李 娜， 于皎凌， 姜素云*， 竇德強， 王紹杰

（1.大連市食品藥品檢驗所，遼寧大連116021；2.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧大連116000；3.大連市兒童醫(yī)院，遼寧大連116001）

強壯靈合劑對小鼠免疫功能的影響

李 娜1，2， 于皎凌1， 姜素云1*， 竇德強2*， 王紹杰3

（1.大連市食品藥品檢驗所，遼寧大連116021；2.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧大連116000；3.大連市兒童醫(yī)院，遼寧大連116001）

目的研究強壯靈合劑對小鼠免疫功能的影響。方法采用氫化可的松制備小鼠免疫抑制模型，連續(xù)灌胃給予不同劑量的強壯靈合劑30 d，測定免疫抑制小鼠單核巨噬細胞吞噬指數(shù)，胸腺、脾臟指數(shù)及遲發(fā)型過敏反應水平，觀察強壯靈合劑對免疫抑制小鼠免疫功能的影響；給正常小鼠連續(xù)灌胃給予不同劑量的強壯靈合劑15 d，測定小鼠胸腺、脾臟指數(shù)、血清溶血素水平，觀察強壯靈合劑對正常小鼠免疫功能的影響。結果與模型組相比，強壯靈合劑能顯著提高免疫抑制小鼠的單核巨噬細胞吞噬功能、遲發(fā)型超敏反應水平；顯著提高正常小鼠的溶血素抗體生成能力；能提高免疫抑制小鼠和正常小鼠的免疫器官指數(shù)。結論強壯靈合劑具有調(diào)節(jié)增強免疫功能，對小鼠特異性免疫和非特異性免疫均有一定的增強作用。

強壯靈合劑；免疫功能；巨噬細胞

強壯靈合劑以經(jīng)方玉屏風散為基礎添加補肺健脾益腎的黃精、板藍根等藥物而成，具有補肺固表，健脾益腎，提高機體免疫等功能。臨床上用于體虛多汗，易患感冒，倦怠乏力，便干，食欲不振等病癥，療效顯著［1-3］。黃芪是該復方的君藥，研究表明黃芪有調(diào)節(jié)免疫功能，可以對抗氫化可的松引起的免疫抑制［4-7］。本實驗觀察了強壯靈合劑及君藥黃芪對正常小鼠、免疫抑制小鼠免疫功能的影響，以期能為臨床應用提供基礎研究。

1 材料

1.1 藥品與試劑 強壯靈合劑的制備，將處方中各味中藥材清洗干凈后，冷水浸12 h，用蒸汽夾層鍋水煎煮3次，每次煎煮1 h。合并煎煮液，濾過，濾液放置6 h，取上清液濃縮后相當于含生藥量2 g/mL，灌裝，4℃保存?zhèn)溆?。所有藥物的動物用量根?jù) 《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》中要求，實驗所用劑量分別為15、30、60 g/kg 3個劑量，分別為人體用藥劑量的10、20、30倍。

黃芪水煎液的制備同強壯靈合劑，質(zhì)量濃度為 0.26 g/m L（其質(zhì)量濃度是拆強壯靈合劑復方計算所得），4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

玉屏風散水煎液按文獻 ［8］制備，最終質(zhì)量濃度為1 g/m L，4℃冰箱貯存?zhèn)溆?；轉移因子口服液 （長春精優(yōu)藥業(yè)股份有限公司，批號20121108）；鹽酸左旋咪唑片 （山東仁和堂藥業(yè)有限公司，批號120104）；醋酸地塞米松片（天津天藥藥業(yè)股份有限公司，批號130211）；氫化可的松注射液 （天津金耀氨基酸有限公司，批號H12020886）；印度墨汁 （北京索寶生物科技有限公司，批號1108A022）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 動物 SPF級昆明小鼠，體質(zhì)量 （20±2.0）g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（遼）2008-0002。

1.3 儀器 紫外-可見分光光度計 （島津儀器有限公司，UV-2550）；電熱恒溫水浴鍋 （中儀國科科技有限公司，DK-S26）；離心機（Backman Coulter Allegra X-30R Centrifuge，ALZ13C045）；自動壓力蒸汽滅菌器 （致微儀器有限公司，GR85DR）；電子天平（Mettler Toledo XS204；Mettler Toledo BJ4202S）等。

2 方法

2.1 對氫化可的松免疫抑制小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的影響 取小鼠128只，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機分為8組，每組16只。正常對照組 （生理鹽水30mL/kg）、免疫抑制模型組 （生理鹽水 30 mL/kg）、強壯靈合劑低劑量組（15 g/kg）、強壯靈合劑中劑量組 （30 g/kg）、強壯靈合劑高劑量組 （60 g/kg）、黃芪組 （8 g/kg）、玉屏風散組 （30 g/kg）、轉移因子口服液組 （0.3 mg/kg，溶液中多肽含量），每鼠灌胃容量為30 mL/kg，連續(xù)30 d，在給藥第18天除正常組外給其余7組腹腔注射氫化可的松50 mg/kg，連續(xù)7 d，造成小鼠免疫抑制［9］。最后一次給藥后2 h，每鼠尾靜脈注射用生理鹽水稀釋5倍的印度墨汁10 mL/kg，立即計時。于注入后2 min、10 min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μL，并立即將其加到2 m L 0.1%Na2CO3溶液中。于600 nm處測定吸光度 （OD），以Na2CO3溶液作空白對照。將小鼠處死，稱定質(zhì)量，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱定質(zhì)量。以吞噬指數(shù)K表示小鼠碳廓清的能力。按下式計算吞噬指數(shù)a，K=（lg OD1-lg OD2）/（t2-t1），a=體質(zhì)量/（體質(zhì)量+肝質(zhì)量）×［10］。

2.2 對氫化可的松免疫抑制小鼠遲發(fā)型過敏反應的影響

取小鼠128只，分組及給藥方式同 “2.1”項。于給藥第25天對所有小鼠進行脫毛處理，去毛面積3 cm×3 cm，用1%DNFB-丙酮蓖麻油溶液均勻涂布在所有小鼠腹部脫毛區(qū)致敏，于第30天用1%DNFB-丙酮蓖麻油溶液10μL均勻涂布于每鼠右耳背側，于攻擊后24 h處死小鼠并稱定質(zhì)量，剪下耳朵，用8 mm打孔器打下相同面積兩耳片稱定質(zhì)量，以左右耳片質(zhì)量差值作為腫脹度，并計算腫脹率。腫脹率 （%）=［（給藥組耳質(zhì)量-對照組耳質(zhì)量）/對照組耳質(zhì)量］ ×100%。測完耳朵質(zhì)量之后，取脾臟、胸腺，并稱定質(zhì)量。分別以每10 g小鼠的脾質(zhì)量和胸腺質(zhì)量作為脾臟、胸腺指數(shù)，脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）× 10，胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量 （mg）/體質(zhì)量 （g） ×10［11］。

2.3 對正常小鼠血清溶血素的影響 取雄性小鼠112只按體質(zhì)量隨機分為7組，每組16只。正常對照組 （生理鹽水30mL/kg）、強壯靈合劑低劑量組（15 g/kg）、強壯靈合劑中劑量組 （30 g/kg）、強壯靈合劑高劑量組 （60 g/kg）、黃芪組 （8 g/kg）、玉屏風散組 （30 g/kg）、鹽酸左旋咪唑組（0.02 mg/kg），每鼠灌胃容量為30 m L/kg，連續(xù)15 d。給藥第11天，每鼠腹腔注射20% 綿羊紅細胞 （SRBC）0.2 mL免疫，最后一次給藥24 h后稱定質(zhì)量，眼眶取血收集7組小鼠血清。取1：500稀釋的小鼠血清1 mL、5%SRBC 0.5 mL、10%補體1 mL，置37℃恒溫水浴中孵育30 min，然后移至冰浴中終止反應，離心后取上清1 mL，加都氏試劑3 mL，搖勻放置10 min，于540 nm波長處測定吸光度OD值。取生理鹽水1mL，加都氏試劑3mL為空白對照管。另取5%SRBC 0.25 mL，加入都氏試劑4 mL，測OD值，即為實驗中所用SRBC半數(shù)溶血時的OD值。處死小鼠，各組小鼠分離脾臟、胸腺，濾紙吸干表面血污，稱定質(zhì)量，計算免疫器官指數(shù)。血清溶血素水平以半數(shù)溶血值 HC50表示，樣品管中半數(shù)溶血值HC50按下式計算：HC50=（樣品的OD值/SRBC半數(shù)溶血時的OD值）×稀釋倍數(shù)［12］。

3 結果

3.1 對免疫抑制小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的影響 由表1可知，與正常組相比，免疫抑制模型組吞噬指數(shù)顯著降低（P＜0.01），說明免疫抑制模型造模成功；灌胃給予強壯靈合劑低、高劑量的模型小鼠，其吞噬指數(shù)發(fā)生了明顯回升，與正常小鼠無統(tǒng)計差異 （P＞0.05）；而分別灌胃了陽性對照藥物轉移因子口服液和黃芪單味藥溶液恒的免疫抑制小鼠，其吞噬指數(shù)與模型組相比有升高，但不具有統(tǒng)計學意義，與正常小鼠相比仍然有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 強壯靈合劑對免疫抑制小鼠單核巨噬細胞的影響（，n=16）

表1 強壯靈合劑對免疫抑制小鼠單核巨噬細胞的影響（，n=16）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01

吞噬指數(shù)正常組 — 7.90±2.96組別 劑量/（g·kg-1）●●模型組 — 4.57±1.00**強壯靈合劑低劑量組 15 5.83±2.70強壯靈合劑中劑量組 30 4.28±1.58*強壯靈合劑高劑量組 60 6.15±1.95●黃芪組 8 4.85±2.54*玉屏風散組 30 4.38±1.08**轉移因子口服液組 0.3 4.99±2.13*

3.2 對免疫抑制小鼠免疫器官的影響 由表2可知，與正常組相比，免疫抑制模型組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），說明免疫抑制模型造模成功；黃芪組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)、強壯靈合劑低劑量組、陽性藥玉屏風散組脾臟指數(shù)發(fā)生了明顯回升，與正常組相比無統(tǒng)計差異 （P＞0.05）。

表2 強壯靈合劑對免疫抑制小鼠免疫器官的影響 （，n=16）

表2 強壯靈合劑對免疫抑制小鼠免疫器官的影響 （，n=16）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1）胸腺指數(shù)/（mg/10 g）脾指數(shù)/（mg/10 g）正常組 — 18.06±8.17●●46.47±14.29模型組 — 11.31±3.75** 34.37±13.57*強壯靈合劑低劑量組 15 12.21±6.32* 43.60±20.11強壯靈合劑中劑量組 30 8.62±2.99***●34.75±10.07*強壯靈合劑高劑量組 60 8.28±4.16***32.43±8.64**玉屏風散組 30 8.59±4.02 44.38±20.42黃芪組 8 12.73±8.25***38.02±10.67轉移因子口服液組 0.3 12.10±5.40* 34.57±12.46*

3.3 對免疫抑制小鼠遲發(fā)型過敏反應的影響 由表3可知，與正常組相比，模型組腫脹顯著低于正常組 （P＜0.05），說明免疫抑制模型造模成功；與正常組相比，強壯靈合劑各劑量組、玉屏風散組、黃芪組、轉移因子組均無差異 （P＞0.05）；與模型組相比，強壯靈合劑中、高劑量組、玉屏風散組、轉移因子口服液組腫脹顯著提高 （P＜0.05或P＜0.01）。說明強壯靈合劑能顯著提高免疫抑制小鼠的免疫功能。

表3 強壯靈合劑對免疫抑制小鼠遲發(fā)型過敏反應的影響（，n=16）

表3 強壯靈合劑對免疫抑制小鼠遲發(fā)型過敏反應的影響（，n=16）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01，●●●P＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1）耳腫脹差值/ mg 腫脹率/%正常組 — 6.83±3.27●-16.56模型組 — 3.02±2.14* -55.80強壯靈合劑低劑量組 15 4.57±2.07 -33.14強壯靈合劑中劑量組 30 6.62±3.02●●● -3.05強壯靈合劑高劑量組 60 5.90±3.44● -13.63玉屏風散組 30 8.20±0.01●●● 20.14黃芪組 8 5.41±5.18 -20.85轉移因子口服液組 0.3 5.70±2.80●●

3.4 對正常小鼠免疫器官的影響 由表4可知，灌胃給予強壯靈合劑、黃芪組、玉屏風散組的小鼠，與正常小鼠相比其胸腺、脾臟指數(shù)有升高的趨勢，但是無統(tǒng)計差異 （P＞0.05）。

表4 強壯靈合劑對正常小鼠免疫器官的影響（，n=16）

表4 強壯靈合劑對正常小鼠免疫器官的影響（，n=16）

組別 劑量/（g·kg-1）胸腺指數(shù)/（mg/10 g）脾指數(shù)/（mg/10 g）正常組 —21.63±6.71 48.09±10.65強壯靈合劑低劑量組 15 25.84±11.62 53.19±12.69強壯靈合劑中劑量組 30 22.20±6.39 49.73±7.96強壯靈合劑高劑量組 60 22.20±6.80 43.88±12.41玉屏風散組 30 1.90±0.01 43.64±7.20黃芪組 8 24.55±9.75 49.30±10.92左旋咪唑組0.02 21.82±7.59 45.18±11.81

3.5 對正常小鼠血清溶血素的影響 由表5可知，與正常組相比，強壯靈合劑低劑量組、黃芪組、玉屏風散組、鹽酸左旋咪唑組均可顯著促進小鼠機體溶血素抗體的生成 （P＜0.05或P＜0.01）；強壯靈合劑高劑量組可促進小鼠溶血素抗體的生成，但是與正常組相比無顯著性差異 （P＞0.05）。

表5 強壯靈合劑對正常小鼠血清溶血素的影響 （，n=16）

表5 強壯靈合劑對正常小鼠血清溶血素的影響 （，n=16）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量/（g·kg-1） 半數(shù)溶血值HC50正常組 —458.90±16.13強壯靈合劑低劑量組 15 479.20±13.05**強壯靈合劑中劑量組 30 457.80±13.46強壯靈合劑高劑量組 60 470.00±7.43玉屏風散組 30 475.10±18.47*黃芪組 8 477.60±15.69**左旋咪唑組 0.02 473.10±8.98*

4 討論

脾臟和胸腺是外周免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的重要器官［9］。脾臟含有T淋巴細胞和巨噬細胞，是淋巴細胞遷移和接受抗原刺激后發(fā)生免疫應答、合成補體等免疫效應分子的重要場所，能直接參與細胞免疫；脾臟還富含B淋巴細胞和漿細胞，是全身最大的抗體產(chǎn)生的器官，特別是產(chǎn)生IgG、IgM，調(diào)節(jié)機體的體液免疫［13-15］。強壯靈合劑有增加免疫器官質(zhì)量的趨勢。

強壯靈合劑可使免疫抑制小鼠單核巨噬細胞吞噬活性明顯升高 ［中、高劑量組與正常對照組比較，均P＞0.05；與模型組比較，高劑量組 （P＜0.05）］，說明提高小鼠單核巨噬細胞吞噬活性的最佳給藥劑量可能為60 g/kg。

強壯靈合劑能夠顯著增強氫化可的松所致免疫低下小鼠的遲發(fā)型過敏反應。與正常對照組比較，強壯靈合劑低、中、高劑量對DNFB誘發(fā)的免疫抑制小鼠遲發(fā)型過敏反應引起的耳腫脹無明顯差異 （P＜0.05），隨著劑量的增加，其促進小鼠抗體產(chǎn)生的能力逐漸增強，但是當繼續(xù)增大用藥劑量時，這種作用有減弱的趨勢，因此我們認為強壯靈合劑增強小鼠特異性細胞免疫功能存在一個最佳劑量范圍，實驗劑量在30 g/kg左右效果最佳。

強壯靈合劑低劑量組血清溶血素半數(shù)溶血值HC50明顯高于正常對照組 （P＜0.05），提示強壯靈合劑對小鼠體液免疫有一定增強作用。黃芪組顯著提高HC50，促進小鼠機體溶血素抗體的生成 （P＜0.05或P＜0.01），說明君藥黃芪有增強免疫功能的趨勢，在復方強壯靈合劑免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用。

強壯靈合劑是通過多途徑來調(diào)節(jié)機體的免疫水平，并且跟其劑量有密切關系，按照臨床的等效劑量計算，本研究的結果對臨床劑量有一定的指導意義。本方劑還具有攜帶服用方便，省去了傳統(tǒng)中藥煎煮的麻煩，避免煎煮中藥時產(chǎn)生的難聞氣味等優(yōu)點，所以不失為一種很好的增強免疫的藥物。

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R285.5

B

1001-1528（2015）04-0862-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.038

2014-02-20

遼寧省自然科學基金項目 （201102043）

李 娜 （1987—），女，碩士生，研究方向為藥理學。E-mail：921888804@qq.com

*通信作者：姜素云 （1958—），女，主任藥師，主要從事藥理學及藥代動力學研究。