張春云 沈 璐 林純意

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東廣州510700

參麥對(duì)支氣管哮喘大鼠慢性氣道炎癥的干預(yù)作用

張春云 沈 璐 林純意

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東廣州510700

目的探討參麥對(duì)支氣管哮喘大鼠慢性氣道炎癥的干預(yù)作用。方法選用健康SPF級(jí)SD大鼠60只，用吸入卵清蛋白（OVA）致敏及激發(fā)誘喘的方法建立大鼠哮喘模型，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、激素組和參麥高劑量聯(lián)合激素組、參麥中劑量聯(lián)合激素組、參麥低劑量聯(lián)合激素組，同時(shí)設(shè)立正常SD大鼠為對(duì)照組，每組10只。模型組注射0.9%生理鹽水，激素組注射地塞米松0.5 mg/kg，參麥組注射地塞米松0.5 mg/kg加參麥注射液（低劑量組1 mL、中劑量組1.5 mL、高劑量組2 mL），用藥14 d結(jié)束。比較各組肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞分類計(jì)數(shù)及細(xì)胞因子水平。結(jié)果①模型組BALF中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)低于對(duì)照組，淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于對(duì)照組（P＜0.05）；參麥高劑量聯(lián)合激素組、參麥中劑量聯(lián)合激素組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于激素組、模型組，淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)低于激素組、模型組（P＜0.05）；參麥高劑量聯(lián)合激素組、參麥中劑量聯(lián)合激素組BALF中白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。②模型組BALF中γ干擾素（IFN-γ）水平、干擾素-γ/白介素-4（IFN-γ/IL-4）低于對(duì)照組，IL-4水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；參麥高劑量聯(lián)合激素組、參麥中劑量聯(lián)合激素組IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4高于激素組、模型組，IL-4水平低于激素組、模型組（P＜0.05）；參麥高劑量聯(lián)合激素組、參麥中劑量聯(lián)合激素組IFN-γ、IL-4水平、IFN-γ/IL-4與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論抑制BALF中淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞含量，影響IL-4、IFN-γ的表達(dá)，糾正失衡Th1/Th2的細(xì)胞因子比例，可能是參麥注射液干預(yù)支氣管哮喘大鼠慢性氣道炎癥的機(jī)制之一。

支氣管哮喘；炎癥；參麥注射液

支氣管哮喘是一種慢性炎癥性疾病，以氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥、杯狀細(xì)胞的肥厚增生、對(duì)吸入抗原的氣道高反應(yīng)性為特征[1]。支氣管哮喘的發(fā)病原因與病理機(jī)制復(fù)雜，具有長(zhǎng)期性、周期性、反復(fù)性的特點(diǎn)[2]。近年來(lái)，支氣管哮喘發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)人類的健康造成嚴(yán)重威脅，臨床多采用糖皮質(zhì)激素治療。《支氣管哮喘指南》指出，糖皮質(zhì)激素可通過(guò)多個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞為主的慢性氣道炎癥進(jìn)行抑制[3]。但是，激素的抵抗、長(zhǎng)期大量運(yùn)用糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生的嚴(yán)重副作用等均影響了其臨床使用。本次研究采用吸入卵清蛋白（OVA）致敏及激發(fā)誘喘的方法建立大鼠哮喘模型，應(yīng)用不同濃度的參麥注射液及地塞米松進(jìn)行干預(yù)，探討參麥治療支氣管哮喘的可能機(jī)制，為尋找更有效的治療支氣管哮喘的方法，減少大劑量激素使用的副作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

動(dòng)物：健康SPF級(jí)SD大鼠60只，由廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)：SYXK（粵）2013-0093，體重為（180±20）g，雌雄各半，20℃室溫飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。

主要試劑：卵蛋白（OVA，美國(guó)Sigma公司），地塞米松磷酸鈉注射液（天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司），參麥注射液（河北神威藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），大鼠γ干擾素（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（EILSA）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)9681211218），大鼠白介素4（IL-4）EILSA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)1287128425）。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠哮喘模型首日致敏予腹腔內(nèi)注射10%卵蛋白（OVA）和10%氫氧化鋁混合液1mL（OVA 0.1mg、氫氧化鋁1 mg），第7日重復(fù)1次以加強(qiáng)致敏；2周后，將大鼠置入自制透明霧化吸入箱，予1%OVA霧化吸入（霧粒直徑3～5 μm），每日1次，每次30 min，連續(xù)2周。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、激素組和參麥高劑量聯(lián)合激素組、參麥中劑量聯(lián)合激素組、參麥低劑量聯(lián)合激素組，同時(shí)設(shè)立正常SD大鼠為對(duì)照組，每組10只。從造模第15天起，模型組大鼠尾靜脈注射0.9%生理鹽水2 mL，激素組注射地塞米松0.5 mg/kg，參麥組注射地塞米松0.5 mg/kg分別加參麥注射液1 mL（低劑量組）、1.5 mL（中劑量組）、2 mL（高劑量組），各組每天注射1次，用藥14 d。

1.2.3 標(biāo)本收集在末次用藥2 h后，每組取8～10只大鼠，用10%的水合氯醛350 mg/kg進(jìn)行麻醉，于左側(cè)主支氣管進(jìn)行氣管插管，進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液（BALF）10 mL進(jìn)行離心沉淀；同時(shí)剪取右側(cè)肺組織0.5～1 g備用。

1.2.4 肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)及細(xì)胞因子檢測(cè)BALF細(xì)胞沉淀重懸后制備涂片，蘇木精-伊紅（HE）染色。光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分類計(jì)數(shù)（中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞）。ELISA法檢測(cè)BALF中IL-4、IFN-γ水平，并計(jì)算IFN-γ/IL-4。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組支氣管哮喘大鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)比較

模型組BALF中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)低于對(duì)照組，淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；激素組、參麥高劑量聯(lián)合激素組、參麥中劑量聯(lián)合激素組、參麥低劑量聯(lián)合激素組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于模型組，淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；參麥中劑量聯(lián)合激素組、參麥高劑量聯(lián)合激素組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于激素組，淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)低于激素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；參麥高劑量聯(lián)合激素組、參麥中劑量聯(lián)合激素組BALF中白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組支氣管哮喘大鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞因子水平比較

模型組BALF中IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4低于對(duì)照組，IL-4水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；激素組、參麥高劑量聯(lián)合激素組、參麥中劑量聯(lián)合激素組、參麥低劑量聯(lián)合激素組IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4高于模型組，IL-4水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；參麥中劑量聯(lián)合激素組、參麥高劑量聯(lián)合激素組IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4高于激素組，IL-4水平低于激素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），參麥高劑量聯(lián)合激素組、參麥中劑量聯(lián)合激素組IFN-γ、IL-4水平、IFN-γ/IL-4與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

支氣管哮喘簡(jiǎn)稱哮喘，是一種常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)慢性炎癥性疾病，主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、胸悶等，是一種由遺傳、環(huán)境、行為、心理等多種因素誘發(fā)的疾病，常在春秋季節(jié)或上呼吸道感染后發(fā)作。近年來(lái)，哮喘發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高趨勢(shì)，病情遷延，反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，已經(jīng)成為一種威脅公共健康最主要的肺部慢性疾病[4-5]。支氣管哮喘的病理特征是氣道慢性炎癥，多種炎癥細(xì)胞因子均參與了哮喘的免疫應(yīng)答及免疫調(diào)解[6]。形成和維持氣道炎癥并進(jìn)而引起組織損傷和氣道功能障礙的一個(gè)主要原因?yàn)檠装Y細(xì)胞在氣道的局部聚集、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放[7]。嗜酸性粒細(xì)胞是哮喘氣道炎癥的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，其浸潤(rùn)程度與氣道受阻的嚴(yán)重性及疾病的預(yù)后有密切的關(guān)系[8]。淋巴細(xì)胞是哮喘發(fā)病的始發(fā)效應(yīng)之一，在嗜酸性粒細(xì)胞分化、成熟、趨化和激活的過(guò)程中起中樞調(diào)節(jié)作用。氣道炎癥走向消退的重要基礎(chǔ)之一為淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的凋亡及清除[9]。本次研究中，模型組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)低于對(duì)照組，淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與哮喘炎性反應(yīng)性疾病的特征相符合，提示支氣管哮喘大鼠模型造模成功。

目前，哮喘經(jīng)典路徑的主要學(xué)說(shuō)為T輔助細(xì)胞（Th）的兩個(gè)亞群Th1/Th2平衡失調(diào)。Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)應(yīng)答及Th1細(xì)胞低表達(dá)為支氣管哮喘病理形成過(guò)程的重要調(diào)控因素[10]。Th是免疫反應(yīng)重要的調(diào)控/效應(yīng)細(xì)胞，可分成Th1亞群和Th2亞群，生理狀態(tài)下，機(jī)體的Th1和Th2細(xì)胞間處于動(dòng)態(tài)平衡，Th1和Th2細(xì)胞因子以相互拮抗和自身促進(jìn)的方式形成復(fù)雜有序的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，對(duì)正常的免疫應(yīng)答進(jìn)行調(diào)節(jié)[11]，如果Th1/Th2的極化發(fā)生了偏移則容易誘發(fā)病理改變[12]。IFN-γ與IL-4為Th1和Th2型T細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子，哮喘急性發(fā)作時(shí)，IFN-γ水平降低，IL-4水平升高，使Th1和Th2之間的動(dòng)態(tài)平衡受到影響，哮喘患者體內(nèi)IgE合成增多，促使了Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生[13]。本次研究結(jié)果表明，模型組IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4低于對(duì)照組，IL-4水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與哮喘發(fā)生發(fā)展過(guò)程具有一致性，提示哮喘大鼠造模成功。

臨床上治療哮喘多采用糖皮質(zhì)激素類藥物，可使氣道的炎癥程度有效降低，哮喘患者的肺功能也得到顯著改善，但必須持續(xù)給藥才能達(dá)到上述治療效果，如果停止用藥則可能會(huì)導(dǎo)致哮喘再次發(fā)作。此外，糖皮質(zhì)激素可引起不同程度的全身性副作用或者由于治療過(guò)程繁瑣、治療時(shí)間較長(zhǎng)導(dǎo)致患者依從性較差。參麥注射液源于《癥因脈治》中的麥冬飲，是臨床常用的中成藥，主要成分為人參、麥冬；其中，人參為五加科植物的干燥根，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津止渴、安神益智的功效；麥冬為百合科植物沿階草的塊根，有養(yǎng)陰生津、潤(rùn)肺清心的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，參麥注射液在抗感染方面及機(jī)體免疫狀態(tài)作用的調(diào)節(jié)方面均有較好的作用，興奮垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)功能可能是其抗感染作用的主要機(jī)制[14]，使體內(nèi)腎上腺皮質(zhì)激素水平明顯提高，前列腺E水平顯著降低，抑制炎性反應(yīng)，能激活吞噬功能，使機(jī)體細(xì)胞免疫功能顯著提高[15]。張麗君等[16]研究發(fā)現(xiàn)，參脈注射液可使哮喘患者的免疫功能顯著提高。本次研究中參麥高劑量聯(lián)合激素組、參麥中劑量聯(lián)合激素組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于模型組，淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示參麥注射液能改善支氣管哮喘大鼠炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，使BALF中嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的數(shù)目明顯減少，而中性粒細(xì)胞數(shù)目明顯增加。參麥高劑量聯(lián)合激素組、參麥中劑量聯(lián)合激素組BALF中白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示參麥高劑量聯(lián)合激素組、參麥中劑量聯(lián)合激素組的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相近，不同劑量參麥注射液對(duì)哮喘氣道炎癥的抑制作用不同。本研究結(jié)果顯示，參麥高劑量聯(lián)合激素組、參麥中劑量聯(lián)合激素組IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4高于模型組，IL-4水平低于模型組（P＜0.05）；參麥高劑量聯(lián)合激素組、參麥中劑量聯(lián)合激素組IFN-γ、IL-4水平、IFN-γ/IL-4與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；提示參麥高、中劑量均可使哮喘大鼠的炎性反應(yīng)受到抑制，抑制IL-4分泌，促進(jìn)IFN-γ的生成，可調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，效果優(yōu)于激素組，而參麥高劑量、中劑量作用效果差別不大。

綜上所述，參麥注射液可抑制支氣管哮喘大鼠慢性氣道炎性反應(yīng)，能升高BALF中的中性粒細(xì)胞含量，降低淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞含量，能顯著降低BALF中IL-4水平，升高IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4。抑制BALF中淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞含量，影響IL-4、IFN-γ的表達(dá)，糾正失衡Th1/Th2的細(xì)胞因子比例，使免疫反應(yīng)由Th2型向Th1型逆轉(zhuǎn)，可能是參麥注射液干預(yù)支氣管哮喘的機(jī)制之一，但具體的作用機(jī)制還需深入研究。

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Intervention effect of Shenmai for chronic airway inflammation of rats with bronchial asthma

ZHANG ChunyunSHEN LuLIN Chunyi
Department of Respiratory Medicine,the Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangdong Province,Guangzhou510700,China

ObjectiveTo investigate the intervention effect of Shenmai for chronic airway inflammation of rats with bronchial asthma.Methods60 healthy SPF rats were selected in this study.The rat model of asthma was established by inhaled ovalbumin(OVA)sensitization and asthma induced excitation method.All the successful model rats were randomly divided into model group,hormone group and high dose Shenmai combined with hormone group,middle dose Shenmai combined with hormone group,low dose Shenmai combined with hormone group,while the normal SD rats were selected as control group,each group had 10 rats.Model group was injected with 0.9%saline,hormone group was given Dexamethasone 0.5 mg/kg,Shenmai group was given Dexamethasone 0.5 mg/kg plus Shenmai injection(1 mL of low dose group,1.5 mL of middle dose group,2 mL of high dose group),all rats were medicated for 14 days.The cell count and cytokines levels in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)of all the groups were compared.Results①Neutrophils count in BALF of model group was lower than that of the control group;while lymphocytes,eosinophils counts were higher than the control group(P＜0.05).Neutrophils count in BALF of high dose Shenmai combined with hormone group,middle dose Shenmai combined with hormone group were higher than hormone group,model group;while lymphocytes,eosinophils counts were lower than those of the hormone group,model group(P＜0.05).There were no significant differences in BALF leukocyte counts among high dose Shenmai combined with hormone group,middle dose Shenmai combined with hormone group and control group(P＞0.05).②IFN-γ,IFN-γ/IL-4 in BALF of model group were lower than those of the control group,IL-4 level was higher than the control group(P＜0.05).IFN-γ level,IFN-γ/ IL-4 in BALF of high dose Shenmai combined with hormone group,middle dose Shenmai combined with hormone group were higher than those of the hormone group,model group;IL-4 level was lower than those of the hormone group,model group(P＜0.05).There were no significant differences in IFN-γ,IL-4 levels,IFN-γ/IL-4 among high dose Shenmai combined with hormone group,middledose Shenmai combined with hormone group and control group(P＞0.05).ConclusionSuppression of BALF lymphocytes,eosinophils content,influence of IL-4 and IFN-γ expression,correction of imbalance proportion of cytokine Th1/ Th2,may be one of the mechanisms of Shenmai Injection for chronic airway inflammation of rats with bronchial asthma.

Bronchial asthma;Inflammation;Shenmai Injection

R562.25

A

1673-7210（2015）04（b）-0007-04

2015-01-01本文編輯：程銘）

廣東省中醫(yī)藥局科研課題（編號(hào)20141174）。