雷 爽， 韓新民，*， 袁海霞， 孫繼超

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇南京210029；2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京210023）

安神定志靈對SHR大鼠前額葉皮質(zhì)去甲腎上腺素alpha 2A受體蛋白表達的影響

雷 爽1， 韓新民1，2*， 袁海霞2， 孫繼超2

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇南京210029；2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京210023）

目的研究安神定志靈對注意缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）動物模型-自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous1y hypertensive rat，SHR）前額葉皮質(zhì)去甲腎上腺素a1pha2A受體（a1pha2A adrenergic receptor，ADRα2A）蛋白表達的影響，探討該藥治療ADHD的作用機制。方法40只自發(fā)性高血壓大鼠隨機分為5組（模型組，托莫西汀組，安神定志靈低、中、高劑量組），每組8只，Wistar京都大鼠（Wistar-Kyoto，WKY）8只作為正常對照組。安神定志靈低、中、高劑量組分別按生藥劑量11.85、23.7、47.4 g/（kg·d）灌胃，每日1次；托莫西汀組以5 mg/（kg·d）給予托莫西汀灌胃，每日1次；模型組和正常對照組每日按體質(zhì)量給予等量生理鹽水灌胃。實驗4周后處死大鼠，采用免疫組化和Western b1ot法檢測各組大鼠前額葉皮質(zhì)腦組織ADRα2A蛋白表達水平。結(jié)果模型組和正常對照組比較，ADRα2A蛋白表達水平顯著降低 （P＜0.05）；托莫西汀組、安神定志靈各劑量組ADRα2A的表達水平均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05），且以安神定志靈中劑量組的ADRα2A蛋白表達最為顯著，與托莫西汀組相比，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。結(jié)論托莫西汀及安神定志靈可以顯著上調(diào)SHR大鼠前額葉皮質(zhì)中ADRα2A蛋白的表達水平，說明前額葉皮質(zhì)去甲腎上腺素a1pha2A受體可能是安神定志靈的作用靶點之一。

安神定志靈；注意缺陷多動障礙；自發(fā)性高血壓大鼠；去甲腎上腺素a1pha2A受體

注意力缺陷多動障礙 （ADHD）是兒童期常見的精神行為障礙性疾病，全球?qū)W齡期兒童及青少年患病率約為5.29%［1］，對個人、家庭和社會產(chǎn)生深遠的負面影響。ADHD的病因及發(fā)病機制復雜，遺傳、環(huán)境、解剖及神經(jīng)遞質(zhì)等是目前研究的熱點。在臨床辨證中，韓新民教授提出該病實證病機多屬 “心肝火旺、痰火內(nèi)擾”，主以 “清心平肝，豁痰開竅，安神定志”為治則。安神定志靈是韓新民教授結(jié)合多年的臨床實踐，以上述治則為指導而形成的驗方，前期臨床研究顯示療效確切［2］。對其實驗作用機制也進行了積極探索，主要集中在多巴胺系統(tǒng)水平上［3-4］。本實驗從去甲腎上腺素角度，選用被認為最具有特征性及目前最合適的自發(fā)性高血壓大鼠動物模型［5］研究安神定志靈對去甲腎上腺素a1pha2A受體蛋白表達的影響，以期進一步探討其作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 SHR大鼠40只，WKY大鼠8只，均為4周齡，雄性，體質(zhì)量65～90 g，清潔級 （北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產(chǎn)許可證 SCXK［京］2012-0001）。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心，自由飲食進水，正式試驗之前適應性飼養(yǎng)5 d。

1.2 藥物 安神定志靈由醋柴胡、黃芩、石菖蒲、益智仁、郁金、炙遠志等藥物組成 （江蘇省中醫(yī)院中藥房），按低、中、高劑量制成水煎劑，生藥質(zhì)量濃度分別為0.592 5、1.185、2.37 g/mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆?；西藥托莫西?（產(chǎn)品批號C165365，英國禮來），用生理鹽水配制成終質(zhì)量濃度0.5 mg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用；生理鹽水 （批號2012042409，南京小營藥業(yè)）。

1.3 主要儀器 電泳槽、Trans-B1ot SD蛋白半干轉(zhuǎn)印儀（美國Bio Rad公司）；面包式離心機、高速臺式冷凍離心機、移液槍 （德國Eppendorf公司）；漩渦振蕩器、轉(zhuǎn)移及水平搖床 （海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；精密天平、pH/酸度儀 （德國Sartorius公司）；制冰機 （美國Scotsman公司）；酶標儀（美國Peking E1mer公司）；Image Quant LAS 4000mini超靈敏化學發(fā)光成像儀（美國GE公司）；石蠟包埋機、全自動組織脫水機、輪轉(zhuǎn)式切片機（德國Leica公司）。

1.4 主要試劑 4%多聚甲醛PBS緩沖液，10%水合氯醛；Envision免疫組化檢測試劑盒 （福建邁新生物技術有限公司）；﹟4970Sβ-actin多克隆抗體 （美國CST）；ab65833 ADRα2A抗體、羊抗兔二抗（美國Abcam）；RIPA裂解液（強）、PMSF、10%十二烷基磺酸鈉 （碧云天生物技術有限公司）；Trish-base、甘氨酸（北京索萊寶）；光明牌脫脂奶粉 （光明乳業(yè)）；2×上樣緩沖液、29∶1丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺混合物、過硫酸銨、PVDF膜（美國Bio Rad）；11-180kDa預染蛋白Marker（中國臺灣Genedirex）；ECL化學發(fā)光底物（美國Thermo）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及處理 40只自發(fā)性高血壓大鼠隨機分為5組：模型組，托莫西汀組，安神定志靈低劑量組、中劑量組、高劑量組。8只WKY大鼠被設為正常對照組。托莫西汀組給予臨床等效劑量5 mg/（kg·d），安神定志靈中劑量為臨床等效劑量23.7 g/（kg·d），低劑量組給藥11.85 g/（kg·d），高劑量組給藥47.4 g/（kg·d）。各組大鼠每日給予灌胃1次，正常組和模型對照組給予同等劑量的生理鹽水灌胃，持續(xù)4周。

2.2 標本制備 各實驗組均在最后1次灌胃后2 h處死，各組1～8號隨機抽出3只動物用10%水合氯醛麻醉處理，充分暴露心臟后，將灌注針頭插入左心室心尖，剪開右心耳，用生理鹽水快速灌注，待肝臟顏色變淡后換4%多聚甲醛的PBS緩沖液緩慢灌注；迅速剝離腦組織，放入固定皿中0.5 cm、1 cm處冠狀切為前、中、后三段，4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后進行石蠟包埋及冠狀切片 （厚度4～6μm）。

各組剩余大鼠用10%水合氯醛麻醉后斷頭取腦，放入冰冷生理鹽水中沖洗干凈，冰臺上迅速分離出大腦兩側(cè)的前額葉皮質(zhì)，放入相應編號的凍存管中，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 免疫組織化學法 取常規(guī)前額葉石蠟切片，每組各10張，主要步驟如下：常規(guī)脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，先后加入復合消化液消化、抗原修復液修復、正常山羊血清封閉液封閉，然后滴加ADRα2A一抗，37℃孵育2 h，滴加生物素化二抗，37℃孵育1 h，滴加SABC于37℃放置30 min，采用DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。200倍顯微鏡下觀察結(jié)果，以淡黃色或棕黃色顆粒染色為陽性表達。每張切片隨機選取5個視野，采用Image-Pro P1us 6.0圖像分析軟件，以平均光密度值（mean density）表示各組ADRα2A蛋白的相對表達量。

2.4 Western b1ot法 按每20 mg前額葉皮質(zhì)腦組織加入150～250μL RIAP裂解液與PMSF混合液（比例為100∶1），球磨儀研磨，冰上裂解30min后，4℃下15 000 r/min離心30min，取上清，即為所取組織總蛋白。采用BCA法測定相應蛋白定量并調(diào)平，2×上樣緩沖液混勻后行蛋白變性，-70℃冰箱儲存?zhèn)溆?。分別用5%濃縮膠及10%分離膠SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)印，5%TBST脫脂奶粉封閉室溫2 h，加入兔源ADRα2A一抗 （1∶500）4℃孵育過夜，羊抗兔二抗 （1∶5 000）室溫孵育2 h，ECL法顯色，Image Quant LAS 4000 mini超靈敏化學發(fā)光成像儀成像。采用Adobe Photoshop CS5軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示ADRα2A蛋白的相對表達水平。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以表示，采用單因素方差分析及LSD法兩兩比較，對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 免疫組化結(jié)果 免疫組化顯示，模型SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A陽性黃染顆粒低于正常WKY大鼠，經(jīng)單因素方差分析及LSD法兩兩比較，二者平均光密度值差異有統(tǒng)計學意義 （P=0.035＜0.05）；托莫西汀組、安神定志靈低劑量、中劑量、高劑量組的ADRα2A的陽性表達均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05），且安神定志靈中劑量組的ADRα2A蛋白表達高于托莫西汀組，差異有統(tǒng)計學意義 （P=0.046）。見圖1、表1。

圖1 WKY大鼠、SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A蛋白的免疫組化染色（×200）

表1 WKY大鼠、SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A免疫組化陽性表達水平 （，n=3）

表1 WKY大鼠、SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A免疫組化陽性表達水平 （，n=3）

注：與正常組比較，ΔP＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與托莫西汀組比較，▲P＜0.05

組別 劑量 平均光密度值（MD） F值 P值正常組 —— 0.080±0.008模型組 —— 0.069±0.004△托莫西汀組 5 mg/（kg·d） 0.080±0.009*中藥低劑量組11.85 g/（kg·d） 0.082±0.008*中藥中劑量組 23.7 g/（kg·d） 0.090±0.012*▲中藥高劑量組47.4 g/（kg·d） 0.082±0.010*3.947 0.007

3.2 Western b1ot結(jié)果 安神定志靈對ADHD模型SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A蛋白表達的影響，見圖2、表2。ADRα2A/β-actin灰度值比經(jīng)單因素方差分析顯示F= 197.731，P=0.000，可認為各組間ADRα2A蛋白表達水平不全相等。LSD法組間兩兩比較顯示，模型組SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A蛋白的表達明顯低于正常組WKY大鼠（P=0.011）；托莫西汀組的ADRα2A蛋白表達與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義 （P=0.001），而安神定志靈低劑量、中劑量、高劑量組ADRα2A蛋白表達水平均顯著優(yōu)于模型組，尤以安神定志靈中劑量組的ADRα2A蛋白表達最為顯著，與其他各組相比，差異均有統(tǒng)計學意義 （P=0.000＜0.01）。

圖2 WKY大鼠、SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A蛋白表達顯影

表2 WKY大鼠、SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A蛋白相對表達水平 （，n=5）

表2 WKY大鼠、SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A蛋白相對表達水平 （，n=5）

注：與正常組比較，ΔP＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與托莫西汀組比較，▲P＜0.05

組別 劑量 ADRα2A/β-actin灰度值比 F值 P值正常組 —— 0.702±0.018模型組 —— 0.652±0.030△托莫西汀組 5 mg/（kg·d） 0.722±0.007*中藥低劑量組 11.85 g/（kg·d）0.976±0.015*▲中藥中劑量組 23.7 g/（kg·d） 1.065±0.022*▲中藥高劑量組 47.4 g/（kg·d） 0.796±0.023*▲197.731 0.000

4 討論

注意力缺陷多動障礙的病因及發(fā)病機制復雜，有學者認為ADHD的病理生理與中樞系統(tǒng)去甲腎上腺素的調(diào)節(jié)異常有關，并提出NE通路的變化可能導致ADHD前額葉環(huán)路的調(diào)節(jié)異常［6］。研究已表明，大腦內(nèi)NE神經(jīng)元可調(diào)節(jié)注意力、學習和記憶、情緒、意識、睡眠-覺醒周期、警覺、焦慮和疼痛等。而ADHD患兒常常存在注意力、學習和記憶、睡眠、情緒障礙等癥狀，這也表明NE系統(tǒng)與ADHD的發(fā)病關系密切。

NE通過不同的受體和信號通路，調(diào)控前額葉皮質(zhì)的功能，包括α1、α2和β三類腎上腺素受體。NE對α2受體有高親和性，而對α1受體和β受體的親和性較低［7］。Ramos等［8］指出前額葉皮質(zhì)α2受體對活動和注意力有重要作用。Arnsten等［9］指出α2腎上腺素受體包括α2A、α2B、α2C三種亞型，α2A和α2C腎上腺素受體分布廣泛，包括前額葉，而α2B腎上腺素受體則在丘腦分布最多。前額葉的工作記憶功能是通過激活α2A腎上腺素受體而改善，如治療ADHD的胍法辛即為選擇性α2A腎上腺素受體激動劑［10］。越來越多的研究提出前額葉皮質(zhì)α2A腎上腺素受體功能的低下可能是導致ADHD的病理機制之一，可作為ADHD的潛在藥物治療靶點［11-12］。

經(jīng)過長期的臨床研究，我們提出 “心肝火旺證”是ADHD主要證型，其發(fā)病機制主要是心肝火旺，陽亢陰虛，陰陽失衡，神失所藏，魂不守舍，志無所定；其治療以“清心平肝，豁痰開竅，安神定志”為主，以達到陰平陽秘的治療目的。安神定志靈是針對ADHD心肝火旺證而設立的，其組成為：醋柴胡，黃芩，連翹，廣郁金，決明子，天竺黃，石菖蒲，鉤藤 （后下），全當歸，生地，益智仁，炙遠志。方中黃芩、連翹清心瀉火；醋柴胡、廣郁金疏肝解郁散熱；決明子清泄肝火，平潛肝陽，泄熱通便；天竺黃清化無形之痰；鉤藤平肝息風止痙；石菖蒲豁痰開竅；當歸養(yǎng)血活血，滋潤肝陰，潤腸通便；生地滋補肝腎；益智仁補腎益智；炙遠志祛痰開竅，寧心安神。諸藥合用共奏清心平肝、豁痰開竅、安神定志之功，使心火得清，肝陽得平，肝腎得補，陰陽得調(diào)，從而消除多動、注意力不集中等癥［13］。

本實驗選擇目前臨床療效確切的非中樞興奮藥托莫西汀作為藥物對照，Bymaster等［14］提出其作用機制是通過選擇性抑制去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體，提高突觸間隙NE水平來發(fā)揮治療作用。本實驗結(jié)果顯示，模型組SHR大鼠前額葉皮質(zhì)α2A腎上腺素受體蛋白表達明顯低于正常對照WKY大鼠，說明α2A腎上腺素受體與ADHD發(fā)病有關。而托莫西汀、安神定志靈低、中、高劑量均可以顯著上調(diào)α2A腎上腺素受體蛋白表達水平，且中劑量α2A腎上腺素受體蛋白表達水平高于托莫西汀，說明前額葉皮質(zhì)α2A腎上腺素受體可能是安神定志靈的作用靶點之一。

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R285.5

B

1001-1528（2015）08-1832-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.045

2014-04-12

國家級重點學科南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)兒科學科第二期開放研究課題 （EZK2012009）；江蘇省2012年度普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目（CXZZ12-0613）

雷 爽 （1986—），女，醫(yī)學博士，研究方向為中醫(yī)藥防治小兒神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病。Te1：（025）86617141，E-mai1：1eishuanghaohao@126.com

*通信作者：韓新民 （1957—），男，教授，主任醫(yī)師，研究方向為中醫(yī)藥防治小兒神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病。Te1：（025）86798182，E-mai1：hxm1nj@163.com