的肝細(xì)胞氧化損傷更為突出，表現(xiàn)為GSH的耗竭及MDA增加［2］。

通常認(rèn)為，酒精性肝細(xì)胞損傷實(shí)質(zhì)上是由乙醇的氧化毒性所致，主要表現(xiàn)為乙醇能損害肝細(xì)胞利用氧的能力，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的清道夫分子還原型谷胱甘肽耗竭，促進(jìn)自由基介導(dǎo)的毒性作用和脂質(zhì)過氧化作用［3-4］。但是，由于人類與動(dòng)物的乙醇代謝酶以及乙醇的毒性反應(yīng)種屬間差異很大，從而建立在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的實(shí)用性受限制。由此，本研究以L-02細(xì)胞株為研究對象，排除其他因素，研究酒精對肝細(xì)胞的直接作用，以培養(yǎng)L-02細(xì)胞株上清液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶 （AST）釋放量，肝細(xì)胞中丙二醛 （MDA）作為細(xì)胞氧化損傷的指標(biāo)，進(jìn)行酒精誘導(dǎo)體外急性肝細(xì)胞氧化損傷的研究。MDA作為脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可造成細(xì)胞能量代謝障礙，使細(xì)胞功能受損。肝細(xì)胞損傷的程度和體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度均可通過MDA水平直接或間接反映出來［5-9］。

丹皮酚（paeonal，Pae）是芍藥科植物牡丹Paeonia Suffruticoas Andr.的干燥根皮及蘿摩科植物徐長卿Cynanchum paniculatum（Bge.）Kitag.的干燥根及根莖中的有效成分之一［10］?，F(xiàn)代研究表明，丹皮酚具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、降脂、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化（AS）等廣泛的藥理作用［11］。本研究首次研究丹皮酚體外用藥對酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞細(xì)胞膜損傷、過氧化反應(yīng)等過程是否有直接抑制作用，從而進(jìn)一步驗(yàn)證丹皮酚對酒精性脂肪肝細(xì)胞保護(hù)作用的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物 丹皮酚，宣城百草工貿(mào)有限公司提供，純度大于99.8%，批號(hào)：100216。

1.2 細(xì)胞株 BRL大鼠正常肝細(xì)胞株L-02（中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞研究所）。

1.3 主要試劑 乙醇 （純度 99%，批號(hào) 20100912）；DMEM培養(yǎng)基 （Gibco公司，批號(hào)20081123）；胰蛋白酶（Amersco公司，批號(hào)20090128）；胎牛血清（美國Gibco公司，批號(hào)12100-038）；二甲基亞砜DMSO（Sigma公司，批號(hào)20080324）；臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測試劑盒 （北京化學(xué)試劑廠，批號(hào)20081118）；鏈霉素針劑 （規(guī)格為每支100萬單位，華北制藥股份有限公司，批號(hào)20101218）；青霉素針劑 （規(guī)格為每支80萬單位，華北制藥股份有限公司，批號(hào)20101213）；MTT（Amersco進(jìn)口分裝，武漢生命技術(shù)有限公司）。

1.4 主要溶液配制

1.4.1 PBS緩沖液的配制（pH 7.2） 精密稱取Na2HPO4· 12H2O 3.49 g、KCl 0.2 g、NaCl 8.0 g、KH2PO40.2 g，溶于1 000mL ddH2O中。經(jīng)121℃高壓滅菌20min，4℃保存。

1.4.2 胎牛血清滅活 室溫解凍胎牛血清，置于56℃水浴滅活30min，20mL分裝，-20℃保存。

1.4.3 培養(yǎng)液的配制 DMEM培養(yǎng)液加1.8 g/L碳酸氫鈉，10萬IU/L青霉素，10萬U/L硫酸慶大霉素，加入20%的Defined FBS。

1.4.4 細(xì)胞消化液的配制 含0.2%胰蛋白酶，配制方法：稱取400mg胰蛋白酶，加入到200mL無鈣、鎂的PBS緩沖液中，振搖至全部溶解后濾過除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 MTT貯存液制備 MTT粉50 mg，溶于10 mL PBS中，使終質(zhì)量濃度為5 mg/mL，0.22μm微孔濾膜過濾。棕色瓶，4℃保存，半月內(nèi)備用。

1.4.6 丹皮酚藥液的配制 精密稱取丹皮酚1.66 mg，加入20μL二甲基亞砜（DMSO）使其溶解，吸取20 mL DMEM培養(yǎng)基充分混勻，配成濃度為500μmol/L的溶液，再依次將藥液等比稀釋成250、125、62.5、31.25、15.625 μmol/L，置于4℃冰箱保存，1周內(nèi)備用。

1.5 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；培養(yǎng)/干燥箱 （上海一恒科技有限公司）；LD4-8型低速離心機(jī) （北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；艾科浦超純水系統(tǒng) （重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）；滅菌鍋（日本Tomy KOQYO公司）；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板（美國Corning公司）；EIX50自動(dòng)洗板機(jī)（美國Bio-Tek公司）；-20℃冰箱（榮事達(dá)電器有限公司）；-80℃冰箱 （日本Sanyo公司）；電子精密天平 （上海精密科學(xué)儀器有限公司）；水浴恒溫箱 （常州國華電器有限公司）；快速混勻器 （常州國華電器有限公司）；ELX800uv酶標(biāo)儀（Bio-TEK公司）；潔凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；CK2型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；液氮罐 （成都金鳳液氮容器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 肝細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 培養(yǎng)基是DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 U/mL），將肝細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、相對飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。肝細(xì)胞為單純貼壁生長，隔日換液，待細(xì)胞長至80%～90%的密度，用胰酶消化傳代，每2天傳代1次。

2.2 肝細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 無水酒精清潔蓋玻片和計(jì)數(shù)板，晾干備用。肝細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后再用新鮮DMEM培養(yǎng)基分散成單個(gè)細(xì)胞懸液。用吸管適度吹打細(xì)胞懸液，吸取少量細(xì)胞懸液，在計(jì)數(shù)板蓋玻片的一端加微量細(xì)胞懸液，加樣時(shí)需要注意，不要溢出蓋玻片和兩邊的玻璃槽內(nèi)，顯微鏡下，用10倍物鏡觀察計(jì)數(shù)板四大方格中的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞壓中線時(shí)，只計(jì)左側(cè)和上方者，右側(cè)和下方者不計(jì)。

2.3 酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型的建立 將處于對數(shù)生長期的L-02細(xì)胞調(diào)整密度為4×104個(gè)/m L培養(yǎng)于96孔板中，培養(yǎng)24 h更換培養(yǎng)液，分別設(shè)立正常對照組，25、50、75、100 mmol/L 4個(gè)酒精誘導(dǎo)組，肝細(xì)胞懸液與不同濃度的酒精繼續(xù)培養(yǎng)0.5、1、3、6、12、24 h。用MTT比色法測定細(xì)胞活力，臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)觀察，選擇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的酒精最佳濃度。

2.4 丹皮酚對肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

2.4.1 丹皮酚肝損傷保護(hù)作用量效時(shí)效關(guān)系 在乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型的基礎(chǔ)上，將細(xì)胞吹打成密度為4×104個(gè)/mL培養(yǎng)于96孔板中，貼壁生長24 h。分別加入不同濃度 （250、125、62.5、31.25、15.625μmol/L）的丹皮酚，用MTT比色法測定細(xì)胞活力，臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)觀察作為處理脂肪肝細(xì)胞的最佳濃度。結(jié)果顯示125μmol/L濃度作用12 h最佳。

2.4.2 ALT、AST和MDA的測定 將對數(shù)增殖期的L-02細(xì)胞調(diào)整成密度為4×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100μL，接種24 h后，鏡下觀察確認(rèn)細(xì)胞貼壁良好。試驗(yàn)設(shè)正常對照組、繼續(xù)誘導(dǎo)組、丹皮酚治療組（62.5、125、250μmol/L），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。各組給予50 mmol/L酒精處理12 h，Pae治療組加入不同濃度丹皮酚（62.5、125、250μmol/L）的培養(yǎng)液，正常對照組加不含酒精的培養(yǎng)液，繼續(xù)誘導(dǎo)組繼續(xù)給予50 mmol/L酒精培養(yǎng)液，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)12 h。收集培養(yǎng)上清液，4℃1 000 r/min離心5 min，分別取100μL上清液測ALT、AST、MDA水平，按試劑盒說明書操作。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計(jì)處理方法 采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異具有顯著性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 酒精誘導(dǎo)急性肝細(xì)胞損傷 本研究顯示采用濃度分別為25、50、75、100 mol/L的酒精處理肝細(xì)胞0.5、1、6、12、24 h。結(jié)果顯示 （見表1），酒精對肝細(xì)胞的損傷作用有劑量依賴性，濃度25 mmol/L的酒精作用于肝細(xì)胞影響不明顯，光鏡下未見肝細(xì)胞形態(tài)異常，但隨著酒精濃度的增大，其存活率則逐步降低，其中，50 mmol/L乙醇處理12 h可使肝細(xì)胞損傷明顯。顯微鏡下觀察肝細(xì)胞明顯損傷，部分細(xì)胞固縮變圓，體積變小，少量細(xì)胞貼壁不牢，呈半貼壁狀態(tài)；12 h可觀察到多數(shù)細(xì)胞固縮變圓，較多細(xì)胞脫落，漂浮于培養(yǎng)液中，亦有少數(shù)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡或體積增大，細(xì)胞腫脹、破裂呈壞死狀 （見圖1）；24 h可觀察到多數(shù)細(xì)胞脫落，漂浮于培養(yǎng)液中，部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡或體積增大，細(xì)胞腫脹、破裂死亡。吸取100μL細(xì)胞懸液到EP管內(nèi)，加入100μL臺(tái)盼藍(lán)染色液，輕輕吹打混勻，3～5 min后，吸取適量加有臺(tái)盼藍(lán)染色液的細(xì)胞懸液，滴加血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。于大方格內(nèi)計(jì)數(shù)未被藍(lán)染的細(xì)胞總數(shù)（藍(lán)染細(xì)胞為死亡細(xì)胞）即為活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率。隨著作用時(shí)間的延長，酒精濃度的增大，肝細(xì)胞存活率也隨之降低。25 mmol/L組對酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞生長影響不大，因此不選為作用濃度。故選用50 mmol/L乙醇處理12 h作為誘導(dǎo)急性酒精性肝損傷模型的方法。

表1 不同濃度的乙醇對肝細(xì)胞存活率的影響 （）

表1 不同濃度的乙醇對肝細(xì)胞存活率的影響 （）

注：與空白組比較，★★P＜0.01，★P＜0.05

乙醇濃度/（mmol·L-1）0.5 h光密度值 存活率/% 1 h光密度值 存活率/% 3 h光密度值 存活率/%空白組0.431±0.013 100 0.432±0.018 100 0.411±0.024 100 25 0.405±0.016 99.5 0.398±0.024 99.5 0.402±0.026 98.5 50 0.397±0.018 98.0 0.377±0.027 98.0 0.363±0.021 95.0 75 0.399±0.029★ 89.5 0.372±0.034★ 89.5 0.366±0.028★ 89.5 100 0.373±0.022★ 90.0 0.366±0.021★ 90.0 0.363±0.029★ 90.0乙醇濃度/（mmol·L-1）6 h光密度值 存活率/% 12 h光密度值 存活率/% 6 h光密度值 存活率/%空白組38.6 0.401±0.023 100 0.394±0.019 100 0.388±0.031 100 25 0.395±0.036 98.5 0.335±0.025★ 85.8 0.371±0.039★ 95.6 50 0.371±0.025 94.0 0.322±0.032★★ 83.0 0.278±0.034★ 71.1 75 0.359±0.026★ 89.5 0.242±0.027★★ 61.4 0.226±0.031★★ 58.2 100 0.343±0.027★★ 86.0 0.178±0.038★★ 45.2 0.146±0.031★★

圖1 倒置顯微鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 （×100）

3.2 丹皮酚保護(hù)肝細(xì)胞損傷的量效時(shí)效關(guān)系 用含不同濃度丹皮酚（250、125、62.5、31.25、15.625μmol/L）的培養(yǎng)液孵育不同時(shí)間 （0.5、1、3、6、12、24 h），加入含酒精（50 mmol/L）的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育12 h后，MTT比色法測定丹皮酚對肝細(xì)胞損傷的預(yù)防作用 （細(xì)胞存活率檢測方法同前）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹皮酚 （125μmol/L）即可明顯抑制酒精對肝細(xì)胞的損傷 （P＜0.01）。12 h時(shí)丹皮酚 （125 μmol/L）抑制作用更明顯 （P＜0.001），見表2。

表2 MTT法檢測丹皮酚對肝細(xì)胞損傷的預(yù)防作用（）

表2 MTT法檢測丹皮酚對肝細(xì)胞損傷的預(yù)防作用（）

注：與空白組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，★★★P＜0.001，★★P＜0.01，★P＜0.05

組別 濃度/（μmol·L-1）0.5 h光密度值 存活率/% 1 h光密度值 存活率/% 3 h光密度值 存活率/% - 0.590±0.025 100 0.588±0.027 100 0.585±0.030 100模型組 - 0.402±0.021▲▲ 67 0.391±0.023▲▲ 67.1 0.390±0.026▲▲ 67.0丹皮酚 15.625 0.417±0.029 66 0.397±0.025 68.0 0.392±0.030 67.2 31.25 0.421±0.039 71 0.423±0.031 72.3 0.407±0.028 70.1 62.5 0.435±0.033★ 76 0.440±0.029★ 76.1 0.434±0.036★ 76.1 125 0.503±0.037★★ 84 0.490±0.032★★ 84.3 0.498±0.027★★ 84.3 250 0.431±0.027 69 0.499±0.019 68.5 0.421±0.028 68.5組別 濃度/（μmol·L-1）空白組6 h光密度值 存活率/% 12 h光密度值 存活率/% 24 h光密度值 存活率/% - 0.585±0.035 100 0.573±0.031 100 0.552±0.042 100模型組 - 0.391±0.027▲▲ 66.8 0.401±0.022▲▲ 70 0.385±0.034▲▲ 68.7丹皮酚 15.625 0.387±0.031 66.3 0.414±0.034 72.3 0.403±0.025 73 31.25 0.417±0.041 73.3 0.485±0.030★★ 84.6 0.436±0.029 80.7 62.5 0.445±0.043★ 76.1 0.517±0.041★★ 89.4 0.485±0.030★ 85.2 125 0.493±0.047★★ 84.3 0.557±0.034★★★ 97.2 0.535±0.031★★ 91.9 250 0.401±0.022 68.5 0.461±0.025 79.7 0.465±0.025★空白組80.6

3.3 丹皮酚對酒精致急性損傷的肝細(xì)胞釋放ALT、AST和MDA影響 收集正常對照組、繼續(xù)誘導(dǎo)組、Pae治療組（62.5、125、250μmol/L）培養(yǎng)上清液檢測ALT、AST、MDA水平。結(jié)果表明，50 mmol/L酒精作用于肝細(xì)胞后，明顯損傷肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞內(nèi)ALT、AST釋放量明顯升高，MDA水平升高，加重細(xì)胞炎性反應(yīng)。而丹皮酚可明顯抑制ALT、AST釋放量的升高，降低MDA水平，提示Pae保護(hù)肝細(xì)胞與穩(wěn)定肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和抗過氧化等作用有關(guān)，見表3。

表3 Pae對急性酒精肝細(xì)胞損傷ALT、AST和M DA的影響 （n=6，）

表3 Pae對急性酒精肝細(xì)胞損傷ALT、AST和M DA的影響 （n=6，）

注：與空白組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，★★P＜0.01，★P＜0.05

組別 濃度/（μmol·L-1）ALT/（U·mgprot-1）AST/（U·mgprot-1）MDA/（mmol·L-1）空白組 —30.18±3.45 29.25±1.21 36.34±2.19模型組 — 50.29±2.32▲▲ 57.31±2.11▲▲ 67.40±3.41▲▲丹皮酚 250 38.45±3.21★ 38.28±1.75★ 41.35±3.19★125 32.45±3.31★★ 30.29±2.27★★ 38.76±3.31★★62.5 41.77±4.35 41.40±2.750★ 45.54±4.56★

4 討論

酒精進(jìn)入機(jī)體后，在肝細(xì)胞乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶、細(xì)胞色素P450等作用下產(chǎn)生氧自由基，而氧自由基不僅能直接使肝細(xì)胞損傷，而且可以通過促進(jìn)肝細(xì)胞對脂質(zhì)過氧化的敏感性，致使細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞，酶系丟失，細(xì)胞死亡［12-17］。同時(shí)酒精本身和它的氧化物乙醛對肝細(xì)胞有直接毒性作用［18-19］。ALT、AST是肝細(xì)胞內(nèi)主要酶系，在肝細(xì)胞膜受損時(shí)，胞內(nèi)ALT、AST釋放增加，因此培養(yǎng)液中ALT、AST活性檢測是判斷肝細(xì)胞膜損傷最直接的標(biāo)志［20-22］，肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物MDA，它的含量則反應(yīng)膜脂質(zhì)過氧化程度的強(qiáng)弱及肝細(xì)胞的受損程度［23］。肝細(xì)胞的存活情況利用MTT比色法檢測，直接反應(yīng)肝細(xì)胞的損傷程度。

MTT比色法是一種具有簡、便、靈、驗(yàn)用于檢測細(xì)胞存活和生長的方法，原理是存活的細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT在細(xì)胞色素作用下還原為不溶于水的藍(lán)紫色（或藍(lán)色）的甲臜 （Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。因此可以客觀、準(zhǔn)確地反映活細(xì)胞數(shù)及其代謝強(qiáng)度［24-25］。利用臺(tái)盼藍(lán)染色鏡下觀察肝細(xì)胞的存活度：正常的活肝細(xì)胞，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，完全能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，使之不能夠進(jìn)入胞內(nèi)；而喪失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。一般認(rèn)為細(xì)胞膜喪失完整性，就可認(rèn)為細(xì)胞死亡。因此，利用臺(tái)盼藍(lán)染色可以非常簡便、快速地區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)是組織和細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的死細(xì)胞鑒定染色方法之一。通過以上兩種方法更能客觀地評價(jià)細(xì)胞的存活情況。

為了充分證實(shí)丹皮酚對酒精性肝細(xì)胞損傷的抑制作用，本實(shí)驗(yàn)選用L-02細(xì)胞株，以50 mmol/L乙醇處理12 h制備急性肝細(xì)胞損傷模型。通過MTT比色法、臺(tái)盼藍(lán)染色法和細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察中我們發(fā)現(xiàn)丹皮酚在62.5～250μmol/L劑量范圍內(nèi)能夠抑制肝細(xì)胞的損傷，特別是125μmol/L劑量丹皮酚時(shí)，且作用12 h時(shí)，抑制肝細(xì)胞損傷的效應(yīng)最為明顯。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：雖然低濃度酒精對肝細(xì)胞損傷不明顯，但是隨著酒精濃度的加大，肝細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA、ALT、AST生化檢測結(jié)果逐漸升高，肝細(xì)胞存活率則逐漸下降，表明過量飲酒可引起肝細(xì)胞氧化損傷。與繼續(xù)誘導(dǎo)組相比，丹皮酚組ALT、AST的泄露量明顯降低，且MDA量降低兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），說明丹皮酚可以減輕酒精對肝細(xì)胞膜的損害，從而改善肝細(xì)胞功能。與正常對照組相比，繼續(xù)誘導(dǎo)組各項(xiàng)指標(biāo)明顯升高，提示肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重。

在細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的細(xì)胞損傷現(xiàn)象，與動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，并且相對動(dòng)物實(shí)驗(yàn)而言，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的影響因素少，可行性高。故我們可以認(rèn)為，細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)可以作為動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充，兩者的有機(jī)結(jié)合，將為進(jìn)一步研究酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制以及臨床治療藥物的篩選提供有效的途徑。

5 小結(jié)

丹皮酚體外給藥抑制酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞的ALT、AST和MDA釋放，提示其具有對肝細(xì)胞損傷的直接保護(hù)作用。

［1］劉錫光，祁自柏，熊詩松.肝病實(shí)驗(yàn)診斷指南［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：219.

［2］吳 勤，成 軍，李 莉.酒精性脂肪肝的研究［J］.世界華人消化雜志，2002，10（9）：1037-1038.

［3］陳重華，方治平，于波濤.肝脂康顆粒劑抗脂肪肝作用機(jī)理的研究［J］.中藥藥理與臨床，2006，22（3）：164-165.

［4］陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：479-499.

［5］夏瑾瑜，賈學(xué)平，程良斌，等.肝脂康膠囊對非酒精性脂肪肝的防治作用［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2004，12（1）：15-18.

［6］李亞峰，姚樹坤.中藥脂肝寧對酒精加高脂飲食大鼠脂肪肝丙二醛、谷胱甘肽的影響［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（4）：204-206.

［7］應(yīng) 力，姜春萌，王朝暉，等.甘正復(fù)方對大鼠非酒精性脂肪肝的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2006，14（2）：30-33.

［8］鄧?yán)?，李湛軍，樂嘉靜，等.海狗油對非酒精性脂肪肝肝細(xì)胞色素P450表達(dá)及與氧化抗氧化關(guān)系的影響［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，9（7）：755-758.

［9］陳建國.脂肪肝的研究近況［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2005，11（5）：83-85.

［10］戴 敏，劉青云，訾曉梅.丹皮酚對高脂血癥大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2001，7（2）：38-40.

［11］戴 敏，劉青云，顧承剛，等.丹皮酚對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及低密度脂蛋白氧化修飾的抑制作用［J］.中國中藥雜志，2000，25（10）：625-627.

［12］曾昭均.均勻設(shè)計(jì)及其應(yīng)用［M］.沈陽：遼寧人民出版社，1994：3.

［13］Fraser R，Dobbs B R，Roger GW.Lipoproteins and the liver sieve：the role of the fenestrated sinusoidalend othelium in lipoprotein metabolism，atherosclerosis，and cirrhosis［J］.Hepatoloogy，1995，21（3）：863-874.

［14］Davis R A，Boogaerts JR，Borchardt R A，et al.Intrahepatic assembly of very low density lipoproteins varied synthetic of individual apolipoproteins to fasting［J］.JBiol Chem，1985，260（26）：14137-44.

［15］古 賽，蔣小黎，何 琳，等.大鼠慢性酒精性脂肪肝的建立［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，31（1）：81-84.

［16］陳小囡.酒精性肝病的實(shí)驗(yàn)研究與治療［J］.杭州師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，5（3）：242-245.

［17］劉洪玲.水飛薊素的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2008，17（7）：23-26.

［18］孫 東，胡仕琦，王宇明.水飛薊藥理作用及其在肝病中的臨床應(yīng)用［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2007，10（22）：1891-1892.

［19］文 毅，曾連招，張春云，等.易善復(fù)、水飛薊賓治療非酒精性脂肪肝臨床療效觀察［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，6（6）：94-95.

［20］孫鐵民，李 銑.水飛薊素藥理研究進(jìn)展［J］.中草藥，2000，31（3）：229-232.

［21］劉 燕，吳 超.水飛薊素治療慢性乙型肝炎療效觀察［J］.江蘇醫(yī)藥雜志，2000，26（6）：445-446.

［22］范建高.脂肪肝［M］.上海：上?？萍汲霭嫔纾?000：201.

［23］呂瑞娟，任登先，閆 明.脂肪肝的發(fā)病機(jī)理和治療研究進(jìn)展［J］.甘肅科學(xué)學(xué)報(bào)，2001，13（2）：57-59.

［24］林 青，張 超，李立紀(jì)，等.去脂軟肝丸對實(shí)驗(yàn)性脂肪肝肝脂的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2002，9（5）：33-34.

［25］王釗紅，白秀云，紀(jì)土超.苦參堿對CCL4高脂低蛋白誘導(dǎo)大鼠脂肪肝變性影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2006，13（2）：108.

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1001-1528（2015）04-0854-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.036

2014-11-08

安徽省優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目 （8040106905）

顏貴明 （1974—），男，碩士，副教授，主要從事丹皮酚抗脂肪肝作用及機(jī)制研究。Tel：（0551）68129301，E-mail：922-119@163.com

*通信作者：戴 敏 Tel：（0551）68129122，E-mail：daiminliao@163.com