譚阿蕊 綜述 韓劍虹 審校

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 昆明 650101

缺血性腦卒中發(fā)病率高，病死率高，致殘率高。目前，臨床上治療缺血性腦卒中的主要手段是溶栓［1］，但由于存在治療時(shí)間窗限制，不適用于所有患者。因此，找到新的治療靶點(diǎn)顯得十分重要。腦缺血性損傷的病理生理機(jī)制復(fù)雜，包括氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、興奮性毒性、凋亡基因激活、炎癥應(yīng)答等，其中Toll樣受體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在腦缺血損傷的病理過(guò)程中起重要作用。本文就缺血后Toll樣受體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及其與microRNAs的關(guān)系研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為尋找新的有效的治療靶點(diǎn)提供新思路。

1 microRNAs

microRNAs（miRNAs）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)19～23個(gè)核苷酸序列的高度保守的非編碼小RNA，通過(guò)與特定的mRNAs完全或者部分互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平引起mRNAs的降解或者翻譯抑制［2］，涉及多種生物學(xué)過(guò)程，包括發(fā)育、分化、固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答等［3］。

miRNAs轉(zhuǎn)錄自外顯子與內(nèi)含子之間或基因組的其他基因間區(qū)基因，首先由細(xì)胞核中DNA 轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)度大約為1 kb的初級(jí)miRNAs（pri－miRNAs），然后在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)核糖核酸酶Drosha和DGCR8／Pasha蛋白剪切成60～110bp大小，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，稱為前體miRNAs（pre－miRNAs），前體miRNAs在核膜轉(zhuǎn)運(yùn)體exportin－5協(xié)助下從細(xì)胞核中轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿中，經(jīng)另一種核糖核酸酶Dicer剪切生成長(zhǎng)20～25bp的不完全雙鏈RNA，包括成熟miRNAs和其互補(bǔ)鏈。雙鏈在解旋酶的作用下解開，參與形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）［4］。miRNAs引導(dǎo)RISC 與目標(biāo)mRNAs的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA 的降解或翻譯抑制［5］。每一個(gè)高度保守的哺乳動(dòng)物miRNA 可能和數(shù)百個(gè)不同的mRNA 靶向結(jié)合，因此幾乎所有的mRNA 都在某種程度上受miRNA 調(diào)控［6］。miRNAs的靶mRNAs可以通過(guò)測(cè)序的方法進(jìn)行預(yù)測(cè)，但是由于存在假陽(yáng)性和假陰性可能，因此預(yù)測(cè)后的結(jié)果必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。目前已發(fā)現(xiàn)人類腦組織表達(dá)數(shù)百種miRNA［7］，參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育、病理生理過(guò)程。

2 TLRs的特點(diǎn)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

Toll樣受體（Toll－like receptors，TLRs）是一種膜識(shí)別受體，為Ⅰ型跨膜蛋白，包括位于細(xì)胞外的富含亮氨酸重復(fù)序列區(qū)和位于細(xì)胞內(nèi)的Toll／IL－1受體同源區(qū)，即TIR 區(qū)，胞外的富含亮氨酸重復(fù)序列區(qū)能與配體特異性結(jié)合，胞內(nèi)的TIR區(qū)則負(fù)責(zé)接頭蛋白的募集，最終細(xì)胞激活生成大量炎性介質(zhì)，是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分。目前，已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物TLRs家族有13 個(gè)成員（人類11 個(gè)，鼠13 個(gè)），其中，TLR2和TLR4介導(dǎo)腦缺血再灌注損傷病理過(guò)程中的免疫炎癥反應(yīng)［8］。TLRs介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括MyD88依賴和MyD88非依賴兩條信號(hào)通路。TLRs通過(guò)MyD88募集活化下游IRK1、IRK2、IRK4和TRAF6，導(dǎo)致MAPK、IRF5激活，最終激活NF－κB通路導(dǎo)致相關(guān)炎癥因子轉(zhuǎn)錄、釋放，即經(jīng)典的MyD88依賴信號(hào)通路；MyD88非依賴信號(hào)通路不需要MyD88的介導(dǎo)，直接或間接通過(guò)Mal蛋白、TRAM 或TRIF等接頭蛋白募集TRADD、TRAF3、TRAF6，進(jìn)而激活下游炎癥因子表達(dá)［9］。

3 TLR2／TLR4與腦缺血

炎癥反應(yīng)在腦缺血性損傷過(guò)程中起重要作用，腦缺血早期在缺血半暗帶周圍小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞聚集，產(chǎn)生大量促炎癥因子，損傷神經(jīng)元、少突細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)，加重腦缺血性損傷［10］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明［11］，短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞導(dǎo)致梗死腦組織嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，24h 達(dá) 高 峰；炎 癥 相 關(guān) 分 子TLR2、TLR4、NF－κB、COX2、TNF－α顯著增加，特別是缺血后12～24h，表明TLR2／4信號(hào)通路可能通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)加重缺血性腦損傷。

TLR2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞，主要通過(guò)MyD88依賴途徑傳遞胞外信號(hào)，激活細(xì)胞分泌炎癥因子、促炎癥因子和促凋亡因子。大鼠局部腦缺血再灌注模型和體外再灌注模型均顯示TLR2 激 活 導(dǎo) 致IL－23 產(chǎn) 生 和 小 膠 質(zhì) 細(xì) 胞 分 泌IL－17，TLR2、IL－23、IL17三者形成一個(gè)信號(hào)軸，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增加［12］。比較大腦中動(dòng)脈閉塞1h，再灌注2d的TLR2缺乏小鼠和野生型小鼠發(fā)現(xiàn)，TLR2缺乏小鼠腦梗死面積更小［13］，與Lehnardt等［14］研究結(jié)論一致。類似地，使用TLR2抑制劑活體阻斷TLR2可減少實(shí)驗(yàn)性腦卒中小鼠腦組織白細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)和神經(jīng)元死亡［15］。另外，研究表明［16］，CD36缺乏小鼠短暫大腦中動(dòng)脈閉塞并不誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)，表明腦組織中清道夫受體CD36為TLR2信號(hào)通路促發(fā)的炎癥反應(yīng)所必須。因此，TLR2－CD36復(fù)合體是腦缺血后炎癥反應(yīng)的重要觸發(fā)點(diǎn)。

腦TLR2表達(dá)在嚙齒動(dòng)物短暫和永久性局部腦缺血模型和體外缺血模型中均增加。TLR2上調(diào)和TLR2信號(hào)通路通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)加重缺血性腦損傷。然而，關(guān)于TLR2在缺血性腦損傷中的作用有爭(zhēng)議性報(bào)道。Hua等［12］發(fā)現(xiàn)，小鼠急性局部腦缺血再灌注后，與野生型小鼠相比，TLR2KO小鼠病死率更高，神經(jīng)功能缺失更多，腦梗死面積更大，TLR2似乎通過(guò)增加保護(hù)性信號(hào)激活在腦缺血再灌注中起保護(hù)作用；使用TLR2配體預(yù)處理小鼠24h能對(duì)腦缺血起到明 顯 的 保 護(hù) 作 用［17］。TLR2 激 動(dòng) 劑Pam3CSK4 可 通 過(guò)TLR2－PI3K／Akt依賴途徑顯著減輕局部腦缺血性損傷［18］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致可能是由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型、動(dòng)物體質(zhì)量、用于動(dòng)脈閉塞的線栓直徑及涂層、缺血再灌注時(shí)不一致所致。

TLR4是在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)TLR，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，TLR4主要表達(dá)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞。除MyD88 依賴途徑和非依賴途徑，TLR4 還通過(guò)MAPKs信號(hào)通路途徑介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化和凋亡。動(dòng)物模型研究顯示［12］，TLR4KO 小鼠在急性腦缺血再灌注后梗死面積更小，神經(jīng)功能缺失減少，表明TLR4在腦缺血再灌注損傷病理過(guò)程中加劇腦損傷。短暫性腦缺血小鼠模型腦小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4表達(dá)也上調(diào)。對(duì)不同種屬TLR4KO 小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)［8］：（1）和野生型小鼠相比，TLR4KO 小鼠梗死面積顯著減小，神經(jīng)功能評(píng)分提高，而TLR3，TLR9KO 小鼠不會(huì)改變；（2）和野生型小鼠相比，TLR4KO 小鼠缺血區(qū)域CD11b陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)減少，NF－κB 激活減少；（3）TLR4缺乏小鼠腦炎癥和損傷相關(guān)介質(zhì)表達(dá)更少，包括IRF1、IFNβ、iNOS、MMP－9、COX2，證實(shí)了TLR4可通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)加劇腦損傷。

4 TLRs與miRNAs相互調(diào)控

TLRs信號(hào)通路的信號(hào)分子受許多機(jī)制調(diào)節(jié)，包括物理相互作用、構(gòu)象改變、磷酸化、泛素化和蛋白酶體介導(dǎo)的降解［19］，但更為節(jié)能的方式是通過(guò)mRNA 降解或調(diào)節(jié)TLR 信號(hào)分子的表達(dá)。隱孢子蟲感染通過(guò)MyD88／NF－kB 依賴的方式減少miRNA－let－7的表達(dá)，同時(shí)增加TLR4 的表達(dá)，過(guò)表 達(dá)miRNA－let－7 顯 著 增 加TLR4 蛋 白 的 表 達(dá)［20］，表 明miRNA－let－7對(duì)TLR4存在調(diào)控作用。已證實(shí)，miRNAs能在多個(gè)水平調(diào)控TLR 信號(hào)通路，包括：（1）調(diào)控TLRs表達(dá)，如TLR4表達(dá)受miR－223、let－7i、let－7e的調(diào)控，TLR2表達(dá)受miR－105調(diào)控；（2）作用于通路信號(hào)分子，如miR－155作用于MYD88，miR－146作用于IRAK1、IRAK2、TRAF6等；（3）作用于轉(zhuǎn)錄因子，如miR－9作用于NF－κB1等；（4）作用于細(xì)胞因子mRNAs，如let－7作用于IL－6 mRNA、miR－155作用于TNF mRNA 等；（5）作用于TLR 信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑相關(guān)基因，如miR－132調(diào)控ACHE編碼基因等［21］。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予TLR4配體LPS，可增加單核細(xì)胞miR－146a、miR－155 和miR－132 的 表 達(dá)［22］。然 而，TRAF6 和IRAK－1是miR－146的靶點(diǎn)，是TLR 介導(dǎo)的NF－kB激活的重要分子。表明miR－146可能是固有免疫和炎癥應(yīng)答TLR 通路中的負(fù)反饋調(diào)節(jié)分子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TLR4和TLR2激活巨噬細(xì)胞，上調(diào)miR－125a－5p，而TLR3 不行。MiR－125a－5p是巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥應(yīng)答的負(fù)性調(diào)節(jié)分子［23］。大量研究表明［21］，TLR4可上調(diào)miR－155、miR－146、miR－132、miR－21、miR－223、miR147、miR－9、miR－125b、let－7e、miR－27b，下 調(diào)miR－125b、let－7i、miR－98；TLR2 可 上 調(diào)miR－155、miR－146、miR－147、miR－9。

5 缺血性損傷中miRNA 與TLRs的調(diào)控關(guān)系

TLRs介導(dǎo)的過(guò)度免疫炎癥反應(yīng)在缺血再灌注引起的組織損傷中發(fā)揮重要作用，但其機(jī)制尚未完全明了。在小腸缺血再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn)，IRAK1 聚集將引發(fā)小腸缺血再灌注引起的上皮免疫高反應(yīng)，而miR－146a可以控制IRAK1上調(diào)，阻止免疫高反應(yīng)［24］，說(shuō)明miR－146a在小腸缺血再灌注中可通過(guò)TLR 信號(hào)通路減輕免疫炎癥反應(yīng)，減輕再灌注損傷。在肝臟缺血再灌注損傷研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)，肝再灌注24h中肝miR－146a的表達(dá)下調(diào)，再灌注6h達(dá)最低。再灌注24h中TLR4，TRAF6，IRAK1 隨miR－146a的減少而增加，6h 達(dá) 高 峰，提 示 在 肝 再 灌 注 損 傷 中，miR－146a 與TLR4可能存在調(diào)控關(guān)系［25］。另外，在心肌缺血再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn)［26］，增加miR－146a表達(dá)可以減輕心肌缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能為通過(guò)抑制IRAK1 和TRAF6 而減少NF－kB激活和炎癥因子產(chǎn)生。此外，Santra等［27］通過(guò)細(xì)胞模型試驗(yàn)證實(shí)，胸腺素β4可通過(guò)上調(diào)miR－146a促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，抑制IRAK1和TRAF6表達(dá)，從而抑制TLR 促炎癥通路。

6 展望

神經(jīng)系統(tǒng)許多miRNA 表達(dá)具有時(shí)序性，表明其參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育、生理和疾病過(guò)程?，F(xiàn)已有研究證實(shí)，miR－146a是星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑。據(jù)此我們可以推測(cè)，miR－146a可能也在腦缺血性損傷中通過(guò)TLR 信號(hào)通路影響炎癥因子表達(dá)。但目前miRNAs對(duì)炎癥反應(yīng)TLR 信號(hào)通路的調(diào)控在缺血性腦損傷研究中還未見報(bào)道。深入了解缺血性腦卒中病理過(guò)程中miRNAs的作用和靶點(diǎn)，有助于為缺血性腦卒中的預(yù)防、診斷和治療提供新的方法和靶點(diǎn)。目前，關(guān)于miRNAs在免疫炎癥反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能已作了大量研究，但還未完全明了，其在缺血性腦卒中中的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究闡明。miRNAs在缺血性腦卒中的治療上具有廣闊的前景，隨著miRNAs不斷被發(fā)現(xiàn)，更多的調(diào)控關(guān)系被證實(shí)，通過(guò)干預(yù)缺血性腦卒中病理過(guò)程不同環(huán)節(jié)的miRNAs表達(dá)以減輕腦損傷，對(duì)缺血性腦卒中的治療具有重要意義。

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