魏明剛， 程宗琦， 劉 蔚， 顧冬梅， 李鳳玲， 陸 迅， 陳 琳， 楊彥裕

（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，江蘇蘇州215006，）

芪歸益腎方對阿霉素腎病大鼠腎功能保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

魏明剛， 程宗琦， 劉 蔚， 顧冬梅， 李鳳玲， 陸 迅， 陳 琳， 楊彥裕

（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，江蘇蘇州215006，）

目的驗(yàn)證中藥方劑芪歸益腎方在延緩腎臟纖維化方面的功效。方法芪歸益腎方由黃芪、當(dāng)歸和川芎等藥物按照一定的比例關(guān)系所組成，觀察方劑對阿霉素腎病大鼠的治療作用。結(jié)果通過本研究發(fā)現(xiàn) “芪歸益腎方”可以有效地減少阿霉素腎病大鼠尿蛋白的漏出和降低尿NAG的表達(dá)水平。通過腎臟組織的免疫組織化學(xué)對TGF-β1、TIMP-1和MMP-2以及細(xì)胞外基質(zhì)成分Col-Ⅰ和LN的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)“芪歸益腎方”具有調(diào)節(jié)纖維化相關(guān)細(xì)胞因子以及細(xì)胞外基質(zhì)相應(yīng)成分及代謝酶表達(dá)作用。結(jié)論傳統(tǒng)中草藥可以有效減輕阿霉素腎病大鼠的腎臟纖維化水平，從而達(dá)到延緩腎臟病變進(jìn)展，保護(hù)腎功能的作用。

阿霉素腎??；腎功能保護(hù)；實(shí)驗(yàn)研究

在我國慢性腎小球腎炎仍是慢性腎臟病的主要病因，其主要的病變特點(diǎn)簡而言之就是臨床上表現(xiàn)為蛋白尿和病理上表現(xiàn)為腎臟不同程度的纖維化。因此，控制慢性腎小球腎炎病變的進(jìn)展是腎臟病領(lǐng)域的核心問題之一。中草藥在慢性腎小球腎炎的治療上已有數(shù)百年的歷史并積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。但是，直到目前為止還沒有一個(gè)行之有效且闡明治療機(jī)制的方劑能夠被臨床所接受。課題組在以往實(shí)驗(yàn)和臨床工作的基礎(chǔ)上發(fā)明了 “加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯”，并將方劑進(jìn)一步改良后命名為 “芪歸益腎方”［1-2］。希望通過本研究闡明該方劑治療慢性腎小球腎炎的機(jī)制。阿霉素腎病大鼠是經(jīng)典的慢性腎小球腎炎病變模型，該模型存在明顯的腎小球和腎小管間質(zhì)病變。單次尾靜脈注射阿霉素造模在我們以往的研究中得到充分的驗(yàn)證［1］。阿霉素腎病模型大量尿蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)聚集的特點(diǎn)和腎臟病理改變與人類病變相一致。因此是國際上公認(rèn)并用于實(shí)驗(yàn)研究慢性腎臟病的動(dòng)物模型。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)異常降解和聚集是導(dǎo)致腎臟損害以及腎臟纖維化病變的核心問題［3］。基質(zhì)金屬蛋白酶 （MMP）是一組鋅依賴的蛋白水解酶，其對細(xì)胞外基質(zhì) （ECM）具有直接的作用并減少其在組織中的聚集，減輕組織纖維化的程度。而金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）抑制MMP的活性，影響ECM的降解。研究發(fā)現(xiàn)，MMP的成員MMP-2在腎臟組織的ECM降解中起到關(guān)鍵作用［4-5］。

1 實(shí)驗(yàn)過程及方法

1.1 藥物和材料 芪歸益腎方由黃芪、當(dāng)歸、川芎等組成，藥品購自蘇州天靈藥業(yè)股份有限公司；洛丁新 （貝那普利）由北京諾華制藥有限公司制造；阿霉素 （ADR）由深圳萬樂藥業(yè)股份有限公司制造。其他與本研究相關(guān)的實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

芪歸益腎方的制備 將黃芪、當(dāng)歸與川芎等藥物按照一定的比例制備成混懸液，混懸液的藥物質(zhì)量濃度為1 g/mL，在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室進(jìn)行藥材鑒定并制備。貝那普利 （ACEI）作為陽性對照應(yīng)用于本研究。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和給藥方式 32只雄性SD大鼠（140±10）g，購自中國科學(xué)院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 （SCXK（滬）2012-0002），它們被安置在標(biāo)準(zhǔn)的溫度條件下 （23 ±1）℃、相對濕度 （55±10）%和12 h光/12 h暗周期，可以隨意獲得食物和水。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表的方法分為4組：正常對照組、模型組、貝那普利組和芪歸益腎方組，每組8只。除了正常對照組，其他組大鼠均通過尾靜脈注射給予阿霉素 （7.5 mg/kg）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的所有程序都由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

大鼠灌胃治療包括清潔飲用水、貝那普利或芪歸益腎方給予對應(yīng)組別的大鼠，治療時(shí)間為8周，每天1次。貝那普利和芪歸益腎方使用與人類等效劑量的藥物，分別是10 mg/（kg·g）、10 mL/（kg·d）和1 g/（kg·d）、2 mL/（kg·d）。芪歸益腎方的劑量選擇依據(jù)對應(yīng)于在我們的初步實(shí)驗(yàn)中抑制TGF-β1mRNA的表達(dá)最低有效劑量［1］。相對于貝那普利或芪歸益腎方，模型組給予相同體積的清潔飲用水。在實(shí)驗(yàn)期間每2周對各組大鼠稱定質(zhì)量并記錄。在為期8周的實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)摘除大鼠腎臟。

1.3 尿液和血液檢測 大鼠在實(shí)驗(yàn)研究的第7、28、42、56天被置于代謝籠收集24 h尿液，在此期間并不改變大鼠的進(jìn)食和飲水習(xí)慣，收集尿液以便檢測24 h尿白蛋白排泄和尿NAG酶等項(xiàng)目。收集的尿液樣本 （5 mL）在室溫條件下離心機(jī)離心5min收集上清液并儲(chǔ)存在-80℃超低溫冰箱直到測試。血液 （2～3 mL）的獲得方法主要是通過在實(shí)驗(yàn)研究的第7、28、42、56天眼眶靜脈取血的方法，然后血液在室溫條件下離心10 min后收集血清并儲(chǔ)存在-80℃超低溫冰箱中以便測定血清白蛋白 （SAL）、血液尿素氮 （BUN）等項(xiàng)目。生化指標(biāo)的檢測在自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行（OLYMPUSAU-5400，日本）。

1.4 腎臟樣品制備 大鼠脫頸椎處死后立即對兩側(cè)腎臟進(jìn)行移除并除去腎臟外部的包膜，然后對腎臟稱定質(zhì)量。進(jìn)行腎臟/身體 （K/B）質(zhì)量比的測定。腎臟使用4℃冷生理鹽水清洗，至少3次，然后使用濾紙擦干。

1.5 TGF-β1、MMP-2、TIMP-1、Laminin（LN）和collagen I（Col-I）腎臟組織的免疫組織化學(xué)分析 這個(gè)過程是應(yīng)用免疫組織化學(xué)中標(biāo)準(zhǔn)的SP染色方法。具體的方法是將腎組織樣本固定在10%中性甲醛中，酒精脫水后加入石蠟包埋。按照標(biāo)準(zhǔn)切片 （4μm）制備組織玻璃切片。3%H2O2室溫孵育以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS液浸泡。切片放入盛有抗原修復(fù)液 （工作液）的容器中，電爐上加熱煮沸，室溫冷卻，蒸餾水沖洗后PBS液洗滌。5%～10%正常山羊血清 （PBS液稀釋）封閉非特異性抗原，要完全覆蓋組織表面，室溫孵育。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育或4℃過夜。PBS液沖洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育后滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，DAB染色，避光，顯微鏡觀察。復(fù)染：在蘇木素下45 s至 1 min。分別使用TGF-β1，MMP-9，TIMP-1，Col-I和LN單克隆抗體過夜，脫水透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察。觀察方法：棕色或者棕褐色著色面積作為陽性面積。應(yīng)用計(jì)算機(jī)醫(yī)學(xué)病理圖象分析系統(tǒng)對腎臟組織切片的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果進(jìn)行分析，在400倍光學(xué)顯微鏡下每個(gè)組織切片采集30個(gè)不重疊視野中的陽性染色面積，然后計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)的染色區(qū)域的平均光密度數(shù)值，將數(shù)據(jù)匯總，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 阿霉素腎病大鼠的行為學(xué)表現(xiàn) 在實(shí)驗(yàn)過程中，正常對照組所有的大鼠存活并表現(xiàn)出正常的行為與光滑的毛皮以及體質(zhì)量增加。其他組的大鼠均表現(xiàn)出不同程度的進(jìn)食下降和頭發(fā)光澤度下降，昏睡和缺乏活動(dòng)，并有腹瀉和體質(zhì)量下降。

2.2 芪歸益腎方對腎身體/質(zhì)量比、血清白蛋白和血脂的影響 模型組與正常對照組比較，血清白蛋白水平顯著下降且組間差異在造模早期就出現(xiàn)。使用貝那普利或芪歸益腎方治療可以部分恢復(fù)血清白蛋白水平，治療后8周組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在實(shí)驗(yàn)的56 d，模型組與對照組K/ B質(zhì)量比也可以看出明顯不同。貝那普利治療或芪歸益腎方可以明顯降低這個(gè)比率，這種改變相對模型組的組間比較同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05，表1）。

表1 各組大鼠腎身體/質(zhì)量比 （K/B）、血清蛋白和血脂情況（）

表1 各組大鼠腎身體/質(zhì)量比 （K/B）、血清蛋白和血脂情況（）

組別 動(dòng)物數(shù)/只 （K/B）/（mg·kg-1）血清蛋白/（g·L-1）血脂/（mmol·L-1）8 3.46±0.19 21.92±0.85 0.64±0.22模型組 8 5.91±0.12 11.96±1.88 1.66±1.14貝那普利組 8 4.85±0.19 15.02±4.88 0.66±0.32芪歸益腎組正常對照組8 4.31±0.28 14.78±2.65 0.52±0.30

2.3 芪歸益腎方對24 h尿白蛋白和NAG酶的影響 模型組大鼠與正常對照組比較，其24 h尿蛋白定量的增加非常明顯。貝那普利和芪歸益腎方的尿蛋白定量水平下降明顯，表明芪歸益腎方扭轉(zhuǎn)了尿蛋白持續(xù)增加的趨勢，與模型組比較而言尿蛋白減少超過50%，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。對于尿NAG酶而言，模型組與正常對照組比較其在42 d和56 d均增加非常明顯。使用貝那普利和芪歸益腎方干預(yù)治療后大鼠NAG酶的水平在實(shí)驗(yàn)的42 d和56 d下降明顯 （P＜0.05，圖2）。

2.4 芪歸益腎方對腎功能影響 治療前后各組大鼠的腎功能如尿素氮組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05，表2）。參考相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為［1］，造模和治療本身由于時(shí)間因素還未達(dá)到導(dǎo)致腎功能明顯下降的程度。

圖1 各組大鼠24 h尿蛋白定量變化趨勢圖

圖2 各組大鼠尿NAG酶定量變化趨勢圖

2.5 芪歸益腎方對腎組織Col-Ⅰ、LN、TGF-β1、MMP-2、 TIMP-1表達(dá)的影響 模型組中腎小球LN和Col-Ⅰ的表達(dá)明顯高于其他組。應(yīng)用貝那普利治療或芪歸益腎方治療后，相對于模型組而言可以明顯地減少Col-Ⅰ和LN的表達(dá)水平。而且芪歸益腎方與貝那普利治療結(jié)果相比較而言在減少Col-Ⅰ和LN的表達(dá)上組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3，圖4～5）。

表2 各組大鼠造模后腎功能情況的動(dòng)態(tài)監(jiān)測 （）

表2 各組大鼠造模后腎功能情況的動(dòng)態(tài)監(jiān)測 （）

組別 動(dòng)物數(shù)/只血清尿素氮定量檢測/（mmol·L-1）1周 4周 6周 8周8 5.35±0.63 9.91±0.91 9.02±3.58 6.15±0.57模型組 8 5.63±0.63 9.86±0.60 7.07±4.14 5.17±0.42貝那普利組 8 6.16±0.71 10.61±1.77 6.60±0.81 7.66±1.75芪歸益腎組正常對照組8 6.69±0.61 11.10±3.24 5.76±0.76 6.17±0.89

模型組腎小球中TGF-β1和TIMP-1的表達(dá)明顯高于其他組。應(yīng)用貝那普利治療或芪歸益腎方治療后，相對于模型組而言可以明顯地減少腎小球TGF-β1和TIMP-1的表達(dá)水平 （P＜0.05，表3，圖6～7）。而且芪歸益腎方與貝那普利治療結(jié)果相比較而言在減少M(fèi)MP-2的表達(dá)明顯低于其他組，應(yīng)用貝那普利治療或芪歸益腎方治療后，相對于模型組而言可以明顯地提高腎小球MMP-2的表達(dá)水平，且（P＜0.05，表3，圖8）。

表3 實(shí)驗(yàn)第8周TGF-β1，MM P-2，TIMP-1，Col-Ⅰ和LN在腎組織的表達(dá)（）

表3 實(shí)驗(yàn)第8周TGF-β1，MM P-2，TIMP-1，Col-Ⅰ和LN在腎組織的表達(dá)（）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與貝那普利組比較，△P＜0.05

LN正常對照組組別 動(dòng)物數(shù)/只 TGF-β1 MMP-2 TIMP-1 Col-Ⅰ8 0.169±0.015 0.456±0.061 0.202±0.015 0.166±0.029 0.171±0.015模型組 8 0.4912±0.034 0.203±0.035 0.348±0.026 0.403±0.033 0.492±0.021貝那普利組 8 0.285±0.0421* 0.274±0.042* 0.273±0.038* 0.252±0.031* 0.293±0.034*芪歸益腎組 8 0.187±0.026*△ 0.314±0.028*△ 0.240±0.030*△ 0.206±0.025*△ 0.215±0.019*△

圖3 各組大鼠腎臟病理情況 （HE染色，×400倍）

圖4 各組大鼠腎臟病理情況 （Col-Ⅰ，×400倍）

3 討論

腎小球和腎小管間質(zhì)纖維化是慢性腎小球腎炎的主要病理學(xué)表現(xiàn)，ECM聚集是其主要的原因之一［6］。蛋白尿是引起慢性腎臟病患者腎功能下降的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素［7］，而尿NAG酶是用來檢測腎小管損傷的敏感標(biāo)志物［8］?？刂颇虻鞍椎闹委?，尤其是使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACE）或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑 （ARB）一直被認(rèn)為是有利于腎臟保護(hù)的重要環(huán)節(jié)［9］。然而，上述藥物對腎小管卻無任何保護(hù)作用。

圖5 各組大鼠腎臟病理情況 （LN，×400倍）

圖6 各組大鼠腎臟病理情況 （TGF-β1，×400倍）

圖7 各組大鼠腎臟病理情況（TIMP-1，×400倍）

圖8 各組大鼠腎臟病理情況（MMP-2，×400倍）

ECM在腎臟的集聚特別是在腎小管間質(zhì)的增生是導(dǎo)致腎臟組織結(jié)構(gòu)改變的一個(gè)標(biāo)志，它和腎功能下降直接相關(guān)［10］。基質(zhì)金屬蛋白酶 （MMPS）在腎臟的主要作用是促進(jìn)ECM蛋白的降解。它在組織中的活性受到基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）的調(diào)控［11］。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一員，具有降解ECM蛋白如膠原、層粘連蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)的作用［12］。TIMP-1是腎臟MMP-2的特定抑制劑［13］。生理?xiàng)l件下MMPs和TIMPs維持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控ECM的合成和降解。TGF-β1被認(rèn)為是在組織纖維化相關(guān)疾病發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵的分子。TGF-β1的重要作用就是通過刺激間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生各種ECM蛋白。TGF-β1也降低了MMPs的活性并使TIMPs的產(chǎn)生和活性增加。這種作用使成纖維細(xì)胞保持和維護(hù)它們在持續(xù)激活狀態(tài)下的自分泌機(jī)制，導(dǎo)致進(jìn)一步產(chǎn)生TGF-β1，形成惡性循環(huán)導(dǎo)致組織器官纖維化的進(jìn)展。

芪歸益腎方由黃芪、當(dāng)歸和川芎等在一定比例下制成，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)方劑本身包含多種活性成分。在我們的研究中阿霉素腎病大鼠的尿蛋白和NAG酶隨著時(shí)間延長而作用增加。而芪歸益腎方具有降低尿蛋白和尿NAG酶隨時(shí)間推移而增加的作用，特別是在8周治療結(jié)束時(shí)與模型組比較而言減少超過50%的尿蛋白排泄量 （圖1）。治療效果與西藥在大鼠腎小球損傷模型的療效比較更加顯著［14］。進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，芪歸益腎方與貝那普利相比顯示出減少尿NAG方面有更好的功效。研究還表明，類似于貝那普利，芪歸益腎方減少Col-Ⅰ和LN在腎小球聚集的功效（圖4～5）。本研究表明應(yīng)用芪歸益腎方可以有效保護(hù)腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，且腎功能的保護(hù)作用與減少ECM積聚相關(guān)（表3）。本研究發(fā)現(xiàn)在阿霉素腎病大鼠腎組織TIMP-1的表達(dá)增加和MMP-2的表達(dá)降低進(jìn)而增加TIMP-1/MMP-2的比例使基質(zhì)的降解減少從而導(dǎo)致ECM的聚集 （表3，圖7～8）。本藥物的腎保護(hù)作用與維護(hù)MMPs和TIMPs在腎臟表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)，其直接影響ECM在腎臟的聚集［15］。貝那普利能夠減少蛋白尿，減少纖維細(xì)胞增殖的作用，因而在本研究中作為陽性對照藥物。本研究表明芪歸益腎方調(diào)節(jié)MMP-2和TIMP-1在腎組織中的表達(dá)水平從而改變了TIMP-1/MMP-2的比例，同時(shí)減少TGF-β1在大鼠腎皮質(zhì)的表達(dá) （表3，圖6～8）。

總之，這項(xiàng)研究表明，芪歸益腎方抑制腎臟纖維化的機(jī)制是多途徑作用的結(jié)果，其療效機(jī)制與減少尿蛋白漏出、降低尿NAG酶水平以及抑制腎臟ECM積累和改變TGF-β1，TIMP-1和MMP-2在腎臟皮質(zhì)的表達(dá)從而有利于降解細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)。本研究提示芪歸益腎方可能是一個(gè)有前途的預(yù)防和治療腎纖維化的方劑。

致謝：感謝為課題付出辛苦努力的課題組和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室所有的工作人員，特別是蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床免疫學(xué)研究所、蘇州大學(xué)骨科研究所、蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部和蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科提供的技術(shù)支持。

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R285.5

B

1001-1528（2015）04-0865-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.039

2014-01-12

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （81273723，81473633）；江蘇省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目 （LZ13235）；蘇州市科學(xué)技術(shù)局應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃 （SYS201016）

魏明剛（1975—），男，副教授，研究方向?yàn)槟I臟病、免疫病。Tel：13812791993，E-mail：weimg@sina.com