陸岸鋒 鐘丹妮 謝湘芝

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，南寧市 530021，E-mail:luanfeng301301@163．com)

新生兒高膽紅素血癥(簡(jiǎn)稱高膽)是我國新生兒住院的主要原因，但目前仍有較多病例病因不明。近年研究表明新生兒高膽與遺傳因素存在密切關(guān)系［1］。有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)因子2(organic anion transporter 2，OATP2)是一種肝細(xì)胞基底膜上轉(zhuǎn)運(yùn)膽紅素等物質(zhì)的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，由有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1B1(solute carrier organic anion transporter family member 1B1，SLCO1B1)基因編碼。SLCO1B1基因突變可抑制OATP2轉(zhuǎn)運(yùn)膽紅素入肝的能力，使膽紅素清除減慢，未結(jié)合膽紅素在體內(nèi)積聚致新生兒高膽。近來研究顯示，SLCO1B1基因多態(tài)性可能與新生兒高膽發(fā)生相關(guān)。本研究檢測(cè)SLCO1B1基因SLCO1B1 c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C、c．597C/T 這4個(gè)突變位點(diǎn)，旨在探討SLCO1B1基因不同突變類型與本地區(qū)不明原因新生兒高膽之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 納入標(biāo)準(zhǔn):廣西籍(即父母均是廣西人)足月新生兒，日齡2 ～14 d，出生體重2．5 ～4．0 kg;經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬簽署知情同意書。病例組:收集2012年1月至2013年12月我院新生兒科收治的高膽新生兒 121例，男 65例，女 56例，出生體重(3 196．0 ±360．0)g，胎齡(272．7 ±8．2)d，日齡(4．5 ±2．8)d;母乳喂養(yǎng)108例，人工喂養(yǎng)13例;黃疸發(fā)病時(shí)間在出生2周以內(nèi)，膽紅素水平達(dá)到美國兒科學(xué)會(huì)指南［2］推薦的大于35周胎齡新生兒光療干預(yù)標(biāo)準(zhǔn)。以間接膽紅素升高為主，經(jīng)光療及藥物治療黃疸消退出院。對(duì)照組:同期隨機(jī)選取87例在我院產(chǎn)科出生的健康新生兒，在醫(yī)院觀察3～5 d，出院后隨訪至2周，出生后無黃疸或膽紅素值均低于光療干預(yù)標(biāo)準(zhǔn)，其中男57例，女30例，出生體重(3 107．0 ±411．0)g，胎齡(272．6 ±8．5)d，日齡(3．6±3．2)d，母乳喂養(yǎng)78例，人工喂養(yǎng)9例。排除早產(chǎn)兒、先天畸形、母嬰血型不合導(dǎo)致的溶血、G-6PD缺乏、低出生體重兒、缺氧窒息、巨大兒、敗血癥兒、頭顱血腫、低血糖、消化道畸形、紅細(xì)胞增多癥及母親妊娠期間合并妊高征、貧血、感染、糖尿病等影響黃疸程度的因素。兩組間性別、出生體重、胎齡、日齡、喂養(yǎng)方式等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，具有可比性。

1．2 方法

1．2．1 DNA提取:采集新生兒外周血2 ml以EDTA抗凝，應(yīng)用血液基因組提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取基因組DNA。

1．2．2 引物設(shè)計(jì):參考文獻(xiàn)［3-4］及設(shè)計(jì)擴(kuò)增SLCO1B1基因第5、6外顯子共2對(duì)引物，見表1。

表1 SLCO1B1基因擴(kuò)增引物

1．2．3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR):PCR 反應(yīng)總體積50 μl，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30s，循環(huán) 36 次，72℃終延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物5 μl在用溴乙啶染色的2%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察，鑒定產(chǎn)物。

1．2．4 酶切產(chǎn)物及分析:取擴(kuò)增 c．388A/G的 PCR產(chǎn)物10 μl用Fermentas內(nèi)切酶TaqI 65℃消化5 h。取酶切產(chǎn)物10 μl，3．5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色，紫外燈觀察結(jié)果。

1．2．5 PCR 產(chǎn)物測(cè)序:將擴(kuò)增 c．521T/C、c．571T/C 及c．597C/T的合格PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行正向測(cè)序(北京六合華大基因科技股份有限公司)，測(cè)序結(jié)果與基因文庫中的SLCO1B1基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有突變的產(chǎn)物即進(jìn)行反向測(cè)序，以保證結(jié)果的可靠性。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，基因型頻率、等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)或者確切概率法。計(jì)量資料以(x±s)表示，采用方差分析?；蚨鄳B(tài)性對(duì)新生兒高膽影響的優(yōu)勢(shì)比(odds ratio，OR)和95%可信區(qū)間(CI)用二分類變量logistic回歸分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 SLCO1B1 c．388A/G基因分型 PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為214 bp，根據(jù)酶切產(chǎn)物片段大小分為3種基因型:151，63 bp的為野生型(AA 型);151，128，63，23 bp 的為雜合子(AG型);128，63，23 bp的為突變純合子(GG 型)，見圖1。

圖1 SLCO1B1 c．388A/G位點(diǎn)酶切電泳圖(第1條帶為GG純合子，第2條帶為AG雜合子，第3條帶為AA野生型，第4條帶為50 bp DNA marker)。

2．2 SLCO1B1各突變位點(diǎn)的基因分布及等位基因頻率分析 病例組和對(duì)照組 SLCO1B1c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C及c．597C/T的基因型分布及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，見表2～5。提示單一存在的SLCO1B1c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C及c．597C/T突變可能與本地區(qū)新生兒高膽的發(fā)病無關(guān)。

表2 兩組SLCO1B1 c．388A/G位點(diǎn)的基因型分布和等位基因頻率比較(n，%)

表3 兩組SLCO1B1 c．521T/C位點(diǎn)的基因型分布和等位基因頻率比較(n，%)

表4 兩組SLCO1B1 c．571T/C位點(diǎn)的基因型分布和等位基因頻率比較(n，%)

表5 兩組SLCO1B1 c．597C/T位點(diǎn)的基因型分布和等位基因頻率比較(n，%)

2．3 SLCO1B1基因多態(tài)性對(duì)新生兒高膽發(fā)生的影響

SLCO1B1c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C 及 c．597C/T 突變與新生兒高膽紅素血癥發(fā)生無相關(guān)性(P＞0．05)，見表6。

表6 SLCO1B1不同位點(diǎn)基因突變對(duì)新生兒高膽發(fā)生的影響(n，%)

2．4 SLCO1B1不同基因型組患兒總膽紅素(TBIL)、結(jié)合膽紅素(DBIL)、未結(jié)合膽紅素水平(UCB)比較 在SLCO1B1 c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C及 c．597C/T同一位點(diǎn)的不同基因型中，TBIL、DBIL、UCB水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0．05)，見表7。

表7 SLCO1B1不同基因型高膽紅素血癥患兒TBIL、DBIL、UCB 水平比較(x ± s，μmol/L)

3 討論

OATP是一類重要的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因(SLCO)編碼，含有643～722個(gè)氨基酸，參與膽紅素等內(nèi)、外源性物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)［5］。人類的OATP被分為6個(gè)家族(OATP1-OATP6)，OATP2又稱 OATP1B1，是一種重要的肝特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體，由SLCO1B1基因編碼(曾用OATP2基因表示)。SLCO1B1基因位于染色體12p12，全長(zhǎng)108．59 kb，包括15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子，編碼2 791 bp mRNA［5］。早在 2001 年，Tirona 等［6］的實(shí)驗(yàn)表明SLCO1B1基因突變使基因在漿膜表達(dá)的減少導(dǎo)致OATP2轉(zhuǎn)運(yùn)活性的降低，未結(jié)合膽紅素未能轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟而在體內(nèi)積聚引起新生兒高膽。目前發(fā)現(xiàn)c．388A/G和c．521T/C是東方人的主要基因突變類型。c．388A/G在中國、馬來西亞、印度足月新生兒的突變率分別為79．5% 、78．2% 、54．2%［7］，高于巴西人群(白人 50．4% ，黑人 35．1%)［8］。在本研究人群中，c．388A/G 突變率為92．8%，明顯高于上述人群。據(jù)報(bào)告c．521T/C在中國人群的突變頻率為 14．0%［9］，而在高加索人群為 20．2%［10］。本研究顯示c．521T/C的總突變率為26．0%，亦較上述人群的突變率高。而c．571T/C、c．597C/T突變率亦較 Jada等［11］報(bào)告亞洲人群的26．0%、50．0%頻率高，但 c．571T/C的突變頻率低于健康高加索人群(53．2%)［10］。這提示本地區(qū)人群存在SLCO1B1基因多態(tài)性，且其突變頻率分布呈現(xiàn)地域差異性。

SLCO1B1基因突變與新生兒高膽紅素血癥的關(guān)系為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但目前的研究結(jié)果仍存在差異。2005年Huang［1］發(fā)現(xiàn)SLCO1B1基因 A388G和T521C突變是臺(tái)灣地區(qū)人群發(fā)生高未結(jié)合膽紅素血癥的危險(xiǎn)因素。田桂英等［12］報(bào)告SLCO1B1基因Asn130Asp(A388G突變)多態(tài)性與新生兒黃疸顯著相關(guān)，攜帶Asp突變基因型新生兒發(fā)生黃疸危險(xiǎn)增加。2013年Liu等［13］研究顯示SLCO1B1的388位點(diǎn)突變與中國新生兒黃疸有關(guān)。但也有部分結(jié)果提示SLCO1B1基因突變與新生兒黃疸無關(guān)，傅雯萍等［14］報(bào)告單一存在的SLCO1B1 A388G基因突變與新生兒高膽發(fā)病無關(guān)。Prachukthum等［15］亦指出SLCO1B1基因A388G及C463A突變與新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生沒有相關(guān)性，Wong等［16］研究表明SLCO1B1突變不是馬來西亞新生兒重癥高膽紅素血癥的危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示病例組與對(duì)照組各突變位點(diǎn)基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，提示單一存在的 SLCO1B1 基 因 c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C、c．597C/T突變可能與本地區(qū)人群新生兒高膽發(fā)病無關(guān)，與傅雯萍等［14］及 Wong 等［16］的研究結(jié)果相似。

姜敏等［17］研究結(jié)果提示，SLCO1B1基因388位點(diǎn)突變并不一定影響高膽紅素血癥的膽紅素水平。而張海霞等［3］發(fā)現(xiàn)SLCO1B1基因的T521C多態(tài)性在新生兒高膽紅素血癥患兒中存在明顯差異，A388G多態(tài)性顯著影響新生兒高膽紅素血癥患兒血清膽紅素水平。本研究結(jié)果顯示，在121例高膽紅素血癥新生兒中，同一突變位點(diǎn)不同基因型的總膽紅素水平、未結(jié)合膽紅素水平及直接膽紅素水平比較，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，提示單一存在的SLCO1B1各基因型可能對(duì)本地區(qū)新生兒高膽的黃疸程度影響不大，與姜敏等［17］研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)SLCO1B1基因各位點(diǎn)突變頻率較高，但單一存在的 SLCO1B1 基因 c．388A/G、c．521T/C、c．571T/C、c．597 C/T突變可能與本地區(qū)新生兒高膽紅素血癥發(fā)病無關(guān)，SLCO1B1基因同一突變位點(diǎn)不同基因型可能對(duì)高膽紅素血癥患兒血清膽紅素水平影響不大。SLCO1B1各基因型對(duì)高膽紅素血癥發(fā)病及黃疸程度的影響可能因研究的地區(qū)及人群不同而存在差異，同時(shí)基因突變頻率的差異隨樣本例數(shù)的增多而更真實(shí)可靠。目前已知尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)突變及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6PD)缺乏是新生兒高膽的危險(xiǎn)因素，當(dāng)SLCO1B1突變與UGT1A1突變或是G-6PD缺乏共存時(shí)，是否對(duì)新生兒高膽的黃疸程度產(chǎn)生累積或協(xié)同效應(yīng)，仍有待更多的大樣本的病例對(duì)照研究予以證實(shí)。

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