胡 成，成大榮，余樹培，趙 方，蘇玲玲，蔡樹東，顧玲玲，王永娟

（1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用

胡 成1，成大榮1，余樹培1，趙 方1，蘇玲玲1，蔡樹東1，顧玲玲1，王永娟2

（1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）是一門新興的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，因其具有高特異性、高靈敏度、簡(jiǎn)便快捷、成本低廉等特點(diǎn)，受到越來(lái)越多獸醫(yī)工作者的關(guān)注。目前，該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種病原微生物的檢測(cè)。本文就環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理、方法、應(yīng)用等方面進(jìn)行簡(jiǎn)述，最后指出LAMP當(dāng)前存在的一些不足之處，并對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行了展望，以期為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)；動(dòng)物疫病；應(yīng)用；檢測(cè)

核酸的體外擴(kuò)增技術(shù)是生命科學(xué)領(lǐng)域中最常用的研究方法及重要工具之一，自20世紀(jì)80年代聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）問(wèn)世以來(lái)，在分子生物學(xué)領(lǐng)域、醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域和傳染病檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[1]。但是，由于核酸的檢測(cè)過(guò)程往往需要昂貴的儀器設(shè)備、專業(yè)的技能型人才、復(fù)雜的操作過(guò)程、冗長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)周期等，不能適應(yīng)基層及現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)需要，限制了相關(guān)技術(shù)的推廣應(yīng)用[2]。

2000年，日本榮研株式會(huì)社的Tsugunori Notomi 等人開發(fā)了一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法—環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），利用該技術(shù)只需在恒溫條件下（60℃～65℃）孵育幾十分鐘即可快速完成核酸的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，無(wú)須購(gòu)置昂貴的PCR儀，操作簡(jiǎn)單、快速，產(chǎn)物易于檢測(cè)，特別適用于基層和現(xiàn)場(chǎng)一線的快速檢測(cè)[3]。短短幾年時(shí)間，該技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)療衛(wèi)生、食品安全、胚胎鑒定、動(dòng)植

物檢驗(yàn)檢疫、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品等多個(gè)領(lǐng)域的檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用[4]。本文將選取近年來(lái)LAMP技術(shù)在動(dòng)物疾病預(yù)防控制過(guò)程中病原微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)單綜述。

1 技術(shù)原理

1.1 擴(kuò)增基礎(chǔ)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是通過(guò)4條特殊的引物對(duì)靶基因序列上6個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行退火雜交，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）提供反應(yīng)的動(dòng)力，實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下完成對(duì)目的片段的大量擴(kuò)增，由于規(guī)避了常規(guī)PCR反應(yīng)的變性、退火、延伸等一系列復(fù)雜的過(guò)程，大大節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間和成本，為臨床和現(xiàn)場(chǎng)一線的快速檢測(cè)提供可能[5]。

1.2 引物設(shè)計(jì)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增對(duì)引物特異性要求非常高，設(shè)計(jì)也更為復(fù)雜，需要2對(duì)引物，即2條外引物（B3/ F3）和2條內(nèi)引物（FIP/BIP）：外部引物限定了擴(kuò)增的范圍，即目的片段的大小，同時(shí)為內(nèi)部引物提供了模板；內(nèi)部引物與目的片段部分互補(bǔ)并實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度最好在300 bp以內(nèi)，因?yàn)殡S著序列的延長(zhǎng)擴(kuò)增效率隨之降低，超過(guò)500 bp的序列就很難擴(kuò)增了。有實(shí)驗(yàn)表明，在LAMP反應(yīng)中加入環(huán)引物（LF/LB）能夠明顯加快擴(kuò)增的速度，大大縮短檢測(cè)的時(shí)間，檢出率也有所提高。

1.3 擴(kuò)增程序

LAMP的擴(kuò)增過(guò)程包括：循環(huán)起始復(fù)合物的形成、循環(huán)擴(kuò)增、延伸和再循環(huán)4個(gè)階段。呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)的循環(huán)起始復(fù)合物是整個(gè)LAMP反應(yīng)中最重要的環(huán)節(jié)。內(nèi)引物通過(guò)結(jié)合到莖環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)狀區(qū)域的互補(bǔ)序列上，在Bst DNA聚合酶的作用下合成、延伸并發(fā)生置換。如此往復(fù)循環(huán)，形成一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)及多環(huán)花椰菜結(jié)構(gòu)。在反應(yīng)體系中加入甜菜堿、MgSO4等成分，使得酶活性大大提升，30～60 min即可進(jìn)行結(jié)果判定[6]。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 肉眼觀察法。LAMP在合成DNA的同時(shí)會(huì)從dNTPs中析出大量副產(chǎn)物焦磷酸根離子，它們能與反應(yīng)液中的鎂離子結(jié)合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，可以通過(guò)肉眼直接觀察有無(wú)乳白色渾濁來(lái)判斷擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行與否。有報(bào)道指出，擴(kuò)增結(jié)束后，經(jīng)短暫瞬時(shí)離心可使沉淀集中于管底，更加便于觀察。

1.4.2 熒光染料法。當(dāng)反應(yīng)不徹底導(dǎo)致焦磷酸鎂沉淀不足時(shí)，往往會(huì)對(duì)判斷造成一定的偏差，產(chǎn)生假陰性或假陽(yáng)性，可以通過(guò)添加適量的熒光染料（如溴化乙啶EB或SYBR Green I）的方法進(jìn)行輔助觀察：它們是高靈敏度的DNA染料，與雙鏈DNA的親和力非常高，一旦結(jié)合其熒光信號(hào)會(huì)增強(qiáng)800-1 000倍，用來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增是否發(fā)生，可確保其準(zhǔn)確性。

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳法。LAMP最終的產(chǎn)物是若干莖環(huán)狀DNA片段組成的混合物，即有若干倍莖長(zhǎng)度的環(huán)結(jié)構(gòu)和類似花椰菜的結(jié)構(gòu)。因此，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后于紫外燈下呈現(xiàn)的是典型的梯形條帶，而不是只有一條帶。

1.4.4 濁度儀檢測(cè)法。日本榮研株式會(huì)社利用LAMP反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生焦磷酸鎂乳白色沉淀在400 nm處有吸收峰的原理，研制出專門用于LAMP檢測(cè)的實(shí)時(shí)濁度儀。通過(guò)檢測(cè)沉淀的形成量，對(duì)反應(yīng)中DNA的合成量進(jìn)行反推，從而對(duì)LAMP可進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)和定量[7]。

2 技術(shù)特點(diǎn)

2.1 高特異性

針對(duì)靶基因序列上6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的4條順序相連的特異性引物，任何一處不相匹配均不能進(jìn)行反應(yīng)，幾乎不可能出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的情況，因此可以根據(jù)是否擴(kuò)增判斷目的基因存在與否，即能夠進(jìn)行病原的定性檢測(cè)。

2.2 高靈敏性

LAMP的最低檢測(cè)限至少是傳統(tǒng)PCR方法的100倍以上，達(dá)到甚至超過(guò)real-time Taqman PCR的檢測(cè)水平，有報(bào)道指出最低可檢測(cè)10個(gè)拷貝或更低。

2.3 高效快速

經(jīng)過(guò)優(yōu)化過(guò)的體系，整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)一般可在

60 min內(nèi)將靶基因由幾個(gè)拷貝擴(kuò)增至109～1010數(shù)量級(jí)水平，若再引入兩條環(huán)引物（LF/LB），時(shí)間可以進(jìn)一步縮短1/3～1/2。而傳統(tǒng)的PCR方法因?yàn)橛凶儚?fù)性、升降溫的過(guò)程，反應(yīng)一般在90 min以上。

2.4 操作簡(jiǎn)便

因?yàn)榉磻?yīng)過(guò)程中無(wú)須進(jìn)行變復(fù)性溫度循環(huán)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，恒溫條件下即可進(jìn)行擴(kuò)增。所有反應(yīng)試劑可進(jìn)行預(yù)混并分裝凍存，檢測(cè)時(shí)只需加入待檢樣品，混合均勻，置于水浴鍋中孵育一定時(shí)間，即可實(shí)現(xiàn)快速鑒定。

2.5 一步擴(kuò)增RNA

只要在原有試劑的基礎(chǔ)上加入逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑，就能夠完全像DNA基因擴(kuò)增那樣，一步實(shí)現(xiàn)RNA的擴(kuò)增，將逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程和擴(kuò)增過(guò)程在同一個(gè)反應(yīng)管中完成[8]。

3 技術(shù)應(yīng)用

3.1 在細(xì)菌性疾病檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1.1 產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的檢測(cè)。產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shinga Toxin-producing Escherichia Coli，STEC）是引起仔豬水腫病的重要病原，由某些血清型溶血性大腸桿菌產(chǎn)生。馮瑜菲[9]等參照GenBank中登陸的基因序列，針對(duì)其保守區(qū)域（Stx2e基因）使用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4設(shè)計(jì)了特異性LAMP引物，利用煮沸法提取模板，分別進(jìn)行PCR和LAMP擴(kuò)增對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，LAMP檢測(cè)模板的最低檢測(cè)限為3.8×101cfu/管，而PCR方法的最低檢測(cè)限為3.8×103cfu/管，LAMP方法的靈敏性是PCR方法的100倍。模擬樣品的檢測(cè)結(jié)果提示，兩者的檢出率都是40%，符合率為100%。

3.1.2 布魯氏菌的檢測(cè)。布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種人畜共患傳染病，可引起流產(chǎn)、不孕和各種組織的局部病灶。本病廣泛分布于世界各地，家畜中以豬、牛、羊最易發(fā)病，給畜牧業(yè)和一線獸醫(yī)工作人員帶來(lái)嚴(yán)重危害。目前，布魯氏菌病診斷技術(shù)主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）、乳環(huán)試驗(yàn)（MRT）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法。許鄒亮[10]等針對(duì)布魯氏菌外膜蛋白OMP25基因保守區(qū)設(shè)計(jì)6條引物，于反應(yīng)前將羥基萘酚藍(lán)（HNB）染料加入體系中作為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增的指示劑，在水浴鍋中63 ℃反應(yīng)60 min即可通過(guò)HNB顏色變化進(jìn)行結(jié)果判定。該方法特異性良好，對(duì)大腸桿菌K99、巴氏桿菌C48-1、豬鏈球菌ST171、綠膿桿菌等對(duì)照組均未見擴(kuò)增。針對(duì)60份RBT檢測(cè)陽(yáng)性血清的平行檢測(cè)結(jié)果顯示，LAMP和B4/ B5-PCR這兩種方法檢測(cè)的結(jié)果符合率為85.0%。LAMP的最低檢測(cè)限可達(dá)17 fg，敏感性高于B4/ B5-PCR方法100～1 000倍，達(dá)到甚至高于熒光定量PCR檢測(cè)水平。

3.2 在病毒性疾病檢測(cè)中的應(yīng)用

3.2.1 DNA病毒的檢測(cè)

3.2.1.1 豬細(xì)小病毒的檢測(cè)。豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬成員。造成母豬的繁殖障礙并可感染胚胎，導(dǎo)致胎兒死亡、流產(chǎn)。PPV分布廣泛，能在外界環(huán)境中長(zhǎng)期存活并對(duì)大部分化學(xué)消毒劑不敏感。常規(guī)的分子生物學(xué)病原檢測(cè)方法有血清學(xué)實(shí)驗(yàn)、ELISA、PCR等，但是存在著這樣或那樣的問(wèn)題。劉業(yè)兵[11]等選用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320型濁度儀對(duì)LAMP反應(yīng)情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，分析反應(yīng)進(jìn)程，篩選到可靠、最佳的反應(yīng)體系，建立針對(duì)PPV病原的快速、特異的LAMP檢測(cè)方法。利用實(shí)時(shí)濁度儀建立的PPV LAMP反應(yīng)體系的結(jié)果與肉眼可視化判定的結(jié)果完全一致，提示其高度的可靠性與穩(wěn)定性，同時(shí)為該技術(shù)的臨床推廣應(yīng)用提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

3.2.1.2 鴨瘟病毒的檢測(cè)。鴨瘟（Duck plague，DP）是由鴨瘟病毒（Duck plague virus，DPV）引起鴨、鵝等水禽的一種急性敗血性傳染病，其特征是流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率高，嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。張坤[12]等建立的LAMP檢測(cè)方法，敏感性可達(dá)0.245 μg/L，比普通PCR方法靈敏性高10倍，而且對(duì)鴨病毒性肝炎、H9N2亞型禽流感病毒、鴨副粘病毒、鴨源偏肺病毒等常見

病毒的核酸無(wú)交叉反應(yīng)。對(duì)40份臨床樣品的陽(yáng)性檢出率為30%。表明該方法簡(jiǎn)便快捷，省時(shí)省力，是一種適用于基層實(shí)驗(yàn)室的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)DPV的方法。

3.2.2 RNA病毒的檢測(cè)

3.2.2.1 豬瘟病毒的檢測(cè)。豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由黃病毒科，瘟病毒屬的豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種以高傳染性和高死亡率為特征的疾病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成極大地?fù)p失。常規(guī)的檢測(cè)方法難以區(qū)分豬瘟野毒株和疫苗株，張改平[13]等利用一步法RT-PCR的思路，將核酸的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程與擴(kuò)增過(guò)程相結(jié)合，采用RT-LAMP的方法，通過(guò)比對(duì)野毒株和疫苗株的不同基因，選取NS5B基因上一段差異較大的序列，設(shè)計(jì)了兩組特異性的引物，成功的使用簡(jiǎn)單快捷的方法將兩者進(jìn)行區(qū)分。經(jīng)測(cè)試，該方法靈敏度超出常規(guī)RT-PCR 1 000倍以上，且重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，為我國(guó)豬瘟防控與凈化提供了技術(shù)支持。

3.2.2.2 新城疫病毒的檢測(cè)。新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一類主要感染禽類的烈性傳染病，是我國(guó)重點(diǎn)防控的重大動(dòng)物疫病。陳兵[14]等選取新城疫病毒融合蛋白基因（F基因）設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性的引物，并將目的片段導(dǎo)入pMD18-T Vector成功構(gòu)建pMD18-T-F重組質(zhì)粒，并以此為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)。在制備反應(yīng)液時(shí)，先將0.5 μL SYBR Green Ⅰ染料小心加入反應(yīng)管蓋內(nèi)側(cè)，于反應(yīng)結(jié)束后輕輕顛倒反應(yīng)管數(shù)次，以使染料混入，觀察顏色變化，可以有效地避免因開蓋造成的污染問(wèn)題。田間樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，20份樣品中特異性檢出NDV陽(yáng)性4份，陰性16份，與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致。

3.3 在支原體疾病檢測(cè)中的應(yīng)用

3.3.1 豬肺炎支原體的檢測(cè)。豬氣喘病又稱豬支原體肺炎，是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mh）引起的一種慢性接觸性呼吸道傳染病。支原體可通過(guò)空氣傳播，很難隔離和阻斷其傳播途徑，嚴(yán)重制約養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。李鵬[15]等使用Oligo6.71軟件設(shè)計(jì)了4條引物，成功建立了一種快速、簡(jiǎn)便、可靠的豬肺炎支原體檢測(cè)方法。優(yōu)化后的擴(kuò)增反應(yīng)條件為60 ℃孵育60 min，最低檢測(cè)限可達(dá)到3個(gè)拷貝。對(duì)多殺性巴氏桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、肺炎雙球菌、支氣管敗血波氏桿菌、副豬嗜血桿菌和鏈球菌的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明該方法特異性良好。與常規(guī)PCR方法相比，LAMP法大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，且能夠特異性鑒別豬肺炎支原體。

3.3.2 雞滑液支原體的檢測(cè)?；褐гw（Mycoplasma synoviae，MS）以侵害雞關(guān)節(jié)滑液、腱鞘膜和氣囊為主，引起雞亞臨床型的上呼吸道感染和關(guān)節(jié)滑液囊炎。鄧顯文[16]等對(duì)LAMP和PCR的靈敏度、反應(yīng)條件和產(chǎn)物檢測(cè)進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)LAMP的靈敏度是PCR的10倍，并且簡(jiǎn)便易行，成本低廉，比其他基于PCR的方法更適合MS的檢測(cè)。為了防止假陽(yáng)性的出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中將配置反應(yīng)體系的區(qū)域、加樣區(qū)域和結(jié)果觀察區(qū)域進(jìn)行嚴(yán)格分區(qū)。同時(shí)，使用Calcein+MnCl2替代SYBR GreenⅠ和Gene Finder，在配置反應(yīng)液時(shí)就加入其中，避免了常規(guī)LAMP方法需要在反應(yīng)后加入染料顯色容易造成污染的問(wèn)題。

4 不足之處

LAMP方法建立時(shí)間還不長(zhǎng)，不可避免地存在著一些缺點(diǎn)和不足，例如：檢測(cè)結(jié)果只有陽(yáng)性與陰性兩種，只能定性不能定量，一旦產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，不易鑒別。靶序列長(zhǎng)度只能控制在300 bp以內(nèi)，不適合長(zhǎng)片段的擴(kuò)增。采用了多條引物，而且是在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增，引物之間可能形成互補(bǔ)而擴(kuò)增出非特異性的條帶，造成假陽(yáng)性[18]。

5 前景展望

LAMP檢測(cè)方法在動(dòng)物病原檢測(cè)上具有廣闊的應(yīng)用前景，有常規(guī)PCR方法無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)：LAMP的整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程均在恒溫條件下進(jìn)行，規(guī)避了常規(guī)PCR對(duì)于溫度升降的步驟，不僅不要使用昂貴的儀器設(shè)備，同時(shí)也大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，更加符合基層獸醫(yī)站和臨床一線對(duì)快速診斷的需要。反應(yīng)副產(chǎn)物——焦磷酸鎂形成的渾濁度使得反應(yīng)結(jié)

果更加容易觀察和判定。由于該方法的簡(jiǎn)便易行，該技術(shù)有望在基層檢測(cè)中大面積推廣。

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Loop-mediated Isothermal Amplif cation and Its Application in Animal Disease Diagnosis

Hu Cheng1，Cheng Darong1，Yu Shupei1，Zhao Fang1，Su Lingling1，Cai Shudong1，Gu Lingling1，WangYongjuan2
（1. College of Veterinary Medicine，Yangzhou University Yangzhou，225009，China；2. Jiangsu Animal Husbandry and Veterinary college，Taizhou，225300，China）

The loop-mediated isothermal amplification（LAMP）is a new nucleic acid amplification method. Due to its high specificity，efficiency，simplicity，rapidity and cheapness，more and more veterinarians focus on the method. At present，LAMP has been widely used in detecting various pathogens. In this review，the principle，process and application of LAMP were introduced，its short-comings were pointed out and the future development in animal disease diagnosis was prospected in order to provide theoretical basis for clinical application.

loop-mediated isothermal amplification；animal disease diagnosis；application

S854.4

A

1005-944X（2015）04-0046-05

江蘇省博士后科研資助計(jì)劃項(xiàng)目（1401077B）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31302096）；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院2014年度重點(diǎn)支持項(xiàng)目（NSFZD1405）；揚(yáng)州朝天歌農(nóng)牧科技有限公司橫向合作項(xiàng)目（00010114012）。

成大榮