金烏云， 邵 琪， 郝 鑫， 鮑牧蘭， 哈斯阿古拉

(內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)牧草與特色作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

甜瓜CmERFIV-5基因cDNA的克隆·表達(dá)分析及載體構(gòu)建

金烏云， 邵 琪， 郝 鑫， 鮑牧蘭， 哈斯阿古拉*

(內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)牧草與特色作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

[目的]研究甜瓜CmERFIV-5基因的克隆、表達(dá)分析及超表達(dá)和RNAi載體構(gòu)建。 [方法]根據(jù)GenBank上登錄的甜瓜一個(gè)乙烯應(yīng)答因子(ethylene responsive facter，ERF)基因cDNA序列 (登錄號(hào)：MELO3C024315) 設(shè)計(jì)合成特異性引物。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從甜瓜品種河套蜜瓜(CucumismeloL. cv. Hetao) 成熟果實(shí)中克隆得到該基因cDNA序列，命名為CmERFIV-5，分析了該基因在甜瓜根、莖、葉及果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特性，將其構(gòu)建到過(guò)量表達(dá)載體pPZP221中，得到重組植物表達(dá)載體pPZP221-CmERFIV-5。同時(shí)，構(gòu)建了該基因RNAi載體pART-27-CmERFIV-5。[結(jié)果]序列分析顯示，所克隆的cDNA長(zhǎng)度為808bp，編碼255個(gè)氨基酸。熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析表明，CmERFIV-5基因在甜瓜根、莖、葉及不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)中均有表達(dá)，在葉片中表達(dá)量最高。[結(jié)論] 構(gòu)建了CmERFIV-5基因的過(guò)量表達(dá)載體與RNAi載體，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

甜瓜；乙烯應(yīng)答因子；乙烯；表達(dá)；CmERFIV-5

乙烯是一種含2個(gè)碳原子的氣體分子，又是一種具有生物活性的氣體植物激素。1934年，Gane[1]研究證明了乙烯是植物生長(zhǎng)發(fā)育的內(nèi)源調(diào)節(jié)劑。作為植物五大類激素中的一員，乙烯參與并調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的許多生理過(guò)程，如種子萌發(fā)、葉片衰老、根系生長(zhǎng)、果實(shí)成熟、器官衰老、應(yīng)答生物及非生物脅迫等[2-3]，其中乙烯在果實(shí)成熟衰老進(jìn)程中的作用是研究重點(diǎn)之一。乙烯最有代表性的生物學(xué)反應(yīng)是“三重反應(yīng)”，由于“三重反應(yīng)” 發(fā)生在植物發(fā)育的早期且是乙烯的特異反應(yīng)，有利于大規(guī)模篩選乙烯突變體[4]。由此科學(xué)家們利用各種突變體材料克隆得到眾多乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件基因，建立了從信號(hào)感知到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的大致線性模型，即乙烯→乙烯受體→CTR1→EIN2 →EIN3/EILs→ERF→乙烯反應(yīng)[5]。

AP2/ERF是一類有眾多成員的轉(zhuǎn)錄因子超家族，根據(jù)其序列的相似性和AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，其分為 AP2、ERF和RAV 3個(gè)家族[6]。ERF家族又因所結(jié)合的順式作用元件的不同將其分為兩大類，第一類能與GCC盒結(jié)合，稱為ERF 亞家族[7]；第二類能與DRE/CRT結(jié)合，稱為CBF/DREB 亞家族[8]。此外，還有一些比較特殊的 ERF 轉(zhuǎn)錄因子，如煙草的Tsil既能與GCC盒特異性結(jié)合，又能與DRE/CRT特異性結(jié)合[9]。

甜瓜(CucumismelonL.)是一種色、香、味俱全的水果，是世界十大水果之一。2012年完成了甜瓜全基因組測(cè)序[10]，為甜瓜功能基因組研究奠定了基礎(chǔ)。Ma等[11]在甜瓜全基因組中對(duì)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族成員進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)有136個(gè)成員，其中ERF家族最多，包含119個(gè)成員，聚類分析可將其分成11個(gè)群。筆者對(duì)第4個(gè)群的第5個(gè)成員的基因CmERFIV-5 cDNA進(jìn)行了克隆和表達(dá)特性分析，構(gòu)建了CmERFIV-5 基因過(guò)量表達(dá)載體與RNAi載體。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑所用植物材料為內(nèi)蒙古地方甜瓜品種河套蜜瓜，原種由內(nèi)蒙古自治區(qū)牧草與特色作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。采摘九成熟果實(shí)，取中果皮組織于液氮速凍，-80 ℃保存，用于基因克隆。采摘授粉后0、10、20、30、40 d的果實(shí)，取中果皮組織，于液氮速凍。選取甜瓜子房及30日齡根、莖、葉等不同組織,于液氮速凍，用于分析CmERFIV-5 基因的表達(dá)特性，為保證數(shù)據(jù)的可靠性，每天9：00采集樣品，采樣生物學(xué)重復(fù)3次。

RNA提取試劑盒RNAiso Plus (Total RNA extraction reagent)克隆載體pEasy?-Blunt、T4DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶、氨芐青霉素、DNAmarker、Prime-STARTMHS DNA 聚合酶、dNTPs以及SYBR?PremixExTaqTM實(shí)時(shí)定量 PCR 試劑盒等購(gòu)自大連寶生物公司；TransStart?Pfu DNA Polymerase購(gòu)自北京全氏金生物技術(shù)有限公司；AMV第一鏈cDNA合成試劑盒；柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒、柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)GenBank上登錄的甜瓜一個(gè)乙烯應(yīng)答因子(ethylene responsive facter，ERF)基因cDNA序列(登錄號(hào)：MELO3C024315)和甜瓜甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)基因cDNA序列(序列號(hào)：AB033600)，使用Primer Premier 5.0分別設(shè)計(jì)引物。目的基因克隆引物P1：5′-GCTCTAGACACTCAGCTgTTTGTGTTTTCC-3′ (下劃線部分為XbaⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn))和P2：5′-TAGGTACCCAACATCAGAAGAAGCTGGACT-3′(下劃線部分為KpnⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn))。目的基因定量PCR檢測(cè)引物P3：5′-GGCTTCATTCCGCCGACTC-3′和P4：5′-GCTCCTCCACATCAAATTCCAAA-3′。內(nèi)參基因定量PCR檢測(cè)引物P5：5′-ATCATTCCTAGCAGCACTGG-3′和P6：5′-TTGGCATCAAATATGCTTGACCTG-3′及RNAi載體構(gòu)建引物P7：5′-TAGGATCCGAGGTGCTATAATCTCCGGCTT-3′(下劃線部分為BamHⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn))、P8：5′-GAATCGATGAGCTGAAGGAACAGGAGGGT-3′(下劃線部分為ClaⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn))、P9：5′-CAGGTACCGAGGTGCTATAATCTCCGGCTT-3′(下劃線部分為KpnⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn))、P10：5′-TACTCGAGGAGCTGAAGGAACAGGAGGGT-3′(下劃線部分為XhoⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn))，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2總RNA 提取及cDNA第一鏈的合成。采用TaKaRaTM公司RNAiso Plus試劑提取甜瓜總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ? μl總RNA為模板，按照AMV第一鏈cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。1.2.3cDNA PCR擴(kuò)增、克隆及序列分析。以cDNA第一鏈為模板，P1、P2為引物，用Prime-STARTMHS DNA 聚合酶PCR擴(kuò)增，采用 25 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性20 s，51 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸補(bǔ)平5 min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物純化后與pEasy?-Blunt克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。克隆得到的該基因cDNA序列，命名為CmERFIV-5。

將得到的測(cè)序結(jié)果與甜瓜基因庫(kù)(https://melonomics.net/)中的甜瓜ERF基因MELO3C024315序列比對(duì)，通過(guò)ORF Finder(http://www.ncbi.n lm.nih.gov/gorf.html)對(duì)CmERFIV-5序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框分析。

1.2.4基因表達(dá)特性分析。按照RNAisoPlus試劑盒說(shuō)明書(shū)提取甜瓜授粉后0、10、20、30、40 d果肉總RNA。采集1/2MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)37 d甜瓜植株第五六片真葉、第五六片真葉間的莖段以及根樣品，提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，分別用P3和P4、P5和P6為引物，SYBR?PrimixExTaqTM實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行定量PCR分析，PCR程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃延長(zhǎng)30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，數(shù)據(jù)采用2-△△CT方法進(jìn)行分析[12]。將授粉后第0天的甜瓜果實(shí)基因表達(dá)量設(shè)定為1，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SE)來(lái)自3個(gè)生物重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.2.5過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建。利用XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)將克隆好的CmERFIV-5基因cDNA插入植物雙元表達(dá)載體pPZP221的相應(yīng)多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建過(guò)量表達(dá)載體pPZP221-CmERFIV-5。

1.2.6RNAi載體的構(gòu)建。分別用P7和P8、P9和P10兩對(duì)引物擴(kuò)增CmERFIV-5基因cDNA ORF 179～445 bp的片段，雙酶切后，分別重組到中間載體pKANNIBAL的PDK內(nèi)含子的兩側(cè)，構(gòu)建成RNAi中間載體pKAN-CmERFIV-5；再利用NotⅠ酶切位點(diǎn)將pKAN-CmERFIV-5載體上的“正向序列-PDK序列-反向序列”插入到植物表達(dá)載體pART-27的NotⅠ酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成RNAi載體pART-27-CmERFIV-5。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA克隆及序列分析經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到約800 bp的特異性條帶，與預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果與甜瓜基因庫(kù)(https://melonomics.net/)中MELO3C024315序列相似度高達(dá)100%。用NCBI的ORF Finder軟件在線分析克隆序列，表明所克隆CmERFIV-5基因的cDNA全長(zhǎng)808 bp，5′非編碼區(qū)長(zhǎng)35 bp，3′編碼翻譯區(qū)長(zhǎng)5 bp，預(yù)測(cè)的ORF為768bp，編碼255個(gè)氨基酸(圖1)。

2.2 基因的表達(dá)特性分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明(圖2)，CmERFIV-5基因在甜瓜根、莖、葉及不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)中均有表達(dá)，在葉片中的表達(dá)量最高；在不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)中，授粉后第40天的表達(dá)量最高，其次是第20天。

2.3 過(guò)量表達(dá)載體構(gòu)建挑取轉(zhuǎn)化菌落，提取重組質(zhì)粒pPZP221-CmERFIV-5，選用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和KpnⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示產(chǎn)生約0.8 kb預(yù)期片段。以質(zhì)粒pPZP221-CmERFIV-5 為模板進(jìn)行體外擴(kuò)增，擴(kuò)增出特異性片段約0.8 kb，表明已將CmERFIV-5 基因cDNA成功插入到植物表達(dá)載體pPZP221中。

2.4 RNAi載體構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶NotⅠ切割重組質(zhì)粒pART27-CmERFIV-5，產(chǎn)生約3.3 kb預(yù)期片段。以質(zhì)粒pART27-CmERFIV-5為模板，PCR擴(kuò)增出特異性片段約0.8 kb，表明CmERFIV-5 基因的RNAi載體構(gòu)建成功。

3 討論

ERF類轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/ERF家族，主要調(diào)控乙烯應(yīng)答以及相關(guān)逆境響應(yīng)基因的表達(dá),且在植物抵抗生物與非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13-15]。目前有關(guān)ERF在果實(shí)成熟衰老過(guò)程中的研究較少。番茄LeERF2(AAO34704,第Ⅶ族ERF)的表達(dá)水平在果實(shí)成熟衰老過(guò)程中呈增強(qiáng)趨勢(shì)[16]，表明參與了果實(shí)的成熟衰老進(jìn)程。在蘋(píng)果中ERF家族成員MdERF1主要在成熟果實(shí)中表達(dá)，在其他組織中很少表達(dá)，研究認(rèn)為同屬于Ⅶ族ERF的蘋(píng)果MdERF1與番茄LeERF2在果實(shí)成熟衰老過(guò)程中起相似的作用[17]。葡萄果實(shí)中的ERF1基因表達(dá)量自始熟期持續(xù)增加，直至完熟期轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高，表明乙烯信號(hào)途徑可以在果實(shí)始熟期之后對(duì)果實(shí)成熟衰老發(fā)揮重要調(diào)控作用[18]。轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)一步顯示，抑制屬于第V族ERF的LeERF1(AAL75809)可有效延緩番茄果實(shí)的成熟過(guò)程[19]，表明ERF在果實(shí)成熟衰老過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。在甜瓜中，ERF亞家族基因共有64個(gè)，分為6個(gè)亞族[11]，為研究其第IV組第5個(gè)成員CmERFIV-5在甜瓜植株生長(zhǎng)發(fā)育及果實(shí)成熟中的功能，該研究進(jìn)行了甜瓜CmERFIV-5基因的克隆、表達(dá)分析及超表達(dá)和RNAi載體構(gòu)建。該基因在葉片中的表達(dá)量最高；在果實(shí)發(fā)育的不同階段，CmERFIV-5基因表達(dá)水平不同，總體呈上升趨勢(shì)，推測(cè)CmERFIV-5基因在甜瓜葉和果實(shí)成熟中發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

該研究以甜瓜品種河套蜜瓜為材料，克隆了CmERFIV-5基因 cDNA，長(zhǎng)度為808 bp，編碼255個(gè)氨基酸；CmERFIV-5基因在甜瓜根、莖、葉及不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)中均有表達(dá)，在葉片中表達(dá)量最高；構(gòu)建了CmERFIV-5基因的過(guò)量表達(dá)與RNAi載體，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

[1] GANE R.Production of ethylene by some ripening fruits[J].Nature,1934,134(3400):1008.[2] BLEECKER A B,KENDE H.Ethylene:a gaseous signal molecule in plants[J].Annual Review of Cell and Developmental Biology,2000,16(1):1-18.[3] YAU C P,WANG L,YU M,et al.Differential expression of three genes encoding an ethylene receptor in rice during development,and in response to indole-3-acetic acid and silver ions[J].Journal of Experimental Botany,2004,55(397):547-556.

[4] ECKER J R.The ethylene signal transduction pathway in plants[J].Science,1995,268(5211):667-675.

[5] WANG W,ESCH J J,SHIU S H,et al.Identification of important regions for ethylene binding and signaling in the transmembrane domain of the ETR1 ethylene receptor ofArabidopsis[J].The Plant Cell Online,2006,18(12):3429-3442.

[6] NAKANO T,SUZUKI K,FUJIMURA T,et al.Genome-wide analysis of the ERF gene family inArabidopsisand rice[J].Plant Physiology,2006,140(2):411-432.

[7] HAO D,OHME-TAKAGI M,SARAI A.Unique mode of GCC box recognition by the DNA-binding domain of ethylene-responsive element-binding factor (ERF domain) in plant[J].Journal of Biological Chemistry,1998,273(41):26857-26861.

[8] THOMASHOW M F.Plant cold acclimation:freezing tolerance genes and regulatory mechanisms[J].Annual Review of Plant Biology,1999,50(1):571-599.

[9] PARK J M,PARK C J,LEE S B,et al.Overexpression of the tobacco Tsi1 gene encoding an EREBP/AP2-type transcription factor enhances resistance against pathogen attack and osmotic stress in tobacco[J].The Plant Cell Online,2001,13(5):1035-1046.

[10] GARCIA-MAS J,BENJAK A,SANSEVERINO W,et al.The genome of melon (CucumismeloL.)[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2012,109(29):11872-11877.

[11] MA Y,ZHANG F,BADE R,et al.Genome-wide identification and phylogenetic analysis of the ERF gene family in melon[J].Journal of Plant Growth Regulation,2015,34(1):66-77.

[12] LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[13] 劉強(qiáng),趙南明.DREB 轉(zhuǎn)錄因子在提高植物抗逆性中的作用[J].科學(xué)通報(bào),2000,45(1):11-16.

[14] LIU L,WHITE M J,MACRAE T H.Transcription factors and their genes in higher plants[J].European Journal of Biochemistry,1999,262(2):247-257.

[15] YAMAGUCHI-SHINOZAKI K,SHINOZAKI K.Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses[J].Annu Rev Plant Biol,2006,57:781-803.

[16] TOURNIER B,SANCHEZ-BALLESTA M T,JONES B,et al.New members of the tomato ERF family show specific expression pattern and diverse DNA-binding capacity to the GCC box element[J].FEBS Letters,2003,550(1):149-154.

[17] WANG A,TAN D,TAKAHASHI A,et al.MdERFs,two ethylene-response factors involved in apple fruit ripening[J].Journal of Experimental Botany,2007,58(13):3743-3748.

[18] DELUC L,GRIMPLET J,WHEATLEY M,et al.Transcriptomic and metabolite analyses of Cabernet Sauvignon grape berry development[J].BMC Genomics,2007,8(1):429.

[19] LI Y,ZHU B,XU W,et al.LeERF1 positively modulated ethylene triple response on etiolated seedling,plant development and fruit ripening and softening in tomato[J].Plant Cell Reports,2007,26(11):1999-2008.

Cloning，Expression Analysis and Vector Construction of theCmERFIV-5 Gene cDNA from Melon (CucumismeloL.)

JIN Wu-yun， SHAO Qi， HAO Xin， HASI Agula*et al

( College of Life Sciences,Inner Mongolia University;Inner Mongolia Key Laboratory of Herbage &Endemic Crop Biotechnology,Hohhot,Inner 010021)

[Objective] The aim was to study cloning，expression analysis and vector construction of theCmERFIV-5 gene cDNA from melon (CucumismeloL.)[Method]A pair of specific primer was designed according to the cDNA nucleotide sequence in GenBank (accession number: MELO3C024315) of an ethylene responsive facter gene cDNA from melon(CucumismeloL. cv. Hetao). The cDNA of the gene was cloned by RT-PCR from mature fruit of melon, which the gene was namedCmERFIV-5. The gene expression patterns were characterized inCucumismeloL.melon root，stem，leaf and fruit of different developmental stage . The cDNA of theCmERFIV-5 was cloned into the overexpression vector pPZP221 to construct the recombinant plant expression vector pPZP221-CmERFIV-5. Meanwhile, the RNAi vector pART-27-CmERFIV-5 was constructed. [Result]Sequence analysis indicated that the cDNA was 808 bp which incodes a polypeptide of 255 amino acids. Quantitative real-time PCR analysis showed that theCmERFIV-5 expressed ubiquitously in roots, stems, leaves and different developmental stages of fruit and the highest transcription was in leaves.[Conclusion] Overexpression vector and RNAi vector ofCmERFIV-5 gene was constructed, and laid the foundations for the further research of the gene function .

Melon; Ethylene responsive facter; Ethylene; Express;CmERFIV-5

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360486)。

金烏云(1991- )，女，內(nèi)蒙古興安盟扎賚特旗人，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)及基因工程。*通訊作者，博士，教授，從事植物分子生物學(xué)及基因工程研究。

2015-04-02

S 652

A

0517-6611(2015)14-030-03