丁 亮，吳秀蓮

（南京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 高淳區(qū)質(zhì)量計(jì)量檢測(cè)所，江蘇 南京 211300）

納米生物傳感器（nanobiosensors）是將分子生物學(xué)與信息技術(shù)相結(jié)合，將生物物質(zhì)濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器。生物傳感器為食品工藝操作者和食品安全局提供了快速檢測(cè)病原體和潛在污染物的能力，且降低了與食物相關(guān)疾病的健康風(fēng)險(xiǎn)及醫(yī)藥成本。盡管目前檢測(cè)食品病原體的方法有所改進(jìn)，但為了能簡單快速、多功能及廉價(jià)的檢測(cè)食品污染物，當(dāng)前檢測(cè)技術(shù)的完善仍面臨著許多挑戰(zhàn)和機(jī)遇。

最近，納米材料在傳感器中的應(yīng)用大幅提升了傳感器檢測(cè)系統(tǒng)的分辨力。目前常用的納米材料包括磁納米粒（magnetic nanoparticles，MNPs）、碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）、納米桿（nanorods，NRs）、量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）、納米線（nanowires，NWs）及納米通道（nanochannels，NCs）等。這些納米材料應(yīng)用于電生物傳感器時(shí)，具備很高的電荷轉(zhuǎn)移能力，從而具備更低的檢測(cè)限和更高的靈敏度[1-3]。近幾年來，納米生物傳感器在食品工業(yè)中的應(yīng)用，會(huì)極大地改善食品的質(zhì)量控制、食品安全和易加工特性。納米生物傳感器的優(yōu)勢(shì)使其可應(yīng)用于食品行業(yè)以下幾個(gè)方面：原材料預(yù)處理、食品加工（質(zhì)量控制）、儲(chǔ)藏條件監(jiān)測(cè)等。納米生物傳感器可達(dá)到非常低的檢測(cè)限（甚至是單個(gè)分子或細(xì)胞）。此外，它們可提供多種可能性，保證高穩(wěn)定性（如納米顆粒量子點(diǎn)比酶或熒光染料要穩(wěn)定得多）。除了減少試劑用量、檢測(cè)時(shí)間、靈敏度穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)外，其主要優(yōu)勢(shì)在于不需要專業(yè)使用者操作。

盡管已有很多關(guān)于納米生物傳感器的報(bào)道[4-6]，該文旨在綜述一些比較重要的基于各種檢測(cè)技術(shù)的納米生物傳感器及其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 納米生物傳感器在食品中的應(yīng)用

近幾年，新型的納米材料被廣泛應(yīng)用于電極表面改造，使得生物分子達(dá)到更快的電荷轉(zhuǎn)移能力及更高的特異性。這一應(yīng)用也激發(fā)了納米生物傳感器與生物分子相結(jié)合的研究。這些生物傳感器已被應(yīng)用于不同的領(lǐng)域，如食品質(zhì)量檢測(cè)、臨床分析和環(huán)境控制。隨著各種微型化、集成化、智能化、實(shí)用化的生物傳感器的開發(fā)與應(yīng)用，相信納米生物傳感器的面貌將會(huì)煥然一新。

生物傳感器的分子識(shí)別元件中，酶[7]、抗體[8]或脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）序列[9]與納米材料如金屬金（Au）納米粒子（nanoparticles，NPs）、單壁碳納米管（single-walled carbon nanotube，SWCNTs）、多壁碳納米管（multi-walled Carbon nanotubes，MWCNTs）、碲化鎘（CdTe）量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）納米粒子等的結(jié)合為食品應(yīng)用提供了一個(gè)新的整合系統(tǒng)，其將納米材料的傳導(dǎo)體和半導(dǎo)體特性與生物材料的識(shí)別和催化性質(zhì)相結(jié)合，為納米生物傳感器在食品檢測(cè)中的應(yīng)用奠定了更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。生物傳感器在食品化學(xué)研究中應(yīng)用也日趨增加，如在酒行業(yè)或其他行業(yè)中的應(yīng)用[10]。

2 納米電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器是一種應(yīng)用最廣、數(shù)量最多且成功商業(yè)化的生物傳感器，其主要依賴于生物分子電極，特別是電流式的電化學(xué)生物傳感器，具備更優(yōu)的靈敏度和更好的線性范圍[11-12]。此外，它們也有比光學(xué)設(shè)備更具優(yōu)勢(shì)的地方，如成本低，操作簡單，體積小，在單芯片裝置中任意組裝多種傳感元件[13]。將納米材料引入電化學(xué)生物傳感器和生物傳感器，其帶來了更多優(yōu)勢(shì)：降低了許多分析上的重要電化學(xué)反應(yīng)的多種潛在可能，保證一些氧化還原反應(yīng)的可逆性（其在未改變電極時(shí)是不可逆的），多檢測(cè)能力。

2.1 殺蟲劑

由于大部分殺蟲劑水溶性較高，毒性大，在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用廣泛。因此，急需高靈敏度和高特異性的檢測(cè)方法檢測(cè)這些污染物的殘留[14]?；谝阴Ｄ憠A酯酶抑制的生物傳感器可以檢測(cè)其抑制劑，如有機(jī)磷酯酶和氨基甲酸鹽殺蟲劑，廣泛用于含磷化合物的檢測(cè)[15-17]。袁永海等[18]綜述了電化學(xué)生物傳感器在農(nóng)藥檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用。用碳納米管（CNTs）改造的傳感器檢測(cè)有機(jī)磷（organophosphorus，OP）殺蟲劑較電流生物傳感器有很多優(yōu)勢(shì)，DEO R P等[19]利用這些優(yōu)勢(shì)發(fā)展了基于有機(jī)磷水解酶（organophosphorus hydrolase，OPH）的生物傳感器，用來檢測(cè)對(duì)氧磷。VISWANATHAN S等[9]報(bào)道了一種乙酰膽堿酯酶生物傳感器，其固定化聚苯胺，垂直放置于裝有含巰基的單鏈寡核苷酸的單壁碳納米管上，用它檢測(cè)蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥：甲基對(duì)硫磷和毒死蜱。含巰基的單鏈寡核苷酸-單壁碳納米管通過Au-S化學(xué)鍵固定在金屬表面。隨著該設(shè)備的發(fā)展，單壁碳納米管的引入，不僅促進(jìn)了電荷轉(zhuǎn)移，而且增加了三維傳導(dǎo)支持物與乙酰膽堿酯酶接觸的表面。通過抑制酶反應(yīng)檢測(cè)甲基對(duì)硫磷和毒死蜱，因?yàn)橛袡C(jī)磷酸酯或氨基甲酸鹽殺蟲劑存在時(shí)，正常的乙酰膽堿酯酶活性改變，從而降低了生物傳感器的信號(hào)。該信號(hào)的降低程度與殺蟲劑濃度有關(guān)。

2.2 病原菌

食物傳播的疾病主要是由被細(xì)菌、病毒或寄生物污染的食物引起。近幾年由食物傳播疾病引發(fā)的死亡率逐漸升高。在食物中發(fā)現(xiàn)和研究最多的是沙門氏菌（Salmonella spp.）、大腸桿菌（Escherichia coli）和李斯特菌（Listeria monocytogenes）。然而，其他會(huì)污染食物的病原菌也有呼吸道合胞病毒和寄生生物，如隱孢子蟲屬（Cryptosporidium）和賈第蟲屬（Giardia）[20-21]。因此，利用快速、靈敏、特異性強(qiáng)和廉價(jià)的分析方法檢測(cè)這些微生物污染物是十分有必要的，而不僅僅是提供測(cè)試微生物的定性或定量信息?；诩{米材料的生物傳感器已被應(yīng)用于病原體檢測(cè)。生物傳感器的識(shí)別原件主要在于納米材料表面，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制檢測(cè)雜合表面與病原體相互作用[22]。

結(jié)合抗體的納米顆粒在檢測(cè)沙門氏菌（Salmonella spp.）中可顯示免疫過程優(yōu)勢(shì)。如DUNGCHAIA W等[6]用金屬納米材料檢測(cè)傷寒沙門氏菌，將單克隆抗體固定化于聚苯乙烯微孔，捕獲傷寒沙門氏菌。之后加入多克隆抗體-膠體金結(jié)合物，以固定住傷寒沙門氏菌，隨后抗壞血酸維生素C和硫酸銅加入聚苯乙烯微孔，抗壞血酸維生素C將Cu2+還原為Cu，而Cu附于金屬納米材料標(biāo)簽上。釋放的銅離子可通過電壓檢測(cè)，而銅則于金屬納米材料標(biāo)簽相關(guān)。因此，該設(shè)備科用于檢測(cè)傷寒沙門氏菌含量，如今檢測(cè)限可達(dá)98.9 CFU/mL。YONG G J等[23]將沙門氏菌單克隆抗體固定于金納米顆粒，利用電化學(xué)阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌與單克隆抗體的相互作用。電容型免疫傳感器與聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法相比，具有高非特異性相互作用和分析時(shí)間短（40 min）的優(yōu)勢(shì)。

2.3 糖類

實(shí)時(shí)檢測(cè)碳水化合物的水平對(duì)發(fā)酵過程是有必要的。當(dāng)糖濃度較低會(huì)降低發(fā)酵產(chǎn)量時(shí)，糖水平就是一個(gè)限制因素?；诖?，很多電流式生物傳感器結(jié)合葡萄糖氧化酶來檢測(cè)葡萄糖，結(jié)合牛乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶來檢測(cè)乳糖，結(jié)合牛乳糖苷酶和果糖脫氫酶來檢測(cè)乳果糖。OZDEMIR C等[7]發(fā)現(xiàn)了一種結(jié)合金（Au）納米粒子（NPs）和吡喃糖氧化酶的生物傳感器，其對(duì)D-葡萄糖親和力強(qiáng)，應(yīng)用于果汁檢測(cè)。Au NPs顯示很好的生物兼容性及職能化能力，可使固定的酶穩(wěn)定于操作環(huán)境，使得其在生物傳感器中快速、穩(wěn)定的反應(yīng)。ZHAO Z等[24]為檢測(cè)葡萄糖構(gòu)建了一種固定化葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）到氧化鋅（ZnO）：鈷（Co）納米薄層的電流生物傳感器，這兩種報(bào)道的生物傳感器的電化學(xué)反應(yīng)具備很高的靈敏度，最低檢測(cè)限分別達(dá)到1 μmol/L和20 μmol/L。

雖然蔗糖是最常用的食品甜味劑，但果糖同樣重要。ANTIOCHIA R等[25]報(bào)道用CNTs作為傳導(dǎo)納米材料的電流生物傳感器檢測(cè)蜂蜜中的果糖。該傳感器中，電極表面上部置有固定了3,4-二羥基苯甲醛和D-果糖脫氫酶的電子聚集膜，該膜與CNT黏結(jié)，從而進(jìn)行傳導(dǎo)。用該傳感器檢測(cè)真實(shí)樣品中的果糖，線性范圍好，檢測(cè)限較傳統(tǒng)固體電極低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。TOMINAGA M等[26]研究了吸附有果糖脫氫酶的MWCNTs的混合電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，結(jié)果顯示，催化氧化電流與銀/氯化銀/飽和氯化鉀（Ag/AgCl/sat’d KCl）相比校正-0.15 V，這相當(dāng)于亞鐵血紅素C的氧化還原能力。

3 光纖納米生物傳感器

光學(xué)傳感器是通過檢測(cè)分子識(shí)別元件與底物（待測(cè)物）特異結(jié)合后產(chǎn)生的可以輸出的特征光學(xué)信號(hào)（熒光、顏色變化等），來分析檢測(cè)待測(cè)物的傳感器。其主要包括光纖熒光生物傳感器、光纖免疫傳感器以及最近才發(fā)展起來的無轉(zhuǎn)換器的細(xì)胞內(nèi)生物傳感器、分子信標(biāo)傳感器、DNA光纖生物傳感器等[27]。光纖納米生物傳感器在食品、生物醫(yī)藥、衛(wèi)生護(hù)理、醫(yī)藥品和環(huán)境監(jiān)測(cè)中應(yīng)用廣泛。納米材料如金納米粒子（Au NPs）、四氧化三鐵磁納米粒（Fe3O4）MNPs和QDs具有很好的光學(xué)特性，可提高生物傳感器光纖傳感器表面的靈敏度。

3.1 殺蟲劑

有機(jī)磷（OP）神經(jīng)毒素是一類獨(dú)特的污染物，毒性極強(qiáng)。這些毒素可有效抑制酯酶活性，如乙?；懝檀己投□Ｄ懝檀蓟蛏窠?jīng)毒性酯酶。如今有利用熒光試驗(yàn)檢測(cè)有機(jī)磷神經(jīng)毒素的方法，其利用有機(jī)磷水解酶（OPH）特異性識(shí)別有機(jī)磷的原理。VINAYAKA A等[8]用基于競(jìng)爭(zhēng)性熒光免疫的生物傳感器檢測(cè)2,4-二氯苯氧基乙酸，納米材料為CdTe QD。2,4-二氯苯氧基乙酸除草劑即使在很低劑量時(shí)，也可損害人體健康。因此，在食品分析中能快速檢測(cè)低水平的除草劑是很重要的。熒光免疫試驗(yàn)用固定有抗-2,4-二氯苯氧基乙酸抗體的免疫反應(yīng)器，可檢測(cè)250 pg/mL的2,4-二氯苯氧基乙酸。SIMONIANA A等[28]發(fā)展了一種快速檢測(cè)有機(jī)磷神經(jīng)毒素（如對(duì)氧磷）的生物傳感器，該傳感器是基于有機(jī)磷水解酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的熒光變化，該抑制劑可被有機(jī)磷的底物取代，而熒光強(qiáng)度與溶液中對(duì)氧磷濃度相關(guān)。LEBLANC R M 等[29]報(bào)道了基于QDs/OPH的生物傳感器檢測(cè)對(duì)氧磷。

3.2 病原體

光纖技術(shù)利用熒光和表面等離子供體更廣泛用于病原體檢測(cè)。這些技術(shù)依賴于檢測(cè)發(fā)生在功能化納米材料和病原體之間的光學(xué)信號(hào)變化。已有報(bào)道通過檢測(cè)有機(jī)染料釋放的熒光[30-31]或蛋白質(zhì)熒光[32]來檢測(cè)細(xì)菌的光纖傳感器。MNPs表面積/體積比高，具有更大用于捕獲細(xì)菌的碳水化合物接觸的表面。基于此，EL-BOUBBOU K等[33]利用免疫熒光顯微鏡檢測(cè)大腸桿菌。該方法通過酰胺鍵將MNPs和D-甘露糖（D-mannose）的接觸表面縮小，隨后與熒光素標(biāo)記的伴刀豆球蛋白A混合12 h，之后培養(yǎng)溶于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中的大腸桿菌（E.coli）細(xì)胞。將MNPs與大腸桿菌溶液混合幾分鐘后，利用磁場(chǎng)將MNPs/E.coli聚集體分離。去掉上清，聚集體徹底清洗，用熒光染料染色，移至載玻片，拍照。熒光顯微鏡成像顯示大腸桿菌被檢測(cè)出，檢測(cè)限達(dá)104CFU/mL。

與金屬NPs類似，金屬納米殼也有表面等離子供體帶。金屬納米殼薄薄的涂在作為核心的大顆粒上。KALELE S A等[34]發(fā)現(xiàn)了一種快速可靠檢測(cè)大腸桿菌的方法，利用將與抗體結(jié)合的表面等離子供體用于銀納米殼，大腸桿菌與抗體的相互作用特異性高，其他微生物在表面等離子供體中并不會(huì)產(chǎn)生變化。用這種方法，利用抗體結(jié)合的銀納米殼有助于快速飲用水檢測(cè)。

3.3 糖類

LI X等[35]用靜電積層自組裝技術(shù)將光學(xué)特性的QDs與生物學(xué)特性的葡萄糖氧化酶整合入混合薄膜?；谶@種納米復(fù)合膜，開發(fā)出一種新型葡萄糖檢測(cè)生物傳感器，其利用CdTe QDs/GOx多層膜固定于光學(xué)透明基質(zhì)中。葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成雙氧水，其侵蝕QDs產(chǎn)生許多表面物質(zhì)，導(dǎo)致QDs熒光淬滅。通過檢測(cè)熒光變化計(jì)算樣品中葡萄糖濃度。這種生物傳感器對(duì)葡萄糖選擇性好?？赏ㄟ^控制QDs和GOx的層數(shù)提高傳感器的靈敏性和線性范圍。

WEI H等[36]開發(fā)了一種利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成雙氧水，與Fe3O4MNPs反應(yīng)，檢測(cè)葡萄糖含量的光纖生物傳感器。45 ℃條件下，在溶于0.2 mol/L pH 4.0的醋酸鹽緩沖液中的H2O2存在時(shí)，過氧化物酶的底物2,2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）被Fe3O4MNPs氧化。這種檢測(cè)葡萄糖的比色法利用GOx和Fe3O4MNPs 作為酶制劑，可以得到高靈敏度和特異性好的光纖生物傳感器。

麥芽糖是另一種食物檢測(cè)中的重要糖類物質(zhì)。SANDROS M G等[37]發(fā)明了一種利用單分子蛋白-覆有硒化鎘的硫化鋅（CdSe@ZnS）納米顆粒的電子轉(zhuǎn)移淬滅的麥芽糖生物傳感器，這種納米顆粒是由附有釕II（RuII）復(fù)合物的蛋白質(zhì)提供。這種傳感器通過麥芽糖引起的構(gòu)造變化使得釕II-硒化鎘（RuII-CdSe）納米顆粒距離變化，而該距離會(huì)改變納米顆粒散射強(qiáng)度。

4 結(jié)束語

納米生物傳感器基于多種生物傳感器傳導(dǎo)模式和檢測(cè)原理，使用方便，適合現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。由于是納米級(jí)工作，以后有可能發(fā)展出可同時(shí)篩查多種分析物的設(shè)備。然而，在納米生物傳感器有效應(yīng)用于真正的食品系統(tǒng)前，還有很多科學(xué)技術(shù)障礙。特別是對(duì)于納米材料（如NPs，NWs，CNTs等）毒性的擔(dān)心。為了克服這些障礙，需要加快關(guān)于在真實(shí)樣品分析中的干擾物的研究。面對(duì)我國食品安全的需要，以及國際綠色貿(mào)易壁壘的挑戰(zhàn)，仍然還要繼續(xù)努力，研制、開發(fā)靈敏度高、適用性強(qiáng)、簡便快捷的檢測(cè)技術(shù)與方法，以保護(hù)我國的利益和消費(fèi)者的健康，同時(shí)還應(yīng)該爭(zhēng)取從源頭上杜絕食品安全的隱患。

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