伊莉雅 冮巖 伊德林

對(duì)長(zhǎng)期冷藏保存的雙胸蚓溶栓酶活性分析

伊莉雅 冮巖 伊德林

目的探討雙胸蚓屬蚯蚓體內(nèi)提取的溶栓酶保存與穩(wěn)定性。方法采用Folin-酚試劑法,對(duì)4℃冷藏保存220個(gè)月的溶栓酶制劑的酶活性測(cè)定, 并觀測(cè)對(duì)人實(shí)驗(yàn)性血凝塊的溶解作用。結(jié)果4℃冷藏保存220個(gè)月的溶栓酶制劑的活性為55.1 U/ml；完全溶解(30±5)mg 血凝塊的時(shí)間為(4.3±0.8)h,與冷藏保存初酶活性測(cè)定值和溶解血凝塊時(shí)間變化在10%左右。結(jié)論發(fā)現(xiàn)在4℃保存的溶栓酶制劑能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間, 提示該溶栓酶具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

雙胸蚓溶栓酶；冷藏保存；酶活性測(cè)定

祖國(guó)醫(yī)學(xué)以蚯蚓作為藥源, 在我國(guó)已有悠久的歷史。而現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的應(yīng)用, 不僅從蚯蚓體內(nèi)提取了具有纖溶作用的蛋白酶, 而且從我國(guó)特有的雙胸蚓屬(bimastus)蚯蚓體內(nèi)獲得了具有纖溶活性的蛋白質(zhì)基因并得到了克隆和表達(dá)［1］。沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院早于1992年開始雙胸蚓溶栓酶(bimastos thrombolytic enzyme, BTE)的研究, 并按注射劑要求, 成功試制了BTE水溶液制劑。長(zhǎng)期和大量實(shí)驗(yàn)研究證明, BTE制劑具有強(qiáng)烈的溶解纖維蛋白的作用, 對(duì)家兔和人的實(shí)驗(yàn)性血凝塊也有明顯的溶解作用, 對(duì)于實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物缺血性腦損傷具有保護(hù)、抗凝、去栓和促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)等作用［2］。雙胸蚓適應(yīng)性較強(qiáng), 方便異地飼養(yǎng), 經(jīng)采集處理后,又可在-18℃條件長(zhǎng)期保存。從蚯蚓體內(nèi)提取溶栓酶成本低,又具有中藥應(yīng)用基礎(chǔ), 是一條適合我國(guó)國(guó)情的新藥發(fā)展道路［3］。因此, 研制和批量生產(chǎn)BTE注射劑, 對(duì)于危害人類極大的心腦血管栓塞為主的血栓性疾病治療突顯了誘人和可期的前景。本實(shí)驗(yàn)為BTE注射劑保存與穩(wěn)定性的研究提供實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)與依據(jù), 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院原生物化學(xué)研究室, 用自養(yǎng)一年以上的雙胸蚓研制并置于4℃冷藏保存220個(gè)月的BTE制劑。

1.2 主要試劑、儀器 酪蛋白(上海化學(xué)試劑廠產(chǎn)), 酪氨酸(上?？颠_(dá)氨基酸廠產(chǎn)), Folin-酚試劑為生物化學(xué)教研室配制并標(biāo)定；水浴恒溫震蕩器, 722-光柵分光光度計(jì)為廈門分析儀器廠產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 酶活性測(cè)定 根據(jù)BTE能水解酪蛋白的性質(zhì), 以水解底物酪蛋白程度表示, 即用Folin-酚試劑法測(cè)定產(chǎn)物酪氨酸的含量, 在37℃、pH 8.0條件, 每分鐘水解1 μg酪氨酸為一個(gè)酶單位(U)。

1.3.2 人血凝塊的制備 取健康人全血置于4～6℃保存24 h的血凝塊, 先用生理鹽水洗去表面血細(xì)胞, 再用濾紙輕輕吸去表面水分, 用手術(shù)刀片切成(30±5)mg血凝塊備用。

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1 酶活性測(cè)定 隨機(jī)抽取不同包裝(總數(shù)1500支)冷藏保存的BTE制劑(61.8 U/ml)10支作為樣品, 按實(shí)驗(yàn)方法操作,測(cè)得BTE制劑的酶活性平均為55.1 U/ml, 與原值比較, 保留近90%生物活性。

2.2 BTE對(duì)人血凝塊的作用 另隨機(jī)抽取上述冷藏保存的BTE制劑10支作為樣品。先取1.5×10 cm試管13支, 將上述10支BTE樣品各取2 ml, 分別加入10支試管中, 余3支試管各加入2 ml 0.9%生理鹽水作對(duì)照, 然后把人工制成的血凝塊分別放入各試管中, 于37℃、60次/min水浴恒溫震蕩器中, 觀察完全溶栓的時(shí)間。結(jié)果, 完全溶解的時(shí)間為(4.3±0.8) h, 與原溶栓的時(shí)間(3.8±0.8)h比較, 延遲了0.5 h, 3支對(duì)照管>24 h均不溶解。

3 討論

從1980年起, 開始發(fā)現(xiàn)蚯蚓體內(nèi)含有纖溶酶及纖溶酶原激活物樣成分, 其間對(duì)酶的提取工藝、酶學(xué)性質(zhì)及藥理作用作了廣泛深入的研究, 口服制劑多有研制, 在臨床上是預(yù)防和治療血栓性疾病的有效藥物, 但由于各種原因注射劑尚無(wú)正式產(chǎn)品, 當(dāng)前批準(zhǔn)使用的溶栓藥物均為纖溶酶原激活劑,其應(yīng)用受到出血并發(fā)癥和血栓部位纖溶酶原含量不足的限制。腦血管疾病為臨床常見的危重急癥, 腦血栓又是最常見的類型, 溶栓藥物如鏈激酶、尿激酶常被臨床作為首選藥物,但治療劑量難于掌握, 且也有引起內(nèi)出血的副作用, 而鏈激酶還有抗原性, 因而對(duì)腦血栓的預(yù)防和治療藥物的研制已引起醫(yī)學(xué)界的高度重視［4-6］。

BTE是一種絲氨酸蛋白水解酶, 其制劑是用親和層析、超濾截留及無(wú)菌灌封等高新技術(shù)制備的含與人體近乎等滲(0.9%NaCl)的水溶液無(wú)菌無(wú)熱源制劑。本院及其他研究單位經(jīng)SDS-PAGE電泳法顯示, BTE分子量在29～30 KD之間,且是由一條肽鏈組成, 編碼含242個(gè)氨基酸的成熟肽。采用Folin-酚試劑法測(cè)定BTE活性與酶的含量成正比, 且與溶解血凝塊作用相平行, 通過對(duì)酪蛋白水解作用和對(duì)人的實(shí)驗(yàn)性血凝塊溶栓作用實(shí)驗(yàn)觀測(cè), 充分的說明了BTE制劑在4℃能較長(zhǎng)時(shí)間保存, BTE具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。在實(shí)驗(yàn)中, 對(duì)BTE制劑又進(jìn)行了超濾截留, 對(duì)超濾流出液(無(wú)蛋白濾液)進(jìn)行酶活性和溶解血凝塊作用的觀測(cè), 其無(wú)酶蛋白濾液的酶活性和溶解血凝塊的作用為零, 這進(jìn)一步說明了BTE酶活性是活性蛋白酶的作用而不是其他小分子。需要明確的是, BTE水溶液制劑在4℃雖能較長(zhǎng)時(shí)間保存, 但在批量生產(chǎn)和廣泛使用的情況下, 為方便儲(chǔ)存、運(yùn)輸和使用, 生產(chǎn)凍干粉針劑是十分必要的。

溫度和時(shí)間是影響酶活性的二個(gè)重要因素, 也是研究藥物保存期限的重要參數(shù)。有報(bào)道［7］, 蚓激酶粉劑在4℃和室溫儲(chǔ)存1個(gè)月, 其殘留活性分別下降至96.5%和94.2%, 而儲(chǔ)存3個(gè)月則為91.8%和73.1%, 相對(duì)BTE水溶液制劑穩(wěn)定性較好的原因不清, 推測(cè), 可能與單鏈分子特定結(jié)構(gòu)有關(guān), 同時(shí)與保存在無(wú)菌, pH近7.0, 冷藏的環(huán)境有關(guān), 另外鈉和氯離子對(duì)酶的穩(wěn)定性是否起一定作用有待研究。

BTE熱穩(wěn)定性好是水溶液制劑穩(wěn)定的前提, 該酶在pH 4.7～11.0范圍內(nèi)穩(wěn)定, 最適pH為8.0, 最適溫度為57℃,于25～50℃保溫3 h, 酶活力基本不變, 甚至pH值為1、溫度達(dá)到100℃時(shí), 仍具有較強(qiáng)的活性。沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院研究者盧志玉及本作者等曾于1995年研究BTE并報(bào)告, 采用ArrheniUs指數(shù)定律為基礎(chǔ)的經(jīng)典加速實(shí)驗(yàn)法, 求得在室溫下酶活性降低10%為55 d, 在4℃下為216 m。本實(shí)驗(yàn)有力的證實(shí)了這一經(jīng)驗(yàn)推斷。

［1］程牛亮, 牛勃, 張祖珣, 等.雙胸蚓纖溶酶的純化及性質(zhì).生物化學(xué)雜志, 1990, 6(2):186-190.

［2］徐義輝, 梁國(guó)棟, 孫兆軍, 等.蚯蚓纖溶酶新基因PV242的克隆與表達(dá).生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2002, 29(4):610-614.

［3］陳飛, 李莉, 孟憲志, 等.蚯蚓溶栓酶基因的克隆及非融合性表達(dá).中國(guó)藥學(xué)雜志, 2003, 38(12):961-963.

［4］陳飛, 孟憲志, 李莉, 等.蚯蚓纖溶酶基因P-239的原核表達(dá)、純化及活性測(cè)定.微生物學(xué)雜志, 2004, 24(1):19-21.

［5］范純富, 趙潤(rùn)英, 張革, 等.雙胸蚓溶栓酶對(duì)大鼠血栓形成及血液流變學(xué)的影響.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1996, 10(3):9.

［6］劉芬蘭, 張志芬, 富成志.雙胸蚯蚓溶栓酶對(duì)胎鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的影響.解剖科學(xué)進(jìn)展, 1997, 3(4):345.

［7］劉芬蘭, 姚萬(wàn)才, 富成志, 等.雙胸蚓溶栓酶抗實(shí)驗(yàn)性缺血性腦損傷作用的研究.解剖學(xué)雜志, 1997, 20(6):570.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.04.187

2014-11-14］

110044 沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院藥劑科(伊莉雅)；沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室 (冮巖 伊德林)