侯 茜， 張秋菊， 劉永琦， 張 帆

（甘肅中醫(yī)學院，甘肅蘭州730000）

低氧環(huán)境下黃芪注射液對人骨髓間充質干細胞體外增殖的影響

侯 茜， 張秋菊， 劉永琦， 張 帆

（甘肅中醫(yī)學院，甘肅蘭州730000）

目的探討低氧環(huán)境下黃芪注射液對人骨髓間充質干細胞 （hMSCs）體外增殖的影響。方法將體外培養(yǎng)的hMSCs分成常氧組和低氧組，分別用0、25、50、100、150、200、300、400、500、600、1 000μg/mL的黃芪注射液干預48 h，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，四甲基偶氮唑鹽 （MTT）法檢測細胞的增殖情況。結果低氧環(huán)境下，25、50、100、150、200μg/mL的黃芪注射液均可明顯促進hMSCs的增殖 （P＜0.01），其中50μg/mL黃芪注射液的增殖效果最顯著（P＜0.01），達600μg/mL時產(chǎn)生抑制作用；常氧環(huán)境下，黃芪注射液以300μg/mL對hMSCs的促增殖作用最為明顯 （P＜0.01），25、50、100、150、200、600、1 000μg/mL黃芪注射液均抑制hMSCs的增殖。結論黃芪注射液在一定質量濃度下可促進體外培養(yǎng)的hMSCs的增殖。低氧環(huán)境下，低質量濃度促進其增殖；常氧環(huán)境下，低質量濃度抑制其增殖。

黃芪注射液；人骨髓間充質干細胞 （hMSCs）；低氧培養(yǎng)；增殖

人骨髓間充質干細胞（human bonemarrow-derived mesenchymal stem cells，hMSCs）具有自我更新能力和多向分化潛能，將其作為種子細胞用于基因治療和細胞治療已成為當前研究的熱點。hMSCs主要來源于骨髓，在骨髓內的氧濃度為1%～7%之間［1］，是一種生理性的低氧環(huán)境，hMSCs移植后治療效能的發(fā)揮也與損傷部位的低氧環(huán)境密切相關。但目前hMSCs體外培養(yǎng)和增殖分化的研究大多是在常氧條件下進行的，忽視了體內一些生理、病理狀態(tài)中，出現(xiàn)細胞局部微環(huán)境低氧的真實情況。如何在體外低氧環(huán)境下促進hMSCs的增殖、分化，是目前hMSCs研究的重點和難點。

黃芪是一味歷史悠久、臨床上最常用的 “扶正固本，補中益氣”的中藥，具有增強機體免疫力、降血糖、抗應激、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射等多種功效。近年來，有關研究提示黃芪與hMSCs間有密切關系［2-4］，少量研究結果表明黃芪具有調控hMSCs增殖、分化和遷移的作用［5］。但低氧環(huán)境下黃芪注射液對人骨髓間充質干細胞體外增殖的影響尚未見報道。本實驗將傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論與干細胞研究相結合，在低氧環(huán)境下用中藥黃芪干預hMSCs培養(yǎng)過程，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，MTT法檢測細胞增殖，探討低氧環(huán)境下黃芪對hMSCs體外增殖的影響，為臨床治療運用黃芪注射液提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株 人骨髓間充質干細胞（human bonemarrowderived mesenchymal stem cells，hMSCs），購自Cyagen Biosciences Inc（Catalog Number：HUXMA-01001）。

1.2 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基（HYCLONE NYB0813），0.25%胰蛋白酶 （GIBCO 20130708217）；胎牛血清 （HYCLONE NXA0544）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（索萊寶科技有限公司 0793）；二甲基亞砜 （索萊寶科技有限公司0231）；黃芪注射液 （神威藥業(yè)集團，10mL黃芪注射液相對于原藥材20 g）。

1.3 儀器 三氣培養(yǎng)箱 （力康發(fā)展有限公司HF-100），二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO MCO-18AIC（UV））；超凈工作臺 （天津市泰斯特儀器有限公司CJ-2S）；倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS IX81）；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BIORAD IMARK1509）；往復式水浴搖床 （上海智誠分析儀器制造公司ZHEY-110X30）等。

2 方法

2.1 hMSCs體外培養(yǎng) 將hMSCs傳于25 cm培養(yǎng)瓶中，每瓶3 m L。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，去除未貼壁細胞，以后每2天換液1次。當細胞融合度約達80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。倒置相差顯微鏡觀察傳代細胞生長情況和形態(tài)。

2.2 實驗分組 將體外培養(yǎng)的hMSCs分為常氧組和低氧組。常氧組置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱 （21%O2）中培養(yǎng)；低氧組置于37℃、三氣培養(yǎng)箱 （5%O2）中培養(yǎng)。黃芪注射液分為：0、25、50、100、150、200、300、400、500、600、1 000μg/mL十一個劑量。

2.3 MTT比色法檢測hMSCs增殖 將培養(yǎng)的hMSCs，用0.25%的胰蛋白酶消化制備成單細胞懸液，調整其細胞密度為2×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔含細胞懸液100μL。按實驗分組分別置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱及37℃、三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，分別加入0、25、50、100、150、200、300、400、500、600、1 000μg/mL的黃芪注射液干預48 h。終止前4 h，各組于每孔加5 mg/mL MTT20μL，繼續(xù)孵育4 h，棄除孔內上清液，每孔加入二甲基亞砜150μL，將培養(yǎng)板置水平搖床上，低速震蕩20 m in使沉淀充分溶解后，選擇570 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀測量吸光度OD值。實驗重復3次。

2.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 （）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 hMSCs形態(tài)學觀察 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，可見hMSCs培養(yǎng)24 h后開始貼壁，3 d后細胞增多，形態(tài)均一，為成纖維細胞樣，呈梭形或紡錘形生長。6～7 d后細胞聚集生長，以長梭形為主，細胞分布均勻，排列有序，邊界清晰，旋渦樣生長。常氧和低氧環(huán)境下的hMSCs的形態(tài)無明顯區(qū)別。

3.2 MTT比色法檢測hMSCs增殖結果 常氧環(huán)境下，黃芪注射液質量濃度在25～200μg/m L范圍內變動時，均抑制hMSCs的增殖（P＜0.01），300μg/m L的黃芪注射液對hMSCs具明顯促增殖作用 （P＜0.01），隨質量濃度增大時增殖作用降低，當質量濃度達600、1 000μg/mL時產(chǎn)生抑制作用 （P＜0.01），見圖1。低氧環(huán)境下，25、50、100、150、200μg/mL的黃芪注射液均可明顯促進hMSCs的增殖（P＜0.01），其中以50μg/mL黃芪注射液的增殖效果最顯著 （P＜0.01），當質量濃度達600、1 000μg/mL時產(chǎn)生抑制作用 （P＜0.01），見圖2。

圖1 常氧下 （21%氧濃度）不同質量濃度黃芪注射液對hMSCs增殖的影響

圖2 低氧下 （5%氧濃度）不同質量濃度黃芪注射液對hMSCs增殖的影響

4 討論

hMSCs主要來源于骨髓，骨髓是一典型的低氧環(huán)境，有學者將hMSCs的生長環(huán)境歸于生理性低氧。除正常的生理性低氧外，一些病理性的情況也往往造就低氧環(huán)境，動員hMSCs聚集修復的損傷組織如骨壞死、心肌梗塞處，因為缺血缺氧使得病變組織長期處于低氧環(huán)境，而hMSCs移植后治療效能的發(fā)揮也與損傷部位的低氧環(huán)境密切相關。hMSCs正是歸巢于這樣的低氧環(huán)境中，分化成熟，修補缺損，彌補功能［6］?？梢奾MSCs在自然所處的環(huán)境中以低氧為主，低氧是其在正常生理狀態(tài)下或某些病理狀態(tài)中所處環(huán)境的一個基本要素。

國內外關于中藥黃芪干預hMSCs，對其增殖的影響研究不多。胡琳等［7］體外加黃芪注射液 （藥物濃度梯度為：原液，5、10、15、20倍液）培養(yǎng)大鼠hMSCs24、48 h，結果發(fā)現(xiàn)黃芪注射液對hMSCs的增殖無顯著作用。譚艷芳等［8］加入不同濃度的黃芪甲苷與大鼠hMSCs共培養(yǎng)24、48、72 h后，結果以200 mg/mL黃芪甲苷組72 h增殖作用最明顯 （P＜0.05）。黃進等［9］研究表明，黃芪多糖對體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質干細胞，經(jīng)72 h誘導培養(yǎng)后，有促進增殖的作用。其中，以1 mg/mL黃芪多糖促增殖作用最為明顯（P＜0.01），2、3 mg/mL黃芪多糖也具有促進hMSCs增殖的作用（P＜0.05），而5 mg/mL黃芪多糖組hMSCs增殖最少。本課題組通過MTT比色法分析不同質量濃度黃芪注射液對體外培養(yǎng)的hMSCs增殖的影響，結果發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下，低質量濃度的黃芪注射液促進hMSCs的增殖，以50μg/mL黃芪注射液培養(yǎng)hMSCs能表現(xiàn)出更加旺盛的增殖能力 （P＜0.01）；常氧環(huán)境下，低質量濃度的黃芪注射液抑制hMSCs的增殖，300μg/m L的黃芪注射液對hMSCs具明顯促增殖作用 （P＜0.01）。

黃芪是補益藥物中應用最為廣泛的中藥，也是許多中藥復方中的主藥。黃芪性溫味甘，入肺、歸脾經(jīng)，生用能益衛(wèi)固表、托毒生肌、利水消腫；炙用能補中益氣、升陽舉陷。目前對黃芪藥材及含君藥黃芪的中成藥的質量評價均以黃芪皂苷Ⅳ （黃芪甲苷）作為評價的指標［10］。藥理研究表明，黃芪注射液中主要有黃芪皂苷、黃芪酮、黃芪多糖3種不同的化學成分［11］，具有一定免疫調節(jié)、抗病毒、抗氧化、抗突變、抗腫瘤等作用。我國 《本草綱目》記載黃芪可治療一切氣衰、血虛之證。干細胞具先天之精屬性，是先天之精在細胞層次的存在形式［12-14］，中醫(yī)理論認為“氣能生血”、“精血同源”，黃芪補氣、生髓、化血，這為促進hMSCs體外增殖提供了理論依據(jù)。

本研究只是初步探索了低氧條件下黃芪注射液對人骨髓間充質干細胞體外增殖的影響，并且未能以黃芪中提取而得的黃芪皂苷作為平行對照。低氧培養(yǎng)也只用5%的氧氣，未用3%的氧氣培養(yǎng)，繼續(xù)降低氧濃度是否可增加細胞增殖等，還有待于進行更深入的研究。

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R285.5

B

1001-1528（2015）04-0873-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.041

2014-01-29

甘肅中醫(yī)學院中青年科研基金項目 （BH2012-035）

侯 茜（1984—），女，碩士，講師，主要從事中醫(yī)藥基礎研究。Tel：（0931）8765414，E-mail：houqian@gszy.edu.cn