李 萍，李衛(wèi)燕，曹 蔚（第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室，西安 710032）

·綜述·

酶解技術(shù)在多糖結(jié)構(gòu)和活性研究中的應(yīng)用進(jìn)展

李 萍，李衛(wèi)燕，曹 蔚＊（第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室，西安 710032）

目的 總結(jié)幾種常用酶在多糖結(jié)構(gòu)和活性研究中的應(yīng)用進(jìn)展。方法 查閱分析相關(guān)資料文獻(xiàn)并綜述。結(jié)果 酶解主要用于多糖的初級結(jié)構(gòu)分析。酶解后，多糖的異頭碳構(gòu)型發(fā)生變化，且酶解后多糖片段的活性有所改變。結(jié)論 酶解技術(shù)在多糖結(jié)構(gòu)研究以及活性多糖研究開發(fā)方面有著重要的作用。

多糖；結(jié)構(gòu)；活性；酶解技術(shù)

多糖（polysaccharide）是由醛糖或酮糖通過苷鍵連接在一起的多聚物，廣泛存在于植物、動物和微生物中，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一。目前已報道，多糖具有抗病毒、抗凝血、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、抗輻射、抗糖尿病、護(hù)肝、抗骨質(zhì)疏松癥、抗疲勞、抗動脈粥樣硬化等生物活性［1－4］。

研究發(fā)現(xiàn)，多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。多糖結(jié)構(gòu)的分析方法主要有3種：化學(xué)分析法、儀器分析法和生物學(xué)方法。多糖的生物學(xué)分析方法主要包括酶學(xué)方法和免疫學(xué)方法。本文主要對酶解技術(shù)在多糖結(jié)構(gòu)和活性研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 多糖的結(jié)構(gòu)

多糖的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，分為初級結(jié)構(gòu)（一級結(jié)構(gòu)）和高級結(jié)構(gòu)（二、三、四級結(jié)構(gòu)）。多糖的一級結(jié)構(gòu)是指相對分子質(zhì)量、單糖組成及比例、糖環(huán)形式（吡喃環(huán)或呋喃環(huán)）、單糖殘基類型及糖苷鍵連接位點(diǎn)、糖苷取代的異頭異構(gòu)形式（α－或β－）等；二級結(jié)構(gòu)是指多糖骨架鏈間以氫鍵為主要次級鍵而形成的有規(guī)則的構(gòu)象［5］；三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)是指以二級結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，由于糖單位之間的非共價相互作用，導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)在有序的空間里產(chǎn)生的有規(guī)則的構(gòu)象［6］。目前國內(nèi)外對多糖的結(jié)構(gòu)研究主要集中在一級結(jié)構(gòu)的研究上。

2 酶解技術(shù)在多糖結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用

酶學(xué)方法即利用各種特異性糖苷酶水解多糖分子得到寡糖片段，通過分析寡糖片段的結(jié)構(gòu)來推測多糖的結(jié)構(gòu)，主要用于糖鏈結(jié)構(gòu)的分析［7］。而在酶解法中，因為酶具有特異性，可選擇性地酶解切斷特定糖苷鍵，從而對多糖專一降解，制得特定聚合度的寡糖［8］。目前，多糖結(jié)構(gòu)研究中常用的酶有果膠酶、殼聚糖酶、纖維素酶等。

2.1 果膠酶 果膠的基本結(jié)構(gòu)是半乳糖醛酸以α－（1－4）－糖苷鍵聚合形成的聚半乳糖醛酸。果膠酶是一類分解果膠質(zhì)的酶的總稱［9］，主要功能是通過裂解或β消去作用切斷果膠質(zhì)中的糖苷鍵，使果膠質(zhì)裂解為多聚半乳糖醛酸［10］?，F(xiàn)一般根據(jù)果膠酶的底物、底物被作用的方式以及切割位點(diǎn)這三類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，如表1所示。

果膠酶基本的作用機(jī)制包括水解作用和反式消去作用。水解作用的酶主要有果膠酯酶（pectin esterase）、原果膠酶（protopectinases）及多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonases）。起反式消去作用的酶是裂解酶（lyase）。

2.1.1 果膠酯酶 果膠酯酶催化果膠的半乳糖醛酸主鏈，將其甲基酯鍵脫酯化，釋放出酸性果膠和甲醇［11］。

2.1.2 原果膠酶 原果膠酶分為A型和B型。A型原果膠酶作用于果膠內(nèi)部區(qū)域的半乳糖醛酸部位；B型原果膠酶作用于果膠外部的連接多聚半乳糖醛酸鏈和細(xì)胞壁成分多糖鏈［11］。

2.1.3 多聚半乳糖醛酸酶 多聚半乳糖醛酸酶特異性水解組成果膠酸的D－半乳糖醛酸－α－（1－4）－糖苷鍵［11］。

2.1.4 裂解酶 裂解酶在果膠酸的C－4上斷開糖苷鍵，同時在C－5消除H，產(chǎn)生△4∶5不飽和產(chǎn)物［11］。

表1 果膠酶的分類Tab.1 The classification of pectinase

2.2 殼聚糖酶 幾丁質(zhì)（chitin）又名甲殼素、甲殼質(zhì)，由N－乙酰－D－葡萄糖胺以β－（1－4）－糖苷鍵相連而成［12］。殼聚糖（chitosan）為幾丁質(zhì)部分或全部脫乙?；蟮难苌铮铅拢?－4）－2－乙酰氨基－D－葡萄糖（N－乙酰－D－葡萄糖胺，N－乙酰氨基葡萄糖，GlcNAc）和β－（1－4）－2－氨基－D－葡萄糖（D－葡萄糖胺，葡萄糖胺，GlcN）的線性共聚物［13］。殼聚糖有以下4種類型，即GlcN－GlcN，GlcNAc－GlcN（還原端為GlcNAc，非還原端為GlcN），GlcN－GlcNAc（還原端為GlcN，非還原端為GlcNAc），GlcNAc－GlcNAc。

殼聚糖酶（chitosanase）可以特異性地切斷殼聚糖的β－（1－4）－糖苷鍵，得到殼聚糖的低聚物。2008年，國際酶命名委員會命名了一個新的酶，外切－β－D－氨基葡萄糖苷酶［14］（EC 3.2.1.165），這種酶也被稱為外切殼聚糖酶和氨基葡萄糖苷酶。這種外切水解酶可降解GlcN－GlcNAc，但對GlcNAc－GlcNAc無降解作用［14］。

根據(jù)底物的細(xì)微差別，殼聚糖酶目前可以分為3個亞類［14］。I類殼聚糖酶作用于GlcN－GlcN和GlcNAc－GlcN；Ⅱ類殼聚糖酶只作用于GlcN－GlcN；Ⅲ類酶作用于GlcN－GlcN和GlcN－GlcNAc。而根據(jù)酶解產(chǎn)物的不同，殼聚糖酶可以分為內(nèi)切殼聚糖酶和外切－β－D－氨基葡萄糖苷酶。前者隨機(jī)切斷殼聚糖鏈，產(chǎn)生相對分子質(zhì)量小的殼寡糖［15］；后者從殼聚糖鏈的非還原性末端順序切下連續(xù)GlcN殘基［16］，得到氨基葡萄糖。大多數(shù)微生物所產(chǎn)殼聚糖酶均為內(nèi)切酶［17］。

2.3 纖維素酶 纖維素作為植物產(chǎn)生的最豐富的碳水化合物，是由β－（1－4）－糖苷鍵與纖維二糖的重復(fù)單元連接的葡萄糖亞單位的線性鏈［18］。纖維素酶是一類水解纖維素的β－（1－4）－糖苷鍵，使其降解為低聚葡萄糖、纖維二糖和葡萄糖的水解酶。

纖維素酶根據(jù)其催化反應(yīng)功能的不同可分為：（Ⅰ）內(nèi)切葡聚糖酶或β－（1－4）－D－葡聚糖－4－葡萄糖水解酶（EC 3.2.1.4），（II）外切葡聚糖酶，包括β－（1－4）－D－葡聚糖－葡萄糖水解酶（EC 3.2.1.74）和β－（1－4）－D－葡聚糖－纖維二糖水解（EC3.2.1.91），（III）β－葡萄糖苷酶或β－葡萄糖苷－葡萄糖水解酶（EC 3.2.1.21）［19］。

目前，纖維素酶降解纖維素的機(jī)制比較公認(rèn)的是協(xié)同理論，該理論認(rèn)為：內(nèi)切酶將結(jié)晶纖維素降解成無定形纖維素，外切酶將纖維素降解成纖維二糖，最后由β－葡萄糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖［20］。但對于內(nèi)切酶和外切酶的作用順序尚未定論。

2.3.1 內(nèi)切葡聚糖酶 內(nèi)切葡聚糖酶，主要作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)域，隨機(jī)切斷β－（1－4）－糖苷鍵，從而降解纖維素，形成纖維寡糖、纖維三糖等短鏈低聚糖［21］。

2.3.2 外切葡聚糖酶 外切葡聚糖酶以一種連續(xù)性的方式作用于纖維素多糖鏈的還原端或非還原端，水解β－（1－4）－糖苷鍵，產(chǎn)生大量葡萄糖（由葡聚糖水解酶酶解得到）或是纖維二糖（由纖維二糖水解酶酶解得到）［19］。外切葡聚糖酶也可以作用于微晶纖維素，從其結(jié)構(gòu)中可切除纖維素鏈［22］。

2.3.3 β－葡萄糖苷酶 β－葡萄糖苷酶可以將寡聚葡萄糖和纖維二糖水解成葡萄糖。

2.4 其他 α－甘露糖苷酶，可外切α－（1－2），α－（1－3）和α－（1－6）甘露糖苷鍵，得到產(chǎn)物甘露單糖；α－淀粉酶（α－（1－4）－glucan－4－glucanohydrolase，EC 3.2.1.20）從淀粉內(nèi)部切開α－（1－4）鍵產(chǎn)生糊精和還原糖；α－葡萄糖苷酶（α－D－glucoside glucohydrodase，EC 3.2.1.20）是糖苷水解酶的一種，從底物的非還原性末端水解底物的α－（1－4）－葡萄糖苷鍵，得到產(chǎn)物α－葡萄糖；α－半乳糖苷酶（α－D－galactoside galactohydrolase，EC 3.2.1.22）水解半乳糖苷化合物的非還原性末端，得到產(chǎn)物α－半乳糖；糖化酶（glucoamylase，EC 3.2.1.3），從糖鏈的非還原性末端順序水解α－（1－4）－葡萄糖苷鏈，釋放出葡萄糖［23］。

3 酶解技術(shù)對多糖活性的影響

研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)多糖酶解后生物活性增強(qiáng)。徐張展等［24］研究顯示，海膽多糖SEP通過α－淀粉酶降解主鏈為α－（1－4）－糖苷鍵的葡聚糖，得到3個或3個以上α－（1－4）－糖苷鍵連接的葡萄糖單元后，其免疫活性增強(qiáng)。Im S等［25］研究了蘆薈多糖通過纖維素酶酶解得到的改性蘆薈多糖（MAP）片段與其免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤活性的關(guān)系，顯示相對分子質(zhì)量介于5× 103和4×105之間的多糖MAP在體內(nèi)具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，且該多糖片段比相對分子質(zhì)量大于4×105和小于5×103的片段對巨噬細(xì)胞的激活作用強(qiáng)。吳婷等［26］研究顯示，葫蘆巴多糖經(jīng)甘露聚糖酶解得到半乳糖甘露聚糖片段，其抗氧化、抗菌活性均增強(qiáng)。Yoshizawa Y等［27］研究發(fā)現(xiàn)，條斑紫菜多糖（PASF）經(jīng)β－瓊膠酶（含Ⅰ、Ⅱ型，β－瓊膠酶裂解瓊脂糖的β－（1－4）－糖苷鍵）降解后，得到的降解產(chǎn)物具有較高的免疫活性。也有研究表明，多糖酶解后活性減少或喪失，如FPP（柑橘果膠熱處理得到的一種商業(yè)果膠）通過內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶（可從果膠酸分子內(nèi)部無規(guī)則地切開α－（1－4）－糖苷鍵）以及果膠甲酯酶（隨機(jī)切除甲酯化果膠中的甲基，產(chǎn)生甲醇和游離羧基）后得到的降解產(chǎn)物基本上無誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性［28］。

4 小結(jié)

多糖廣泛存在于有機(jī)體，具有重要的生物功能，也具有重要的藥用價值。國內(nèi)外已報道了200余種活性多糖，其藥理作用涉及抗凝血、抗腫瘤、抗損傷、抗輻射、抗HIV病毒、調(diào)節(jié)免疫等。繼香菇多糖以來，已有牛膝多糖、云芝多糖、豬苓多糖等相繼用于臨床。改性柑橘果膠（MCP）可與半乳凝素－3（Gal－3）結(jié)合從而抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長［29］。MCP由半乳糖醛酸、鼠李糖和木糖組成，直接溶于水，現(xiàn)已進(jìn)入Ⅲ期臨床抗腫瘤研究。Gal－3是一類能選擇性識別糖結(jié)構(gòu)并與之非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)，它在癌細(xì)胞中高表達(dá)并激活下游信號通路，而此作用又可被多糖阻斷［30］。我們近期的研究顯示，經(jīng)酶解的多種寡糖片段對Gal－3的親和作用可進(jìn)一步增強(qiáng)，呈現(xiàn)顯著的抗腫瘤作用。

酶解技術(shù)在多糖結(jié)構(gòu)分析及活性研究中起著重要的作用。但目前在多糖結(jié)構(gòu)分析以及活性研究中應(yīng)用的酶僅限于部分類型多糖的降解酶，所以開發(fā)利用轉(zhuǎn)移酶、合成酶等新型酶，將豐富酶解技術(shù)在多糖結(jié)構(gòu)分析以及活性研究中的應(yīng)用。

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Application progress of enzymolysis technology in the study of the structure and activity of polysaccharides

LI Ping，LI Weiyan，CAO Wei＊（Department of Natural Medicine，School of Pharmacy，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China）

Objective To summarize the progress of several common enzymes in the structure and activity of polysaccharides.Methods Related articles were reviewed.Results Enzymolysis is mainly used in the elemental structural analysis of the polysaccharides.After enzymolysis，the configuration of anomeric carbon of polysaccharides changed and the active of fragments of polysaccharides varied as well.Conclusion The enzymolysis technology plays an important role in the structural analysis of polysaccharides and the exploitation of active polysaccharides.

polysaccharide；structure；activity；enzymolysis technology

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.036

R284

A

1004－2407（2015）04－0433－04

2014－10－21）

國家自然科學(xué)基金（編號：30701081，81173513，81473329）

李萍，女，碩士研究生

＊通信作者：曹蔚，女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師