李 莎，董 輝，黃 兵

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室，上海200241）

·綜述·

寄生蟲潛在藥物靶標—乳酸脫氫酶

李 莎，董 輝，黃 兵

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室，上海200241）

寄生蟲是包括原蟲、吸蟲、絳蟲、線蟲、棘頭蟲等在內(nèi)的一大類生物的總稱，可引起重要的人畜寄生蟲病。抗寄生蟲藥物的長期使用甚至是濫用使得寄生蟲對現(xiàn)有藥物產(chǎn)生了明顯的抗藥性，急需開發(fā)新型藥物以有效控制寄生蟲感染。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）是糖酵解途徑的末端酶，在還原型輔酶Ⅰ（NADH）和氧化型輔酶Ⅰ（NAD+）的輔助下，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)，釋放能量供寄生蟲所需。本文針對抗寄生蟲藥物靶標的鑒定方法以及寄生蟲LDH作為潛在藥物靶標的研究進展進行了綜述，對闡明藥物的分子作用機理及研發(fā)新藥具有重要的理論意義。

寄生蟲；抗寄生蟲藥物；藥物靶標；乳酸脫氫酶

長期和反復(fù)使用抗寄生蟲藥物會誘導(dǎo)寄生蟲產(chǎn)生耐藥性。截止目前，寄生蟲對阿維菌素類（Avermectins）[1]、大環(huán)內(nèi)酯類（Macrolides）[2]、地克珠利（Diclazuril）[3]、氯喹（Chloroquine）[4]等常用抗寄生蟲藥均已產(chǎn)生不同程度的耐藥性。要防止或延緩抗藥性的發(fā)生，以及研制新的有效藥物，就必須了解藥物抗寄生蟲的作用機制，從分子水平上確定其作用的靶部位。有關(guān)寄生蟲乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）分子結(jié)構(gòu)與功能的研究結(jié)果提示，寄生蟲LDH是良好的診斷分子和潛在的藥物靶標[5-7]。本文針對抗寄生蟲藥物靶標的鑒定方法以及寄生蟲LDH作為潛在藥物靶標的研究進展進行綜述。

1 抗寄生蟲藥物靶標的鑒定方法

1.1 基于藥物作用前后寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的方法鑒定藥物靶標通常始于研究藥物作用前后寄生蟲細胞及亞細胞水平上形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的變化，主要的數(shù)據(jù)包括藥物作用的速度和路徑、寄生蟲的受損部位以及損傷在藥物處理后開始出現(xiàn)的時間點[8]。曼氏血吸蟲（Schistosoma mansoni, Sm）藥物敏感株在體外用吡喹酮（Praziquantel）作用后，出現(xiàn)典型的皮層結(jié)節(jié)腫脹、破潰等，而不敏感株的皮層損害變化較敏感株緩慢，損害程度較輕[9]。經(jīng)地克珠利作用后，巨型艾美耳球蟲（Eimeria maxima, Em）和布氏艾美耳球蟲（E. brunetti, Eb）的裂殖階段蟲體形態(tài)結(jié)構(gòu)無變化，Em的大、小配子體形態(tài)也無影響，而合子卵囊壁的形成嚴重被破壞，卵囊壁加厚、缺損、壞死，Eb小配子的形成與核分裂無變化，但其分化異常，影響合子形成，導(dǎo)致大配子退化[10]，結(jié)果提示，地克珠利對Em和Eb的作用靶標可能存在于有性生殖階段蟲體中。地克珠利對柔嫩艾美耳球蟲（E. tenella, Et）無性階段和有性階段的蟲體結(jié)構(gòu)均有影響[11-13]，提示其對Et的作用靶標更復(fù)雜?；谛螒B(tài)結(jié)構(gòu)變化的研究雖不能給出藥物靶標的確定結(jié)論，但可以指示受作用細胞的過程，并為之后假定藥物靶標的區(qū)別鑒定提供重要信息。

1.2 基于鑒定寄生蟲抗藥性基因的方法抗藥基因的鑒定是研究抗藥性產(chǎn)生的分子機制及藥物靶標的一種重要策略，具體內(nèi)容包括抗藥蟲株的誘導(dǎo)，比較抗藥株與敏感株在基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等水平的差異以及差異表達基因的功能分析[8]。董蘭蘭等[14]誘導(dǎo)了日本血吸蟲（Schistosoma japonicum, Sj）的吡喹酮抗性蟲株，并比較了誘導(dǎo)株與未誘導(dǎo)株之間蟲體蛋白的差異，結(jié)果獲得了30個差異表達蛋白，為深入鑒定吡喹酮抗血吸蟲的靶標奠定基礎(chǔ)。安健[15]比較了Et馬杜霉素抗藥株和敏感株之間的mRNA差異，結(jié)果獲得了34條差異片段。劉文江等[16]比較了Et馬杜拉霉素、地克珠利抗藥株與母源敏感株第二代裂殖子的蛋白差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地克珠利抗藥株和馬杜拉霉素抗藥株各有4個蛋白差異點。姜連連等[17]對Et地克株利抗藥株與敏感株孢子化

卵囊的蛋白質(zhì)表達圖譜進行差異比較和分析，發(fā)現(xiàn)兩者之間有5個蛋白差異斑點。抗藥基因的鑒定對抗藥性檢測、抗藥性產(chǎn)生的分子機制以及藥物作用靶標的確定等均具有重要意義。

1.3 基于寄生蟲基因組學(xué)的方法迄今，多種寄生蟲基因組測序已經(jīng)完成，可利用生物信息學(xué)方法對基因組的海量數(shù)據(jù)進行分析，那些重要的僅存在于寄生蟲的基因（特別是必需基因）可能就是抗寄生蟲藥物的潛在靶標。對豬帶絳蟲（Taenia solium）基因組序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其成蟲階段的16 000條EST序列中，僅有40%左右與已報道的序列具有同源性，絕大多數(shù)與哺乳動物，特別是人類的序列同源，但有1.5%序列與人類無同源性，這些基因就是豬帶絳蟲藥物治療、診斷、疫苗研制的候選基因[18]。Shinde等[19]用基因組水平的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控和電腦模擬分析相結(jié)合的方法分析了日本血吸蟲甘油磷脂（glycerophospholipid）的生物合成通路，發(fā)現(xiàn)胞苷酰轉(zhuǎn)移酶（cytidyltransferase）可以作為藥物靶標分子，為研發(fā)抗血吸蟲藥物奠定了基礎(chǔ)。

1.4 基于寄生蟲蛋白質(zhì)組學(xué)的方法蛋白質(zhì)組學(xué)是基因組和藥物發(fā)現(xiàn)之間的橋梁，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究藥物處理前后蛋白的差異變化，可以發(fā)現(xiàn)新的、潛在的藥物作用靶點[20]。Prieto等[21]通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了氯喹和青蒿素（artemisinin）作用后惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum, Pf）滋養(yǎng)體階段蛋白質(zhì)表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物處理后蛋白數(shù)量增加了30%，部分蛋白的表達水平在藥物壓力下發(fā)生應(yīng)激性變化，提示蛋白質(zhì)組學(xué)方法可用于抗寄生蟲藥物作用機理的研究。Zhang等[22]對日本血吸蟲雌雄蟲共12個時期的體被表膜蛋白進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出來的差異蛋白主要參與了血吸蟲營養(yǎng)攝取、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫逃避應(yīng)答等重要生理過程，研究結(jié)果為藥物靶標、疫苗候選分子、診斷抗原的篩選奠定了基礎(chǔ)。

2 寄生蟲LDH是潛在的藥物靶標

乳酸脫氫酶是廣泛分布于微生物、植物和動物細胞內(nèi)的一種重要功能酶，是生命活動中最重要能源物質(zhì)“糖”無氧酵解途徑的關(guān)鍵酶之一。大多

數(shù)體內(nèi)寄生蟲的能源主要來源于無氧糖酵解途徑，LDH是該途徑的末端酶，在NADH和NAD+的輔助下，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)，釋放能量供機體所需。LDH一旦被抑制，將導(dǎo)致蟲體發(fā)育停止甚至死亡。已有研究表明，各種寄生蟲LDH在理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)方面均有獨特的特性，是潛在的藥物作用靶標。

2.1 原蟲LDH

2.1.1 瘧原蟲LDH Brown等[23]研究發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲、卵形瘧原蟲（P. ovale, Po）、三日瘧原蟲（P. malariae, Pm）和間日瘧原蟲（P. vivax, Pv）之間的LDH酶學(xué)特征和對輔酶結(jié)合位點抑制劑的敏感性差異顯著，丙酮酸和乳酸的米氏常數(shù)（Michaelis constant, Km）相差8～9倍，NADH、NAD+和NAD+類似物APAD（3-acetylpyridine adenine dinucleotide）的Km值相差4倍；對棉子酚（gossypol）及棉子酚類抑制劑的解離常數(shù)（Dissociation constant, pK）相差21倍；對這4種瘧原蟲LDH的輔酶結(jié)合位點與抑制劑的分子對接研究均發(fā)現(xiàn)對接配體位于輔酶結(jié)合位點的煙堿（nicotinamide）末端，而且在pH 6～8范圍內(nèi)這種結(jié)合作用不受pH影響。Foley等[24]認為惡性瘧原蟲分子量為42 kDa和33 kDa的兩個蛋白可能是氯喹的藥物靶標。Menting等[25]證實了其中的33 kDa蛋白為PfLDH，氯喹能與它的非活性中心位點特異性結(jié)合，不僅不影響其酶活性，而且可干擾亞鐵血紅素對其抑制作用。Read等[26]發(fā)現(xiàn)氯喹特異性地結(jié)合PfLDH的NADH結(jié)合位點，占據(jù)了類似腺嘌呤環(huán)輔酶的結(jié)合位點，是PfLDH的競爭性抑制劑。棉酚及其衍生物和類似物抑制PfLDH活性的作用機理是競爭性結(jié)合LDH的NADH結(jié)合位點[27-29]。Cameron等[30]研究發(fā)現(xiàn)含吡咯的雜環(huán)類化合物在亞微摩爾濃度水平上能夠選擇性抑制PfLDH，而對人LDH的抑制濃度比上述濃度大100多倍，晶體結(jié)構(gòu)分析顯示這些競爭性抑制劑與酶活性位點的氨基酸交織成網(wǎng)狀，并沿輔酶NAD+的煙酰胺環(huán)堆積，而且該類化合物具有體外抗瘧活性、體內(nèi)低毒性和良好的藥動學(xué)特征，表明該類化合物有可能成為以PfLDH為靶標的抗瘧新藥。Coutinho等[31]研究發(fā)現(xiàn)泊沙康唑（Posaconazole）體外抑制惡性瘧原蟲氯喹抗性株與體內(nèi)抑制伯氏瘧原蟲（Plasmodium berghei, Pb）的作用機理可能都與NADH競爭性結(jié)合LDH有關(guān)。Vivas等[32]研究了唑類藥物——OXD1對PfLDH的階段性抑制效果，發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)體階段PfLDH的酶活性和基因轉(zhuǎn)錄水平比環(huán)狀體階段高，而且對OXD1的敏感性也比環(huán)狀體階段高，從而推斷蟲體對藥物的階段敏感性升高與糖酵解供能需求增加有關(guān)。Keluskar等[33]發(fā)現(xiàn)中草藥苦味葉下珠水提物（Phyllanthus amarus aqueous extract）能夠抑制PfLDH和PvLDH的酶活性，作用機理是競爭性結(jié)合LDH的NADH結(jié)合位點，調(diào)料九里香氯仿提取物（Murraya koenigii chloroform extract）同樣可以抑制PfLDH和PvLDH的酶活性，前者的作用機理是競爭性結(jié)合丙酮酸結(jié)合位點，后者的作用機理是非競爭性結(jié)合NADH結(jié)合位點。

2.1.2 弓形蟲LDH TgLDH1和TgLDH2比PfLDH具有更廣泛的底物特異性，對于TgLDH1、TgLDH2，3-苯基丙酮酸（3-phenylpyruvate）是很好的底物，對于TgLDH2，3-苯基丙酮酸是比丙酮酸更有效的底物，而PfLDH不能利用3-苯基丙酮酸，三者同樣能有效利用NAD+類似物——APAD（3-acetylpyridine adenine dinucleotide）；與PfLDH一樣，TgLDH2也無底物抑制性，雖然TgLDH1與TgLDH2在輔酶結(jié)合位點都具有和底物抑制相關(guān)的殘基M163，但他們具有不同的底物抑制性；棉子酚及其衍生物、二羥基萘酚酸（dihydroxynaphthoic acids）和N端取代草氨酸（N-substituted oxamic acids）抑制TgLDH1和TgLDH2酶活性的機理在于競爭性結(jié)合輔酶結(jié)合位點；TgLDH與PfLDH對不同抑制劑的敏感性不同，這可能和抑制劑的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[5]。

2.1.3 球蟲LDH Shen等[34]發(fā)現(xiàn)地克珠利作用后Et第二代裂殖子的LDH蛋白含量明顯增加，mRNA的轉(zhuǎn)錄水平也上調(diào)約0.67倍。亞硝基谷胱甘肽（GSNO）處理后Et未孢子化卵囊和孢子化卵囊中均有LDH活性，提示外源性亞硝基谷胱甘肽對球蟲孢子生殖的抑制并沒有滅活卵囊中LDH的活性或?qū)γ傅淖饔脼榭赡鎇35]。國內(nèi)關(guān)于地克珠利[3,36]、馬杜拉霉素[36]、磺胺氯吡嗪[3]（Sulfaclozine）等藥物對球蟲LDH的影響研究多以比較耐藥株與敏感株同工酶譜的差異

為主。黃現(xiàn)青等[37]用LDH測定法研究表面活性素（Surfactin）體外對Et的損傷程度，研究結(jié)果顯示藥物濃度增加，孢子化卵囊裂解釋放的LDH增加，LDH活性也隨之增加，說明表面活性素體外對Et有較強的裂解效果，對EtLDH活性沒有明顯的抑制作用。劉田等[38]研究了EtLDH的酶動力學(xué)特性，對NADH和丙酮酸的Km分別為（66±0.19）μmol/L和（0.26±0.08）μmol/L，Vmax分別為（33.72±0.78）μmol/min/mg和(12.32±1.21) mmol/min/mg；通過大規(guī)模篩選發(fā)現(xiàn)依曲康唑（itraconazole）、苯琥胺（phensuximide）和棉酚等先導(dǎo)化合物能夠有效抑制EtLDH活性，其中棉酚能夠在較低濃度下通過反競爭性抑制方式明顯抑制EtLDH活性。

2.2 吸蟲LDH

2.2.1 日本血吸蟲LDH 重組日本血吸蟲LDH（rSjLDH）的酶活性單位為379 U/mg，催化丙酮酸還原反應(yīng)的最適pH為6.0～7.0，最適反應(yīng)溫度在37℃～60℃之間；催化乳酸氧化反應(yīng)的最適pH為9.0～10.0，最適反應(yīng)溫度在40℃～50℃之間；丙酮酸的Vmax/Km比值是乳酸的23倍，而NADH是NAD+的7倍[39]。給感染日本血吸蟲32～38 d后的小鼠飼喂300 mg/kg的蒿甲醚（artemether），用藥后24～72 h，對雌蟲和雄蟲LDH活性的抑制率分別為9%～59%和41%～75%[40]。蒿甲醚對rSjLDH無抑制作用，而血紅素是rSjLDH的強抑制劑，但蒿甲醚配伍血紅素對rSjLDH無抑制作用，機理尚不清楚[41,42]。不同濃度的棉子酚和吡喹酮對rSjLDH氧化還原反應(yīng)催化活性均有顯著的抑制作用，提示棉子酚及其衍生物可能具有抗血吸蟲的潛力，而SjLDH是吡喹酮的分子靶標之一[41]。用氯硝柳胺（niclosamide）懸浮劑處理日本血吸蟲尾蚴，其蟲體的LDH等能量代謝相關(guān)酶活性顯著提高，提示蟲體短時間內(nèi)能量耗竭是藥物發(fā)揮作用的主要機理[43]。

2.2.2 華支睪吸蟲LDH 華支睪吸蟲（Clonorchis sinesis, Cs）LDH（CsLDH）催化丙酮酸還原反應(yīng)的最適溫度和pH分別為50℃和7.5，而催化乳酸氧化反應(yīng)的分別為80℃和11；丙酮酸的Km是乳酸的1/6，而NADH的Km是NAD+的4倍，丙酮酸的Vmax遠大于乳酸；CsLDH催化的乳酸氧化反應(yīng)

無底物抑制性，而丙酮酸與NADH的最佳底物濃度分別為10 mmol/L和0.5 mmol/L；就輔酶而言，APAD比NAD+更有效，輔酶類似物中煙酰胺環(huán)被不同取代基取代后的輔酶活性差別顯著；Cu2+、Fe2+和Zn2+均能明顯抑制CsLDH催化的氧化還原反應(yīng)；1.0 mmol/L 棉子酚對CsLDH催化乳酸氧化反應(yīng)的抑制率超過85%，對丙酮酸還原反應(yīng)催化效率的抑制率較低，提示CsLDH可能是潛在的藥物靶標[44]。不同濃度吡喹酮、阿苯達唑（albendazole）、芬苯達唑（fenbendazole）以及甲苯咪唑（mebendazole）對CsLDH催化活性都存在較強的抑制作用，說明這些藥物可能以CsLDH作為藥物靶標[45]。

2.2.3 殖盤殖盤吸蟲LDH 殖盤殖盤吸蟲（Cotylophoron cotylophorum, Cc）LDH在pH 6.5條件下催化丙酮酸還原反應(yīng)的最大活性為15.7 nmol NADH/min/mg LDH，在pH 7.5條件下催化乳酸氧化反應(yīng)的最大活性為8.9 nmol NAD+/min/mg LDH；0.06 mmol/L吡喹酮和0.8 mmol/L左旋咪唑（Levomisole）對CcLDH催化的氧化還原反應(yīng)的抑制率均大于85%，甲苯咪唑、芬苯達唑、阿苯達唑同樣可顯著抑制CcLDH氧化反應(yīng)的催化活性，但是還原反應(yīng)的催化活性反而升高，這充分說明苯并咪唑類藥物的主要作用機理在于激活CcLDH丙酮酸還原反應(yīng)的催化活性，其主要作用靶標可能是CcLDH[46]。

2.2.4 其 他 吸 蟲LDH 0.24 mg/mL三 氯 苯 達唑（triclabendazole）體外作用衛(wèi)氏并殖吸蟲（Paragonimus westermani, Pw）后可破壞蟲體LDH的同工酶，顯著降低實質(zhì)組織中糖蛋白的合成[47]。阿苯達唑在體外可抑制肝片形吸蟲（Fasciola hepatica, Fh）LDH活性[46]。

2.3 絳蟲LDH

2.3.1 棘盤瑞利絳蟲LDH Das等[48]研究了蕨類植物的根皮提取物、木黃酮（Genistein）、吡喹酮等藥物體外對棘盤瑞利絳蟲（Raillietina echinobothrida）糖酵解酶的作用，酶活法和組織化學(xué)法的結(jié)果均顯示這3種藥物可增加蟲體LDH的催化活力，說明糖酵解活性增強可能是植物化學(xué)物質(zhì)抗蠕蟲壓力的作用。

2.3.2 豬囊尾蚴LDH 高文學(xué)[49]研究了囊效0號

（NX0）、囊效l號（NX1）、囊效2號（NX2）3種藥物對體外培養(yǎng)和體內(nèi)發(fā)育的豬囊尾蚴（Cysticercus cellulosae, Cc）不同發(fā)育階段生化代謝的作用機理，其中NX0、NX1在體內(nèi)和體外首先抑制糖有氧分解代謝和糖異生通路，為了彌補能量生成減少、糖異生不足以及糖原迅速消耗導(dǎo)致的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙，糖的無氧分解代償加強，LDH催化活性先升高再降低，進一步導(dǎo)致其他物質(zhì)代謝發(fā)生障礙，蟲體死亡。史艷秋等[50]通過酶組織化學(xué)半定量法發(fā)現(xiàn)阿苯達唑、奧芬達唑（oxfendazole）體內(nèi)作用后豬囊尾蚴的葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase, G-6-Pase）、 琥 珀 酸 脫 氫 酶（succinodehydrogenase, SDH）及LDH活性代償性增強。高學(xué)軍等[51]發(fā)現(xiàn)這兩種藥物對體外發(fā)育的未成熟期CcLDH無明顯作用，說明這兩種藥物可能不抑制糖酵解代謝途徑，該結(jié)果與李慶章等[52]的研究結(jié)果相反，這可能和阿苯噠唑、奧芬噠唑的用藥劑量有一定關(guān)系。陳佩惠等[53]首次研究發(fā)現(xiàn)阿苯達唑?qū)θ梭w內(nèi)豬囊尾蚴作用后糖元含量、三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase, ATPase）、SDH的活性下降，而LDH的活性升高。

2.3.3 亞洲帶絳蟲LDH 吡喹酮、阿苯達唑和甲苯咪唑可以顯著抑制亞洲帶絳蟲（Taenia asiatica, Ta）LDH的正逆催化反應(yīng)，結(jié)合TaLDH定位于蟲體表膜和蟲體表膜結(jié)構(gòu)遭到破壞的結(jié)果，提示TaLDH可能為吡喹酮和苯并咪唑類藥物作用的靶標分子[54]。

2.3.4 細粒棘球絳蟲LDH Gan等[55]研究發(fā)現(xiàn)細粒棘球絳蟲（Echinococcus granulosus, Eg）LDH催化丙酮酸還原反應(yīng)與乳酸氧化反應(yīng)的最適溫度均為37℃，最適pH分別為7.5和9.5，酶動力學(xué)參數(shù)的研究結(jié)果表明在宿主生理條件下EgLDH負責(zé)催化丙酮酸的還原反應(yīng)。EgLDH的抗原決定簇抗體（含酶催化中心位點的關(guān)鍵殘基或底物結(jié)合位點）可以抑制EgLDH活性，再結(jié)合EgLDH的拓撲結(jié)構(gòu)預(yù)測與定位研究結(jié)果表明EgLDH是潛在藥物靶標和疫苗候選分子。

2.4 線蟲LDH

2.4.1 旋毛蟲LDH 陳小寧等[56]首次運用組化半定量測定法和顯微分光光度定量測定法證實阿苯達唑可使小鼠旋毛蟲（Trichinella spiralis）的囊包幼蟲LDH活性升高，琥珀酸脫氫酶（succinale dehydrogenase）活性降低，從而證實該藥導(dǎo)致蟲體有氧代謝減弱，無氧糖酵解以代償性方式供能。劉暉等[57]用相同的方法證實甲苯咪唑?qū)π∈笮x囊包幼蟲LDH的作用如同阿苯達唑。

2.4.2 捻轉(zhuǎn)血毛線蟲LDH 研究表明濃度為1%的大蒜溶液對捻轉(zhuǎn)血毛線蟲（Haemonchus contortus, Hc）LDH催化乳酸氧化反應(yīng)的抑制率大于丙酮酸還原反應(yīng)，進而導(dǎo)致蟲體ATP代謝受阻而死亡[58]。10 mg/mL的硫菌靈（Thiophanate）和50 mg/mL的芬苯達唑在體外均能激活捻轉(zhuǎn)血毛線蟲腸上皮細胞LDH的活性[59]。

2.4.3 球鞘毛首線蟲LDH 阿苯達唑和芬苯達唑可提高球鞘毛首線蟲（Trichuris globulosa）非收縮性腸道和肌肉內(nèi)的LDH酶活性[60]。

2.5 棘頭蟲LDH廖黨金等[61]研究發(fā)現(xiàn)硝硫氰醚（Nitroscanate）對蛭形巨吻棘頭蟲-

（Macracanthorhynchus hirudinaceus, Mh）雄蟲LDH同工酶的第2、3、4帶和雌蟲LDH同工酶的第2、3帶有不同程度的抑制作用，特別是雌蟲LDH同工酶的第2帶最敏感，在0.1%濃度下，該酶帶被完全抑制，而對雄蟲和雌蟲LDH同工酶的第1帶均無抑制作用，結(jié)合藥物臨床療效說明硝硫氰醚抑制MhLDH同工酶活性可能是該藥物對蛭形巨吻棘頭蟲的作用機理之一。

綜上所述，抗寄生蟲藥物靶標的鑒定主要圍繞寄生蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、抗藥性基因鑒定、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等方法開展。已有研究表明，許多藥物對寄生蟲LDH的酶學(xué)活性、基因轉(zhuǎn)錄水平或蛋白翻譯水平都有顯著的影響，寄生蟲LDH是潛在的藥物靶標，但不同藥物對寄生蟲LDH的作用方式明顯不同。有的藥物直接作用于寄生蟲LDH，如對PfLDH呈現(xiàn)競爭性抑制作用的氯喹、棉酚及衍生物、含吡咯的雜環(huán)類化合物、伯沙康唑以及苦味葉下珠水提物；有的藥物間接作用于寄生蟲LDH，如蒿甲醚可間接抑制SjLDH酶活性，甲苯達唑和阿苯達唑通過抑制有氧代謝的方式使LDH酶活性代償性升高；有

的藥物對寄生蟲LDH氧化還原反應(yīng)的催化活性有不同的效果，通過影響ATP代謝來發(fā)揮作用，如甲苯達唑、芬苯達唑和阿苯達唑均能在抑制CcLDH氧化反應(yīng)催化活性的同時增強還原反應(yīng)的催化活性。由于作用方式的多樣性，所以有必要從分子水平上鑒定藥物對寄生蟲LDH的作用靶標，研究結(jié)果將對闡明藥物作用機理以及研發(fā)新型抗寄生蟲藥物具有重要意義。

[1] 孫建華, 姜中其. 寄生蟲對阿維菌素類藥物耐藥性的研究進展[J]. 中國獸藥雜志, 2004, 38(5): 38-41.

[2] 陳琳, 陳杖榴. 大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥耐藥性研究進展[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展, 2005, 26(10): 9-13.

[3] 張祝明. 4株柔嫩艾美耳球蟲耐藥性檢測及同工酶分析[D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[4] Fall B, Pascual A, Sarr F D, et al. Plasmodium falciparum susceptibility to anti-malarial drugs in Dakar, Senegal, in 2010: an ex vivo and drug resistance molecular markers study[J]. Malar J, 2013, 12(1): 107.

[5] Dando C, Schroeder E R, Hunsaker L A, et al. The kinetic properties and sensitivities to inhibitors of lactate dehydrogenases (LDH1 and LDH2) from Toxoplasma gondii: comparisons with pLDH from Plasmodium falciparum[J]. Mol Biochem Parasitol, 2001, 118(1): 23-32.

[6] Winter V J, Cameron A, Tranter R, et al. Crystal structure of Plasmodium berghei lactate dehydrogenase indicates the unique structural differences of these enzymes are shared across the Plasmodium genus[J]. Mol Biochem Parasitol, 2003, 131(1): 1-10.

[7] Kavanagh K L, Elling R A, Wilson D K. Structure of Toxoplasma gondii LDH1: active-site differences from human lactate dehydrogenases and the structural basis for efficient APAD+use[J]. Biochemistry, 2004, 43(4): 879-889.

[8] 沈曉炯. 地克珠利對柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子藥物靶標的初步研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2012.

[9] William S, Botros S, Ismail M, et al. Praziquantelinduced tegumental damage in vitro is diminished in schistosomes derived from praziquantel-resistant infections[J]. Parasitology, 2001, 122(1): 63-66.

[10] Verheyen A, Maes L, Coussement W, et al. Ultrastructural evaluation of the effects of diclazuril on the endogenous stages of Eimeria maxima and E.brunetti in experimentally inoculated chickens[J]. Parasitol Res, 1989, 75(8): 604-610.

[11] Verheyen A, Maes L, Coussement W, et al. In vivo action of the anticoccidial diclazuril (Clinacox) on the developmental stages of Eimeria tenella: an ultrastructural evaluation[J]. J Parasitol, 1988, 74(6): 939-949.

[12] Maes L, Coussement W, Vanparijs O, et al. In vivo action of the anticoccidial diclazuril (Clinacox) on the developmental stages of Eimeria tenella: a histological study[J]. J Parasitol, 1988, 74(6): 931-938.

[13] 周變?nèi)A. 地克珠利抗雞柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子作用機理研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2010.

[14] 董蘭蘭, 許靜, 趙波, 等. 吡喹酮壓力下日本血吸蟲耐藥性的誘導(dǎo)和蟲體差異表達蛋白的分析[J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2014, 30(12): 1171-1180.

[15] 安健. 柔嫩艾美耳球蟲抗藥性蟲體純化及mRNA差異顯示的研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004.

[16] 劉文江, 黃兵, 歐陽五慶, 等. 柔嫩艾美耳球蟲抗藥株第二代裂殖子的雙向電泳圖譜比較[J]. 中國獸醫(yī)科技, 2004, 34(3): 21-25.

[17] 姜連連, 黃兵, 韓紅玉, 等. 柔嫩艾美耳球蟲地克株利抗藥株與敏感株孢子化卵囊的蛋白質(zhì)差異分析[J]. 生物工程學(xué)報, 2005, 21(3): 435-439.

[18] Aguilar-D í az H, Bobes R J, Carrero J C, et al. The genome project of Taenia solium[J]. Parasitol Int, 2006, 55: S127-S130.

[19] Shinde S, Mol M, Singh S. Regulatory networks, genes and glycerophospholipid biosynthesis pathway in schistosomiasis: A systems biology view for pharmacological intervention[J]. Gene, 2014, 550(2): 214-222.

[20] 李學(xué)軍. 藥物蛋白質(zhì)組學(xué)與藥物發(fā)現(xiàn)[J]. 生理科學(xué)進展, 2002, 33(3): 209-214.

[21] Prieto J H, Koncarevic S, Park S K, et al. Large-scale differential proteome analysis in Plasmodium falciparum under drug treatment[J]. PLoS One, 2008, 3(12): e4098.

[22] Zhang M, Hong Y, Han Y, et al. Proteomic analysis of tegument-exposed proteins of female and male Schistosoma japonicum worms[J]. J Proteome Res, 2013, 12(11): 5260-5270.

[23] Brown W M, Yowell C A, Hoard A, et al. Comparative structural analysis and kinetic properties of lactate

dehydrogenases from the four species of human malarial parasites[J]. Biochemistry, 2004, 43(20): 6219-6229.

[24] Foley M, Deady L W, Ng K, et al. Photoaffinity labeling of chloroquine-binding proteins in Plasmodium falciparum[J]. J Biol Chem, 1994, 269(9): 6955-6961.

[25] Menting J G, Tilley L, Deady L W, et al. The antimalarial drug, chloroquine, interacts with lactate dehydrogenase from Plasmodium falciparum[J]. Mol Biochem Parasitol, 1997, 88(1): 215-224.

[26] Read J A, Wilkinson K W, Tranter R, et al. Chloroquine binds in the cofactor binding site of Plasmodium falciparum lactate dehydrogenase[J]. J Biol Chem, 1999, 274(15): 10213-10218.

[27] Gomez M S, Piper R C, Hunsaker L A, et al. Substrate and cofactor specificity and selective inhibition of lactate dehydrogenase from the malarial parasite Plasmodium falciparum[J]. Mol Biochem Parasitol, 1997, 90(1): 235-246.

[28] Deck L M, Royer R E, Chamblee B B, et al. Selective inhibitors of human lactate dehydrogenases and lactate dehydrogenase from the malarial parasite Plasmodium falciparum[J]. J Med Chem, 1998, 41(20): 3879-3887.

[29] Vander J D, Deck L M, Royer R E. Gossypol prototype of inhibitors targeted to dinucleotide folds[J]. Cur Med Chem, 2000, 7(4): 479-498.

[30] Cameron A, Read J, Tranter R, et al. Identification and activity of a series of azole-based compounds with lactate dehydrogenase-directed anti-malarial activity[J]. J Biol Chem, 2004, 279(30): 31429-31439.

[31] Penna-Coutinho J, Cortopassi W A, Oliveira A A, et al. Antimalarial activity of potential inhibitors of Plasmodium falciparum lactate dehydrogenase enzyme selected by docking studies[J]. PLoS One, 2011, 6(7): e21237.

[32] Vivas L, Easton A, Kendrick H, et al. Plasmodium falciparum: Stage specific effects of a selective inhibitor of lactate dehydrogenase[J]. Exp Parasitol, 2005, 111(2): 105-114.

[33] Keluskar P, Mohile A, Ingle S. Inhibition kinetics of Plasmodium lactate dehydrogenase with herbal extracts suggest possible enzyme inhibitor molecular interaction[J]. Malar J, 2012, 11(S1): P56.

[34] Shen X, Li T, Fu J, et al. Proteomic analysis of the effect of diclazuril on second-generation merozoites of Eimeria tenella[J]. Parasitol Res, 2014, 113(3): 903-909.

[35] 江燕, 李金貴, 劉宗平, 等. GSNO對E.tenella內(nèi)LDH、G-6-PD、ACO和SOD活性的影響[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2007, 29(3): 234-238.

[36] 郭濤, 董輝, 黃兵, 等. 柔嫩艾美耳球蟲地克珠利與馬杜霉素耐藥株的3種同工酶分析[J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版) , 2011, 40(2): 197-201.

[37] 黃現(xiàn)青, 高曉平, 郝貴增, 等. 表面活性素體外抗球蟲作用研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(12): 4982-4986.

[38] 劉田, 謝明權(quán), 朱冠, 等. 柔嫩艾美耳球蟲乳酸脫氫酶生化特性研究及先導(dǎo)化合物篩選[C]. 中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜寄生蟲學(xué)分會第七次代表大會暨第十二次學(xué)術(shù)研討會, 2013: 239- 239.

[39] 呂剛. 日本血吸蟲乳酸脫氫酶的功能研究[D]. 廣州: 中山大學(xué), 2006.

[40] Xiao S H, You J Q, Guo H F, et al. Effect of artemether on phosphorylase, lactate dehydrogenase, adenosine triphosphatase, and glucosephosphate dehydrogenase of Schistosoma japonicum harbored in mice[J]. Acta Pharmacol Sin, 1999, 20(8): 750-754.

[41] 呂剛, 胡旭初, 黃燦, 等. 棉子酚、吡喹酮、蒿甲醚對重組日本血吸蟲乳酸脫氫酶的作用[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2007, 25(5): 401-405.

[42] 呂剛, 胡旭初, 黃燦, 等. 蒿甲醚、血紅素及Fe3+對重組日本血吸蟲乳酸脫氫酶(rSjLDH)作用的初步研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2008, 24(2): 132-136.

[43] 李洪軍, 梁幼生, 宮明強, 等. 氯硝柳胺懸浮劑對日本血吸蟲尾蚴影響的酶組織化學(xué)觀察[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2005, 17(3): 190-194.

[44] Yang G, Jing C, Zhu P, et al. Molecular cloning and characterization of a novel lactate dehydrogenase gene from Clonorchis sinensis[J]. Parasitol Res, 2006, 99(1): 55-64.

[45] 黃燦, 胡旭初, 王樂旬, 等. 4種驅(qū)蟲藥對重組華支睪乳酸脫氫酶 (CsLDH) 作用研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2009, 25(11): 1100-1102.

[46] Veerakumari L, Munuswamy N. In vitro effect of some anthelmintics on lactate dehydrogenase activity of Cotylophoron cotylophorum (Digenea: paramphistomidae)[J]. Vet Parasitol, 2000, 91(1): 129-140.

[47] 金立群, 許世鍔, 陸秀君. 三氯苯達唑?qū)πl(wèi)氏并殖吸蟲同工酶、蛋白質(zhì)、0核酸和糖原的影響[J]. 中國人獸共患病學(xué)報, 2006, 22(1): 48-50.

[48] Das B, Tandon V, Saha N. Anthelmintic efficacy of Flemingia vestita (Fabaceae): alteration in the activities of some glycolytic enzymes in the cestode, Raillietina echinobothrida[J]. Parasitol Res, 2004, 93(4): 253-261.

[49] 高文學(xué). 豬囊尾蚴的生化代謝規(guī)模和藥物作用機理[D].哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2000.

[50] 史艷秋, 高學(xué)軍. 豬囊尾蚴發(fā)育過程中及在抗囊藥物作用下幾種糖代謝酶的組織化學(xué)研究[J]. 遼寧畜牧獸醫(yī), 2001(4): 4-5.

[51] 高學(xué)軍, 李艷飛, 李慶章. 阿苯達唑和奧芬達唑?qū)w外培養(yǎng)豬囊尾蚴能量代謝變化的影響[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報, 2006, 26(1): 71-73.

[52] 李慶章, 郝艷紅, 高學(xué)軍, 等. 苯并咪唑氨基甲酸酯類藥物抗豬囊尾蚴的作用靶點[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 40(5): 1024-1032.

[53] 陳佩惠, 郭建勛, 王秀琴, 等. 阿苯噠唑?qū)θ梭w內(nèi)豬囊尾蚴作用組織化學(xué)觀察[J]. 寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報, 1997, 4(1): 14-18.

[54] 陳祖云, 戴佳琳, 黃江, 等. 抗亞洲帶絳蟲藥物對乳酸脫氫酶抑制作用[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2010, 26(5): 553-554.

[55] Gan W, Zhang Z, Lv G, et al. The topological structure and function of Echinococcus granulosus lactate dehydrogenase, a tegumental transmembrane protein[J]. Mol Biochem Parasitol, 2012, 184(2): 109-117.

[56] 陳小寧, 季鳳清, 陳佩惠, 等. 阿苯達唑?qū)π∈笮x囊包幼蟲作用的組化研究[J]. 中國人獸共患病雜志, 1998, 14(2): 58-59.

[57] 劉暉, 黃學(xué)貴, 萬啟惠, 等. 甲苯咪唑?qū)πx幼蟲及其寄生肌肉的組織學(xué)與組織化學(xué)觀察[J]. 中國人獸共患病雜志, 2003, 19(5): 38-40.

[58] Veerakumari L, Lakshmi K N. In vitro effect of Allium sativum on lactate dehydrogenase activity of Haemonchus contortus [J]. J Vet Parasitol, 2006, 20(1): 93-96.

[59] Kaur M, Sood M L. Histoenzymic effects of thiophenate and fenbendazole on the absorptive surfaces of Haemonchus contortus[J]. Acta Veterinaria Hungarica, 1992, 40(1): 63-70.

[60] Kaur M, Sood M L. In vitro effect of albendazole and fenbendazole on the histochemical localization of some enzymes of Trichuris globulosa (Nematoda: Trichuridae) [J]. Angew Parasitol, 1992, 33(1): 33-45.

[61] 廖黨金, 官國均. 三種藥物對豬棘頭蟲LDH同工酶的抑制試驗[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 1996, 27(4): 348-354.

A POTENTIAL DRUG TARGET FOR PARASITES—LACTATE DEHYDROGENASE

LI Sha, DONG Hui, HUANG Bing
(Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Parasites include protozoon, trematodes, cestodes, nematode, acanthocephalan and so on, which cause diseases in human beings and animals. The misuse of antihelmintics has led to wide and serious drug-resistance. Therefore, there is an extremely urgent need for development of new drugs. Lactate dehydrogenase (LDH) acts as the terminal enzyme on glycolytic pathway and catalyzes the reversible reaction of pyruvate to lactate. In the process of this metabolic pathway, NADH and NAD+serve as coenzymes thus the energy resources are generated for parasites. This article summarizes the methods used in studying antiparasitic drug targets and progress in research on LDH as a potential drug target for parasites, representing important theoretical signif cance in the research on the molecular mechanisms of drugs and development of new drugs.

Parasites; antiparasitic drug; drug targets; lactate dehydrogenase

S859.795

A

1674-6422（2015）03-0073-08

2014-12-08

國家自然科學(xué)基金（31272557）

李莎，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)通信作者：董輝，E-mail: donghui@shvri.ac.cn