王文靜，賀 婧，姜婷婷，李勵珺，黃羅生，富志軍（中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院 南京 211198）

結(jié)合藥效學(xué)指標(biāo)用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選濕迪膠囊的提取工藝

王文靜，賀 婧，姜婷婷，李勵珺，黃羅生＊，富志軍＊（中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院 南京 211198）

目的 篩選濕迪膠囊處方的最佳提取工藝條件。方法 以小檗堿、黃芩苷、總氮含量和腫脹抑制率為評價指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選出濕迪膠囊的最佳提取工藝。結(jié)果 以有效成分含量為指標(biāo)確定提取方法為：6倍量水，提取2次，每次1h；以腫脹抑制率為指標(biāo)確定提取方法為：9倍量水，提取2次，每次2h。而二者之間無相關(guān)性，最終以后者確定工藝條件為：加9倍量水，提取2次，每次2h。結(jié)論 結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行，具有藥物有效成分與功能主治密切結(jié)合的特點(diǎn)，為濕迪處方提取工藝提供依據(jù)。

濕迪膠囊；正交實(shí)驗(yàn)；棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)；高效液相色譜法；提取工藝

濕迪膠囊處方由黃柏、黃芩及蜈蚣組成，為臨床名醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方，湯劑療效顯著，具有清熱燥濕、息風(fēng)止痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛的功效，用于治療由于肝腎虧虛、陽氣不足、腠理不密、衛(wèi)外不固，以致風(fēng)、寒、濕、邪乘虛而入，引起局部氣血痹阻不暢所致的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［1］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)［2］，以棉球肉芽腫炎癥抑制率作為藥效指標(biāo)；根據(jù)膠囊中各藥味作用、化學(xué)成分的性質(zhì)，采用正交實(shí)驗(yàn)對濕迪膠囊的提取工藝進(jìn)行篩選，探討該復(fù)方中化學(xué)成分含量與藥效學(xué)指標(biāo)間的相關(guān)性，確保提取方法的可靠性，為該處方的劑型開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Shimadzu LC2010－HT高效液相色譜儀（日本島津科技有限公司）；Sartrius A210P天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；AE240電子天平（瑞士梅特勒－托利多儀器有限公司）；R－202旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申騰生物科技有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵SHB－ⅢA（河南省太康科教器材廠）；KH－250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；EPED－20TF實(shí)驗(yàn)室級純水機(jī)（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）；真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥 黃柏、黃芩、蜈蚣均購于江蘇省醫(yī)藥公司，經(jīng)中國藥科大學(xué)中藥炮制教研室張春鳳教授鑒定，均符合2010年版《中國藥典》一部藥材項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定；鹽酸小檗堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110713－201326）；黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110715－201318）；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；其余均為分析純。

1.3 動物 ICR小鼠，清潔級，體質(zhì)量18～22g，由江蘇省南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 傳統(tǒng)中藥常采用水煎煮法提取以保持復(fù)方的組成結(jié)構(gòu)，發(fā)揮多成分的協(xié)同作用。在預(yù)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)基礎(chǔ)上［3］，選取加水量、煎煮次數(shù)和提取時間為考察因素。按處方比例稱取全方共135g，水煎煮過濾，合并濾液，濃縮后加入無水乙醇，使醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，靜置24h，過濾，濾液回收乙醇，置于80℃水浴鍋上濃縮至稠膏，減壓干燥，粉碎得細(xì)粉以備用，測定黃芩苷、小檗堿及總氮含量；取水提醇沉溶液，濃縮至1g生藥／mL，即得藥效考察樣品。

2.2 鹽酸小檗堿和黃芩苷含量測定方法的建立［4－5］

2.2.1 色譜條件 Wondasil C18色譜柱（250mm× 4.6mm，5μm）；以乙腈－0.033mol·L－1KH2PO4（磷酸調(diào)pH3.0，25∶75）為流動相；流速為1.0mL·min－1；檢測波長270nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù)按黃芩苷和鹽酸小檗堿計(jì)算均不低于7 000。色譜圖見圖1。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取黃芩苷對照品30.32mg和鹽酸小檗堿對照品（在五氧化二磷干燥器中減壓干燥12h）7.14mg，置于50mL量瓶中，加入甲醇適量使超聲溶解30min，定容，搖勻，制成含黃芩苷0.606 4g·L－1和小檗堿0.142 8 g·L－1混合對照品溶液，作為儲備溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取9份正交實(shí)驗(yàn)所得干浸膏粉末約0.03g，置于50mL量瓶中，加適量甲醇，超聲30min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，按照上述色譜條件進(jìn)樣。

圖1 HPLC圖A.混合對照品；B.供試品；C.缺黃芩陰性對照；D.缺黃柏陰性對照；1.黃芩苷；2.小檗堿Fig.1 HPLC chromatagramsA.mixture standards；B.samples；C.Scutellaria nagative sample；D.Phellodendri nagative sample；1.baicalin；2.berberine

2.2.4 線性關(guān)系的考察 分別精密量取混合對照品溶液0.2，0.8，2，4，8和10mL，用甲醇定容于25mL量瓶中，搖勻，在上述色譜條件下進(jìn)樣，分別測定黃芩苷和鹽酸小檗堿的峰面積，記錄峰面積，以二者峰面積（Y）、對照品質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸。線性方程：黃芩苷為Y1＝19 190 X1＋12 567，r＝0.999 9，在0.004 5～0.226 3g·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；鹽酸小檗堿為Y2＝28 375 X2＋1 787.3，r＝0.999 9，在0.001 1～0.057 1g·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液（黃芩苷93.01mg·L－1、鹽酸小檗堿14.34mg·L－1）10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算黃芩苷、小檗堿峰面積的RSD分別為0.43%和0.38%，表明在此條件下儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取正交實(shí)驗(yàn)中1號樣品，研細(xì)，精密量取粉末約0.05g，共6份，置于100mL量瓶中，按2.2.3項(xiàng)下方法制備，在上述色譜條件下，進(jìn)樣，記錄色譜圖。黃芩苷和小檗堿的峰面積RSD分別為1.37%和2.19%，結(jié)果表明，此方法有較好的重復(fù)性。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取重復(fù)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下1號樣品，分別于放置0，3，6和9h后進(jìn)行測定，進(jìn)樣10μL，共進(jìn)樣4次，測定其穩(wěn)定性，黃芩苷和小檗堿的峰面積RSD分別為1.52%和1.77%，結(jié)果表明在9h內(nèi)樣品的穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的浸膏粉樣品0.03g，置于25mL量瓶中，精密加入0.038 8g·L－1黃芩苷對照品溶液1mL和0.005 67g·L－1鹽酸小檗堿對照品溶液1mL，按2.2.3項(xiàng)下方法制備，平行6份，記錄黃芩苷和小檗堿的峰面積，分別帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃芩苷和小檗堿的平均回收率分別為100.6%和98.68%，RSD分別為3.63%和3.36%。

2.3 總氮含量的測定 稱取9組正交實(shí)驗(yàn)干燥的粉末提取物適量，采用凱氏定氮法測定不同提取條件下處方中總氮含量，該測定實(shí)驗(yàn)委托江蘇省理化測試中心完成。

2.4 棉球肉芽腫形成實(shí)驗(yàn)［6］

2.4.1 無菌棉球的制備 用脫脂棉制成質(zhì)量10± 0.5mg的小棉球，于121℃、0.1kPa下高溫濕熱滅菌20min。取出后于60℃下干燥24h，無菌儲藏備用。

2.4.2 致炎方法 取雄性ICR小鼠，以10mL·kg－1的劑量腹腔注射40g·L－1水合氯醛進(jìn)行麻醉。背部剪毛后進(jìn)行常規(guī)碘酊消毒，酒精脫碘，切開皮膚，在雙側(cè)后肢根部位皮下各植入一粒無菌棉球，確定所植入棉球的形狀與位置后縫合皮膚。隨后肌肉注射青霉素鈉（5萬單位／只）防止感染。

2.4.3 分組與藥物劑量 手術(shù)當(dāng)天，動物全部蘇醒后剔除死亡及狀態(tài)虛弱的個體，將剩余動物按體質(zhì)量隨機(jī)分為10組：模型組（給予蒸餾水）、樣品組（給藥劑量均為4.50g·kg－1），每組9只。以20mL·kg－1等容積灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7d。

2.4.4 測定方法 于第8日將小鼠脊椎脫臼法處死，剝?nèi)》蛛x棉球及其周圍肉芽組織，并于60℃下烘干24h至恒質(zhì)量并精密稱質(zhì)量。

2.4.5 計(jì)算公式［7］

肉芽組織質(zhì)量（mg）＝棉球干質(zhì)量－棉球質(zhì)量炎癥抑制率（%）＝［（對照組肉芽組織平均質(zhì)量－給藥組肉芽組織平均質(zhì)量）／對照組肉芽組織平均質(zhì)量］×100%

2.5 結(jié)果分析 本實(shí)驗(yàn)選用L9（34）正交表，以黃芩苷、小檗堿、總氮含量及炎癥抑制率為考察指標(biāo)，化學(xué)指標(biāo)評分公式＝ （小檗堿含量／最高組小檗堿含量× 0.4＋黃芩苷含量／最高組黃芩苷含量×0.3＋總氮含量／最高組總氮含量×0.3）×100。實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表1，抗炎抑制率方差分析見表2。

表1 濕迪膠囊提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Result of orthogonal test of extraction process of Shidi Capusles

表2 腫脹抑制率方差分析結(jié)果Tab.2 Variance analysis of the swelling inhibition rate

本實(shí)驗(yàn)將藥效實(shí)驗(yàn)中的炎癥抑制率與黃芩苷含量、小檗堿含量、總氮含量相結(jié)合，正交實(shí)驗(yàn)中評價指標(biāo)較多，結(jié)合化學(xué)指標(biāo)綜合加權(quán)法和藥效學(xué)腫脹抑制率進(jìn)行評價，結(jié)果有效成分含量與炎癥抑制率間無明顯相關(guān)性，為獲得較好的臨床療效，最終以藥效學(xué)為評價指標(biāo)確定最佳的提取工藝條件。

以炎癥抑制率為評價指標(biāo)，方差分析結(jié)果表明，影響因素的主次順序?yàn)锳＞B＞C，其中A對抑制率影響最大，并具有顯著性意義。因此確定提取條件為A2B2C2，即以9倍量水提取2次，每次2h。

2.6 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按處方比例稱取各藥材3份，以最佳工藝條件進(jìn)行提取，按2.4項(xiàng)下方法測定，計(jì)算炎癥抑制率分別為41.0%，43.4%和42.3%，RSD為1.31%，表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

目前在對中藥復(fù)方提取工藝的研究中，大多數(shù)采用單一有效成分或有效部位含量作為指標(biāo)進(jìn)行工藝篩選，但這些化學(xué)成分含量的高低往往難以代表整個復(fù)方的藥效。濕迪處方中所含生物堿類小檗堿具有抗炎及免疫抑制等功效，在歷代治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎復(fù)方中廣泛應(yīng)用，而黃酮類成分黃芩苷和氨基酸類成分分別在抗菌、鎮(zhèn)痛方面較為常用，權(quán)衡三者在該復(fù)方中的作用，本研究以有效成分小檗堿、黃芩苷含量及總氮含量的綜合評分為指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)分別為0.4，0.3和0.3，并結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，使提取工藝更趨科學(xué)、合理。但由于有效成分含量結(jié)果和藥效結(jié)果之間無相關(guān)性，最終以抗炎藥效作用為考察指標(biāo)，達(dá)到盡可能保證中藥復(fù)方提取物療效的目的。

中藥是一個有效成分群組合，并以多靶點(diǎn)、多途徑作用于人體，其藥效是有效成分群之間組合協(xié)同作用的結(jié)果［8］。因此，為保證有效成分的提取率和中藥復(fù)方的整體藥效，提取工藝應(yīng)從藥效出發(fā)篩選工藝，不僅能克服傳統(tǒng)中藥提取從理化性質(zhì)出發(fā)的不足，而且還能認(rèn)識到藥效評價才是確保中藥提取工藝先進(jìn)和有效的依據(jù)。中藥復(fù)方的某些化學(xué)成分能否代表整個復(fù)方的藥效值得深入研究，藥效學(xué)指標(biāo)和化學(xué)指標(biāo)之間是否存在某些相關(guān)性仍需進(jìn)一步探討。

［1］柳春，陳麗，梁永林.中藥復(fù)方治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的規(guī)律及其Logistic回歸模型［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（21）：1－5

［2］黎迎，杜守穎，陸洋，等.正交實(shí)驗(yàn)結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)優(yōu)選復(fù)方南星止痛膏處方提取工藝［J］.中國中藥雜志，2013，38（16）：2590－2593.

［3］牛陽，張霞，王榮，等.八珍益智顆粒提取工藝研究［J］.西北藥學(xué)雜志，2012，27（4）：294－296.

［4］張婷婷，趙軍，楊蒙蒙，等.HPLC法同時測定中藥復(fù)方乳膏中鹽酸小檗堿和阿魏酸的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2014，29（3）：245－247.

［5］金良，李亞男，張秋燕，等.連梅飲中黃芩苷和小檗堿的含量測定［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2009，11（12）：32－34.

［6］蘇鑫，宮曉燕.新扶正除疫顆粒對小鼠耳廓腫脹及大鼠肉芽腫的實(shí)驗(yàn)研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2014，25（10）：2334－2335.

［7］張麗，薛國娜，朱鐳，等.消痤膠囊治療痤瘡抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，20（11）：10－12

［8］張鐵軍.中藥質(zhì)量認(rèn)識與質(zhì)量評價［J］.中草藥，2011，42（1）：1－9.

Optimization of the extraction process of Shidi Capsules by orthogonal test with pharmacodynamics index

WANG Wenjing，HE Jing，JIANG Tingting，LI Lijun，HUANG Luosheng＊，F(xiàn)U Zhijun＊（Traditional Chinese Medicine College，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China）

Objective To optimize the extraction process of Shidi Capsules.Method The extraction process conditions of Shidi Capsules were optimized by an orthogonal test and pharmacodynamics test.The contents of berberine，baicalin，and the total nitrogen，and the anti－inflammatory results were used as the evaluated indexes.Result The optimal extracting conditions were as follows：extracted two times with 6fold amount of water，1heach time.If using swelling inhibitory rate as the evaluating index，extracted two times with 9fold amount of water，2heach time.There was no relationship between the two methods.Conclusion Combined the orthogonal test and pharmacodynamic test to optimize the extraction process has the advantages of stable and practical，which was suitable for the extraction of Shidi Capsules.

Shidi Capsules；orthogonal test；tampon granuloma test；HPLC；extraction process

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.003

R284

A

1004－2407（2015）04－0337－04

2015－03－18）

國家科技重大專項(xiàng)（編號：2013ZX09301303001007）

王文靜，女，在讀碩士研究生

＊通信作者：黃羅生，男，副研究員；富志軍，男，副教授