魯克慶 王志平

作者單位：730030 蘭州 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科研究所；甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)中心

綜述

溶瘤腺病毒的安全性研究進(jìn)展

魯克慶 王志平

作者單位：730030 蘭州 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科研究所；甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)中心

溶瘤腺病毒又稱條件復(fù)制性腺病毒（conditionally replicating adenovirus，CRAD），是一種用于腫瘤治療的生物制劑，其安全性備受人們的關(guān)注，如何系統(tǒng)化評(píng)價(jià)其毒性是應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵步驟。近年來，對(duì)于溶瘤腺病毒安全性的報(bào)道越來越多，包括從特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)到動(dòng)物的毒理實(shí)驗(yàn)等。本文對(duì)溶瘤腺病毒的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、荷瘤小鼠治療的毒性、動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)及長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)、生殖毒性實(shí)驗(yàn)的研究及其評(píng)估方法和目前臨床研究狀況進(jìn)行綜述。

溶瘤腺病毒；安全性；毒性；評(píng)估方法

目前，盡管溶瘤腺病毒的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)已取得較好的抗腫瘤效應(yīng)，但大多數(shù)溶瘤腺病毒尚未應(yīng)用于臨床。究其原因，主要是由于其安全性問題令人擔(dān)憂。溶瘤腺病毒作為一種基因工程改造的病毒，免疫原性較強(qiáng)，在宿主體內(nèi)具有引起超敏反應(yīng)的可能。除此之外，還有一些流感樣毒性癥狀包括寒戰(zhàn)、發(fā)熱、乏力、肌肉疼痛等，以及許多未知的毒副反應(yīng)和安全隱患。為此，進(jìn)行溶瘤腺病毒的安全性評(píng)價(jià)非常必要。目前對(duì)于溶瘤腺病毒的安全性研究主要是以細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為主，臨床試驗(yàn)進(jìn)展較為緩慢。

1 溶瘤腺病毒的體外實(shí)驗(yàn)

體外的安全性研究是進(jìn)行安全性評(píng)估的第一步，其研究包括將溶瘤腺病毒分別轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞和正常組織的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要依靠給藥后細(xì)胞計(jì)數(shù)，電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的病毒顆粒，檢測(cè)溶瘤腺病毒對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞ca s pa s e3活性的影響，分析在細(xì)胞凋亡中的作用和差異，檢測(cè)溶瘤腺病毒相關(guān)基因在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)差異，一般使用W e st e r n blot法對(duì)表達(dá)的病毒蛋白進(jìn)行檢測(cè)，R T-P C R技術(shù)檢測(cè)病毒穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。通過這些方法基本上可以確定病毒在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)差異。在A d-PS CAE-U P II-E1A-A R的研究［1］中發(fā)現(xiàn)，在其有效劑量的應(yīng)用時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞的損傷很小，正常細(xì)胞的E1A蛋白含量與腫瘤細(xì)胞相比明顯下降。含熒光蛋白的A d-PS CAE-U P II-L U C在熒光顯微鏡下，熒光蛋白L U C在正常的膀胱細(xì)胞系S V-H U C-1中的表達(dá)明顯低于膀胱腫瘤細(xì)胞。另外ON Y X-015能夠在p53基因突變的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，V C N-01能夠在p R B信號(hào)通路缺陷的細(xì)胞中復(fù)制［2］，這兩個(gè)基因在腫瘤細(xì)胞中常常突變，而在正常細(xì)胞中通常起到選擇性作用。這些都說明溶瘤腺病毒在體外實(shí)驗(yàn)研究中是比較安全的。

2 溶瘤腺病毒的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

溶瘤腺病毒在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的安全性評(píng)價(jià)是其進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)并應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵。國(guó)家食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序規(guī)定：食品藥品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)主要包括四個(gè)階段：第一階段為急性毒性實(shí)驗(yàn)；第二階段為遺傳毒性實(shí)驗(yàn)、傳統(tǒng)致畸實(shí)驗(yàn)、短期喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)；第三階段為亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)——90 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、繁殖實(shí)驗(yàn)；第四階段為慢性毒性實(shí)驗(yàn)。目前溶瘤腺病毒體內(nèi)的安全性評(píng)估主要包括荷瘤小鼠的治療和毒性實(shí)驗(yàn)、正常小鼠的急性和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)、生殖毒性和發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)。其結(jié)果的評(píng)估主要集中于溶瘤腺病毒對(duì)動(dòng)物一般行為的觀察、體重變化、血液學(xué)的變化和各個(gè)組織器官病理學(xué)的改變等。

2.1 荷瘤小鼠的毒性評(píng)價(jià)

對(duì)裸鼠進(jìn)行皮下注射腫瘤細(xì)胞，制作裸鼠荷瘤模型，這是最常用的腫瘤造模方法。小鼠腫瘤模型的建立主要用于藥物對(duì)腫瘤組織的殺傷和抑制作用的檢測(cè)，其安全性評(píng)價(jià)是次要作用，只能作為藥物系統(tǒng)的安全性評(píng)價(jià)的前期研究。溶瘤腺病毒治療荷瘤小鼠安全性的研究很多，主要集中于溶瘤腺病毒對(duì)組織器官損傷的病理學(xué)研究和炎癥反應(yīng)。以腺病毒M7和腺病毒M8在治療小鼠胃癌模型中發(fā)現(xiàn)，兩種腺病毒均有明顯殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，并且其毒性和安全性與對(duì)照組的A dv-T K（一種安全的腺病毒）相類似［3］。馬步云等［4］在Z D55-X A F1治療荷瘤小鼠的研究中，發(fā)現(xiàn)小鼠心臟、脾臟和腎臟均有水腫，肝臟有明顯的核固縮和壞死，提示該劑有一定的毒性。在A d-E G F P-M DR1治療大腸癌的小鼠皮下腫瘤的研究中，結(jié)果顯示動(dòng)物體內(nèi)抗體在給藥幾天后增加，外周血液中白細(xì)胞無明顯變化，M DR1蛋白的表達(dá)在肺、睪丸、腎臟中呈陽(yáng)性，但在肝、脾、腦中為陰性［5］。說明溶瘤腺病毒在治療腫瘤的同時(shí)，其安全性較好，有輕微毒性但可耐受。另外毒性可出現(xiàn)在睪丸組織中，因此進(jìn)行生殖毒性實(shí)驗(yàn)也是十分必要的。

2.2 小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)

急性毒性實(shí)驗(yàn)又稱單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)，是指動(dòng)物1天內(nèi)多次或單次給藥后，在14 d中連續(xù)觀察動(dòng)物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及死亡情況。其目的是了解藥物單次或短時(shí)間內(nèi)多次給藥后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及嚴(yán)重程度，計(jì)算新藥相對(duì)毒性參數(shù)，為臨床安全用藥及監(jiān)測(cè)提供一定的參考。創(chuàng)新藥必須至少使用兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，常用的嚙齒類動(dòng)物為小鼠和大鼠，非嚙齒類動(dòng)物主要常用猴或小型豬。給藥方法以最大劑量給藥法最為常用。觀察時(shí)間一般為14 d。

重復(fù)給藥毒性實(shí)驗(yàn)，或稱長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)，即反復(fù)多次對(duì)動(dòng)物給藥，觀察藥物對(duì)動(dòng)物的毒性反應(yīng)，一般是指連續(xù)給藥14 d以上。其目的為觀察連續(xù)反復(fù)給藥時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)、劑量與毒性效應(yīng)的關(guān)系、主要毒性靶器官、毒性反應(yīng)的性質(zhì)和程度以及是否可逆等；還可觀察連續(xù)反復(fù)給藥時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的耐受劑量、無毒反應(yīng)劑量、毒性反應(yīng)劑量及安全范圍；有無遲發(fā)毒性實(shí)驗(yàn)、有無蓄積毒性或受試動(dòng)物對(duì)藥物的耐受性等。長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)是非臨床安全性評(píng)價(jià)的主要內(nèi)容，是能否過渡到臨床試驗(yàn)的主要依據(jù)，也為臨床安全用藥劑量設(shè)計(jì)提供參考依據(jù)，并為臨床毒性和毒副反應(yīng)的監(jiān)護(hù)及生理、生化指標(biāo)檢測(cè)提供依據(jù)。劑量分組一般分為低劑量組、中劑量組、高劑量組三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，以便觀察和分析不同劑量的毒性反應(yīng)，為臨床制訂用藥劑量提供依據(jù)。

在藥物毒性評(píng)價(jià)中，急性毒性評(píng)價(jià)和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)是密不可分的，除長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)給藥的劑量和動(dòng)物的分組更為復(fù)雜、觀察時(shí)間較長(zhǎng)外，其給藥方式、觀測(cè)時(shí)間、檢查指標(biāo)都相似，因此通常將這兩組實(shí)驗(yàn)放在一起以便于研究。在新型溶瘤腺病毒S G600-P53的研究［6］中，對(duì)小鼠和豚鼠進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示給藥17min后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)精神萎靡、閉眼、對(duì)聲音的敏感性增加。這些癥狀在30min后恢復(fù)，給藥40min后進(jìn)食，無驚厥、抽搐和其他異常改變，觀察期間注射部位無炎癥、硬結(jié)、潰瘍。動(dòng)物給藥兩周內(nèi)體重有所差異，兩周后無明顯改變。另外在大鼠和獼猴重復(fù)給藥實(shí)驗(yàn)［6］中，給藥期結(jié)束動(dòng)物出現(xiàn)進(jìn)食減少；血液中W BC、R e t、P L T、A S T增加；R BC、H G B、H T C、ALB和T CH O減少，這些改變實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)均恢復(fù)正常。S u等［6］的研究在S G600-P53處理組體內(nèi)均檢測(cè)出相應(yīng)的抗體，在給藥結(jié)束期和實(shí)驗(yàn)結(jié)束期，免疫組化法分析S G600-P53在動(dòng)物注射部位的肌肉和脾臟組織中被檢出，但是在腦、心、肺、肝、腎、睪丸、前列腺和子宮等均未發(fā)現(xiàn)。

溶瘤腺病毒r A d5-h T E R T27在大鼠和猴子的急性毒性實(shí)驗(yàn)［7］中，顯示出較好的耐受性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般狀況無明顯改變，體重和食品的消耗沒有明顯差異，在系統(tǒng)解剖中也未發(fā)現(xiàn)異常改變。血液中W BC、R BC、H G B、P T、P L T和A P TT的改變都在正常范圍內(nèi)；血液生化指標(biāo)A S T、AL T、CK、AL P、T P、ALB、G L U、T BIL和CH O L的改變均在正常范圍內(nèi)。近年在溶瘤腺病毒I N G N007［8］、突變型M1［9］、腺病毒A d-R EIC［10］的急性毒性實(shí)驗(yàn)中，除了I N G N007在給藥10min后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)輕微的行為異常和肝功能出現(xiàn)可逆的輕度損傷外，在體重、進(jìn)食量、行為、反應(yīng)的敏感性等一般狀況，以及血液生化和組織病理學(xué)等方面均無明顯改變，其余各項(xiàng)指標(biāo)均正常。另外在腺病毒A d V E G F-A ll6A+急性毒性實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)［11］中，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的各項(xiàng)指標(biāo)沒有明顯差異，病理組織檢查也未發(fā)現(xiàn)腺病毒相關(guān)的改變。

急性毒性實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)是藥物安全性評(píng)價(jià)最為重要的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，也是決定新藥能否進(jìn)入臨床的關(guān)鍵性實(shí)驗(yàn)。毒性實(shí)驗(yàn)的觀察應(yīng)從定性和定量?jī)煞矫孢M(jìn)行，定性觀察就是觀察服藥后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有哪些中毒表現(xiàn)，其毒性反應(yīng)出現(xiàn)和消失的速度如何，涉及哪些組織和器官，最主要的可能毒性靶器官是什么，損傷的性質(zhì)及可逆程度如何，中毒死亡有哪些特征，可能的死亡原因等。定量觀察就是觀察藥物毒性反應(yīng)和劑量的關(guān)系。在上述溶瘤腺病毒的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析認(rèn)為，溶瘤腺病毒在動(dòng)物的急性和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)中具有較好的安全性。

2.3 生殖發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)

以病毒為載體的基因生物制劑在進(jìn)入人體后，有些可以通過隨機(jī)同源重組或逆轉(zhuǎn)錄的形式整合到宿主的基因組中，有些可以表達(dá)導(dǎo)入的靶基因，這兩種情況將影響宿主基因的表達(dá)，有可能激活一些原癌基因和失活一些抑癌基因，引起宿主腫瘤的發(fā)生。若發(fā)生在生殖細(xì)胞中則會(huì)遺傳給后代，造成嚴(yán)重不良后果。國(guó)家藥監(jiān)局建議凡是能夠影響基因表達(dá)的生物制劑均要進(jìn)行相關(guān)的生殖發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)。目前研究認(rèn)為以腺病毒為載體的生物制劑不能整合到宿主的基因組中［12，13］，但多數(shù)研究表明重組腺病毒可以表達(dá)相關(guān)的基因，分布于宿主的生殖器官中，可能有致突變作用和致子代畸形的毒性。因此，對(duì)于溶瘤腺病毒進(jìn)行相應(yīng)的生殖毒性檢測(cè)是非常有必要的。

目前，生殖毒性實(shí)驗(yàn)通常首選三個(gè)階段實(shí)驗(yàn)，即生育力及早期胚胎發(fā)育、胚胎-胎仔發(fā)育實(shí)驗(yàn)和圍生期發(fā)育［14］。該研究的目的是反映受試物對(duì)哺乳動(dòng)物生殖功能和發(fā)育過程的影響，預(yù)測(cè)其可能產(chǎn)生的對(duì)生殖細(xì)胞、受孕、妊娠、分娩等親代的生殖功能，以及對(duì)子代胚胎-胎兒的發(fā)育、出生后發(fā)育的不良影響。生育力及早期胚胎發(fā)育實(shí)驗(yàn)是指在雌雄動(dòng)物交配前到交配期直至胚胎著床給藥，評(píng)價(jià)受試物對(duì)動(dòng)物生殖的毒性或干擾作用，評(píng)價(jià)內(nèi)容包括配子成熟度、交配行為、生育力、胚胎著床前段和著床。對(duì)雌性動(dòng)物，應(yīng)觀察藥物對(duì)動(dòng)情周期、受精輸卵管轉(zhuǎn)運(yùn)、著床及胚胎著床前發(fā)育的影響。胚胎-胎仔發(fā)育實(shí)驗(yàn)指妊娠動(dòng)物自胚胎著床至硬腭閉合階段（大小鼠孕后第6～15天）給藥。評(píng)價(jià)藥物對(duì)妊娠動(dòng)物、胚胎及胎仔發(fā)育的影響。該段實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)內(nèi)容包括藥物對(duì)妊娠動(dòng)物的毒性、胚胎-胎仔死亡、生長(zhǎng)改變和結(jié)構(gòu)變化等致畸效應(yīng)。圍生期發(fā)育實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)從著床到斷奶時(shí)期給藥對(duì)妊娠或哺乳的雌性動(dòng)物及胚胎和子代發(fā)育的不良影響。

3 溶瘤腺病毒的臨床試驗(yàn)

迄今溶瘤腺病毒大多處于實(shí)驗(yàn)研究階段，真正應(yīng)用于臨床試驗(yàn)尚不多。目前正處于臨床試驗(yàn)階段的主要有溶瘤腺病毒C G0070，用于非肌肉浸潤(rùn)性的膀胱腫瘤患者治療并進(jìn)行了臨床Ⅰ期試驗(yàn)研究［15］，當(dāng)給藥2～5 d后，58.3%的患者尿中含有C G0070，約經(jīng)10.4個(gè)月后被清除。此外，溶瘤腺病毒KH901用于頭頸部腫瘤治療亦進(jìn)行了臨床Ⅰ期試驗(yàn)［16］，患者除有一些輕微的流感癥狀外，無其他毒副反應(yīng)，血液中可檢測(cè)到患者的病毒抗體。由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子控制表達(dá)C D40配體（C D40L）的溶瘤腺病毒C G T G-40L［17］和R b信號(hào)通路且病毒趨向性改進(jìn)的溶瘤腺病毒A d5-△24-A r g-G l y-A s p（R G D）用于復(fù)發(fā)的惡性卵巢癌治療［18］，均進(jìn)行了臨床Ⅰ期試驗(yàn)研究，結(jié)果顯示瘤內(nèi)注射C G T G-40L的9例患者，沒有觀察到明顯的毒副反應(yīng)，使用R G D的患者除了發(fā)熱、疲乏外，無明顯的嚴(yán)重毒副反應(yīng)發(fā)生。胡永超等［19］研究攜帶自殺基因（T K）的溶瘤腺病毒A d-E T K治療實(shí)體腫瘤患者的安全性及臨床療效。結(jié)果表明患者除寒顫、發(fā)熱、乏力、肌肉酸痛等流感樣癥狀外，均表現(xiàn)出良好的可行性和耐受性。

目前，首個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的溶瘤腺病毒ON Y X-015［20］，主要用于頭頸部腫瘤的治療，已經(jīng)完成臨床Ⅲ期試驗(yàn)。在多中心性臨床研究中，ON Y X-015顯示出較好的安全性［21］。特別是和化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，具有明顯的協(xié)同作用，腫瘤的緩解率大大地提高［22］。在肯定藥效和體內(nèi)安全性生物性分布及其安全性評(píng)價(jià)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)之上，我國(guó)自主研發(fā)的溶瘤腺病毒試劑H101（安柯瑞），已經(jīng)完成了臨床Ⅰ期［23］、臨床Ⅱ期［24］、臨床Ⅲ期［25］試驗(yàn)，結(jié)果均顯示具有良好的耐受性。2005年由我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)H101應(yīng)用于臨床，成為首個(gè)應(yīng)用于臨床的溶瘤腺病毒制劑。自此，溶瘤腺病毒從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用邁出了歷史性的一步。

4 展望

腫瘤的基因治療是繼傳統(tǒng)手術(shù)、化療、放療之后的第四大腫瘤治療手段。溶瘤腺病毒治療腫瘤是一項(xiàng)比較新的腫瘤治療手段，也是有望攻克腫瘤的一種治療方法。目前，溶瘤腺病毒的研究大多處于實(shí)驗(yàn)階段，尚未能廣泛應(yīng)用于臨床，究其原因就是其安全性問題。相信隨著人們對(duì)溶瘤腺病毒在體內(nèi)代謝的認(rèn)識(shí)、系統(tǒng)的安全性評(píng)價(jià)、體內(nèi)清除機(jī)制等研究的深入開展，溶瘤腺病毒將會(huì)取得令人信服的安全性評(píng)價(jià)。期待溶瘤腺病毒能夠成為腫瘤治療的重要方法以造福于廣大腫瘤患者。

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［2014-12-09收稿］［2015-01-05修回］［編輯 阮萃才］

R373

A

1674-5671（2015）01-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.01.13

王志平。E-mail：erywzp@lzu.cn