■ 謝帝芝 陳 芳 劉 臻 聶國(guó)興 魯雙慶

(1.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007；2.長(zhǎng)沙學(xué)院生物工程與環(huán)境科學(xué)系，湖南長(zhǎng)沙410003)

青魚(yú)生長(zhǎng)激素（black carp growth hormone,bc?GH）能促進(jìn)魚(yú)體生長(zhǎng)發(fā)育，加速蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)脂類降解等。酵母不僅是水產(chǎn)餌料中較為理想的蛋白源，而且還是外源基因理想表達(dá)受體系統(tǒng)，表達(dá)蛋白可以正確折疊、糖基化，具有活性等。近年來(lái)，本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了青魚(yú)生長(zhǎng)激素基因工程酵母菌（簡(jiǎn)稱，工程酵母菌）。并以豆粕為發(fā)酵底物，用該菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，以甲醇做基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑，研究了工程酵母菌在豆粕中的發(fā)酵工藝。工程酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)物中既含有促生長(zhǎng)的bcGH蛋白，又含有豆粕降解的肽類物質(zhì)，人們將這種的發(fā)酵豆粕稱為活性菌肽豆蛋白。本研究室利用活性菌肽豆蛋白配合飼料飼喂鯽,結(jié)果表明活性菌肽豆蛋白具有顯著的促生長(zhǎng)效果。上述研究為活性菌肽豆蛋白作為一種新型蛋白飼料，廣泛地應(yīng)用到水產(chǎn)配合飼料中奠定了基礎(chǔ)。

為了能使工程酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物——活性菌肽豆蛋白產(chǎn)業(yè)化，需將其干燥濃縮化。然而，同大多數(shù)微生物一樣，工程酵母菌也具有熱敏性和濕敏性，干燥過(guò)程需要改變物料的溫度和濕度。噴霧干燥是一種生產(chǎn)率高、干燥時(shí)間短，操作工程簡(jiǎn)單且費(fèi)用低的工藝，是最普遍采用的濃縮微生物的方法之一。所以，本研究擬采用噴霧干燥法濃縮活性菌肽豆蛋白，探討干燥工藝參數(shù)對(duì)濃縮活性菌肽豆蛋白中工程酵母菌存活率的影響，為工業(yè)化生產(chǎn)活性菌肽豆蛋白提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

菌種：工程酵母菌為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

菌種活化培養(yǎng)基（MD培養(yǎng)基）：15 g/l瓊脂粉，高壓滅菌20 min，再加入過(guò)濾除菌的13.4 g/l酵母基本氮源、20 g/l葡萄糖和0.4 mg/l生物素；種子培養(yǎng)基（BMGY培養(yǎng)基）：20 g/l胰蛋白胨，10 g/l酵母粉，高壓滅菌20 min，再加入過(guò)濾除菌的13.4 g/l酵母基本氮源、pH值6.0 100 mM磷酸鉀、1%甘油和0.4 mg/l生物素；發(fā)酵培養(yǎng)基：6%豆粕粉；檢測(cè)培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基）：10 g/l酵母提取物，20 g/l胰蛋白胨，20 g/l瓊脂粉，高壓滅菌20 min,再加入過(guò)濾除菌的20 g/l葡萄糖。

1.1.2 儀器與設(shè)備

INFORS AGCH-4103控溫?fù)u床；TOMYSS-325滅菌鍋；Thermo Forma超凈工作臺(tái)；BECKMAN Avanti J-30I離心機(jī)；SHIMADZU UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；數(shù)顯生化培養(yǎng)箱；SY3000發(fā)酵罐；YC-015實(shí)驗(yàn)型噴霧干燥機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

①菌種活化：取-80℃冰箱保藏的工程酵母菌菌種劃線轉(zhuǎn)接到MD培養(yǎng)基，30℃恒溫倒置培養(yǎng)72 h。

②種子培養(yǎng)：接1環(huán)生長(zhǎng)良好的MD平板種子至50 ml種子培養(yǎng)基的500 ml搖瓶中，置于300 r/min恒溫?fù)u床，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，當(dāng)菌液A560為2～6時(shí)，作為發(fā)酵用種子。

③種子濃度的測(cè)定：采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定種子的光密度。以種子培養(yǎng)基作空白對(duì)照，取1 ml種子液于1 cm比色皿中，560 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。

1.2.2 發(fā)酵罐發(fā)酵

使用火焰接種法接種工程酵母菌，將培養(yǎng)好的種子接入裝填量為7 L的10 L發(fā)酵罐。具體發(fā)酵工藝見(jiàn)作者前期研究工作[7]。發(fā)酵完畢后，取100 ml樣本用于檢測(cè)其含菌量。

1.2.3 噴霧干燥

用YC-015實(shí)驗(yàn)型噴霧干燥機(jī)干燥1 L工程酵母菌發(fā)酵液，氣體經(jīng)過(guò)鼓風(fēng)機(jī)后被過(guò)濾并分別加熱到相應(yīng)的溫度，以一定的速度進(jìn)風(fēng)，蠕動(dòng)泵將發(fā)酵液分別以應(yīng)的速度傳送到雙流不銹鋼噴霧器。排出氣體溫度通過(guò)調(diào)控發(fā)酵液進(jìn)樣速度而控制在60℃左右。從旋風(fēng)分離器下收集發(fā)酵產(chǎn)品——活性菌肽豆蛋白（約100 g），取1 g樣本用于檢測(cè)其含菌量。

1.2.4 工程酵母菌計(jì)數(shù)及存活率計(jì)算

取0.1 ml工程酵母菌發(fā)酵液或0.1 g活性菌肽豆蛋白粉末溶于9.9 ml中，用無(wú)菌水逐級(jí)稀釋104倍，再取0.1 ml稀釋液均勻涂布于YPD平板上，30 ℃，倒置培養(yǎng)72 h，計(jì)數(shù)每個(gè)平板上的工程酵母菌菌落數(shù)，同時(shí)做三個(gè)平行。

式中:A為每ml液含菌量；B為每g活性菌肽豆蛋白粉末含菌量；X為0.1 ml稀釋液含菌量；C為工程酵母菌存活率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

結(jié)果以每個(gè)處理3個(gè)平行的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 工程酵母菌發(fā)酵液含菌量

工程酵母菌發(fā)酵液通過(guò)稀釋、倒置培養(yǎng)和計(jì)數(shù)，測(cè)得每1 L發(fā)酵液平均含菌量高達(dá)7.96×109CFU/ml。

2.2 進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)工程酵母菌存活率的影響

為摸索最適的進(jìn)風(fēng)溫度，將進(jìn)風(fēng)速度和進(jìn)樣速度分別固定為在1.10 m3/min和12.00 ml/min，研究不同進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)工程酵母菌存活率的影響（見(jiàn)表1）。結(jié)果表明，工程酵母菌存活率隨著進(jìn)風(fēng)溫度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度為120℃時(shí)，活菌數(shù)高達(dá)2.09×1010CFU/g，存活率最高。進(jìn)風(fēng)溫度越高，表面水分蒸發(fā)得越快，水分蒸發(fā)雖是瞬間，但過(guò)高的溫度也會(huì)導(dǎo)致工程酵母菌大量死亡；進(jìn)風(fēng)溫度太低，工程酵母菌發(fā)酵產(chǎn)品會(huì)因含水量高而嚴(yán)重粘壁，影響產(chǎn)品收集和菌的存活率。

表1 進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)bcGH工程菌存活率的影響

2.3 進(jìn)風(fēng)速度對(duì)工程酵母菌存活率的影響

探討了進(jìn)風(fēng)速度對(duì)工程酵母菌存活率的影響，在進(jìn)風(fēng)速度達(dá)到1.10 m3/min之前，活菌數(shù)和存活率與進(jìn)風(fēng)速度成正比例，而當(dāng)進(jìn)風(fēng)速度超過(guò)1.10 m3/min時(shí)，工程酵母菌存活率明顯下降，其結(jié)果如表2。進(jìn)風(fēng)速度太快，產(chǎn)品不能完全干燥，而且隨廢氣一起排出，降低了工程菌存活率；速度過(guò)慢，也會(huì)因嚴(yán)重粘壁而影響菌的存活率。

表2 進(jìn)風(fēng)速度對(duì)工程酵母菌存活率的影響

2.4 進(jìn)樣速度對(duì)工程酵母菌存活率的影響

表3 進(jìn)樣速度對(duì)工程酵母菌存活率的影響

由表3可以看出，當(dāng)進(jìn)樣速度為14.00 ml/min時(shí)，工程酵母菌存活率有所下降，而進(jìn)樣速度為12.00 ml/min時(shí)，工程酵母菌存活率最高。結(jié)果提示活菌數(shù)和存活率并不是隨著進(jìn)樣速度的增加而一直提高，這是因?yàn)閱挝粫r(shí)間內(nèi)供熱量不變，進(jìn)樣速度越大，干燥效率就越低，造成嚴(yán)重的粘壁現(xiàn)象，影響產(chǎn)品的收集和菌存活率；進(jìn)樣速度太低，單位物料承受的熱量過(guò)大，蒸發(fā)過(guò)度，使菌體大量死亡。

2.5 噴霧干燥正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)大致確定了噴霧干燥的條件，為了使獲得的工程酵母菌存活率達(dá)到最大，選用進(jìn)風(fēng)溫度、進(jìn)風(fēng)速度、進(jìn)樣速度3個(gè)因素，采用3因素4水平正設(shè)計(jì)方法進(jìn)行噴霧干燥條件的優(yōu)選試驗(yàn)，因素水表與正交設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表4和表5。

表4 噴霧干燥正交試驗(yàn)因素水平

根據(jù)表5所示計(jì)算結(jié)果，比較各因素極差R值大小，可以看出各因素對(duì)工程酵母菌存活率的影響主次順序：進(jìn)風(fēng)溫度＞進(jìn)樣速度＞進(jìn)風(fēng)速度，最優(yōu)干燥組合條件為A3B2C3，即進(jìn)風(fēng)溫度120℃，進(jìn)風(fēng)速度1.10 m3/min，進(jìn)樣速度12.00 ml/min。

表5 噴霧干燥正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 噴霧干燥正交試驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn)

將正交試驗(yàn)得到的最佳噴霧干燥條件組合與理論最佳組合（10號(hào)）進(jìn)行比較，每個(gè)組合重復(fù)3次，確定最佳組合。

表6 酵母工程菌存活率正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

表6的數(shù)據(jù)說(shuō)明，通過(guò)正交試驗(yàn)所獲得最佳噴霧干燥工藝條件，重復(fù)性很好，工程酵母菌平均存活率為28.54%，平均值比10號(hào)（A3B2C4）的試驗(yàn)結(jié)果高出5個(gè)百分點(diǎn)，說(shuō)明優(yōu)化條件具有很好大的重現(xiàn)性和可靠性。

3 討論

為了使活性菌肽豆蛋白中工程酵母菌存活率最大化，本文正交實(shí)驗(yàn)探討了噴霧干燥的進(jìn)風(fēng)溫度、進(jìn)風(fēng)速度、進(jìn)樣速度等3個(gè)因素對(duì)工程酵母菌存活率的影響。研究結(jié)果表明，進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)工程酵母菌的存活率影響最大，為主要影響因素。在其它微生物的噴霧干燥研究中，也發(fā)現(xiàn)進(jìn)風(fēng)溫度顯著影響了菌體存活率。例如，張煜等研究表明當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度高于170℃，活性乳酸菌豆粉中的乳酸菌存活量明顯降低。在植物乳桿菌MA2噴霧干燥過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)140℃進(jìn)風(fēng)溫度下得到的發(fā)酵劑活菌數(shù)最高，達(dá)到7.3×108CFU/g，當(dāng)進(jìn)口溫度達(dá)到200℃時(shí)，活菌數(shù)降低到2.7×107CFU/g。本研究也發(fā)現(xiàn)130℃進(jìn)風(fēng)溫度下工程酵母菌存活率低于120℃近4個(gè)百分點(diǎn)。Teixeira等[13]研究發(fā)現(xiàn)噴霧干燥溫度對(duì)微生物的致死作用主要是由于菌體蛋白質(zhì)凝固變性，核酸發(fā)生降解變性失活，從而破壞細(xì)胞的組成；熱溶解細(xì)胞膜上類脂質(zhì)成分形成極小的孔，使細(xì)胞內(nèi)容物流失，從而導(dǎo)致死亡。雖然噴霧干燥影響微生物的存活率，但是相對(duì)冷凍濃縮干燥法來(lái)說(shuō)，其產(chǎn)業(yè)化利用的價(jià)值更大，前景更廣。

4 結(jié)論

活性菌肽豆蛋白的最適宜干燥工藝條件為：進(jìn)風(fēng)溫度為120℃、進(jìn)風(fēng)速度為1.10 m3/min，進(jìn)樣速度為12.00 ml/min下，在此組合條件下活性菌肽豆蛋白中的工程酵母菌活菌數(shù)高達(dá)2.10×1010CFU/g，存活率為28.54%。本試驗(yàn)驗(yàn)證了噴霧干燥方法對(duì)活性菌肽豆蛋白干燥是完全可行的，為工業(yè)化生產(chǎn)活性菌肽豆蛋白的新型微生態(tài)飼料添加劑提供試驗(yàn)依據(jù)。

（參考文獻(xiàn)13篇，刊略，需者可函索）