高虹，程薇，史德芳，范秀芝，薛淑靜，周康

摘要：采用纖維素酶（A）和中性蛋白酶（B）復(fù)合酶系水解香菇柄，確定香菇（Lentinus edodes）柄中風(fēng)味成分最佳溶出條件。以可溶性蛋白質(zhì)溶出率和氨基酸釋放率為評價指標，分別考察酶A水解時料液比、pH、添加量、酶解溫度及酶解時間和酶B水解時pH、添加量、酶解溫度和酶解時間對提取率的影響;以游離氨基酸、呈味核苷酸、多糖的溶出率和酶解液感官品質(zhì)為評價指標，比較了熱水浸提法、纖維素酶單酶解法、復(fù)合酶解法3種方法的優(yōu)劣。結(jié)果表明，最適酶解工藝條件為先以0.2%食用菌水解酶A，料液比（m∶V）為1∶6，pH 4.5，溫度55 ℃的條件酶解2 h，在此條件下可溶性蛋白質(zhì)溶出率為4.12%，然后在酶解液中加入0.15% 酶B，于pH 6.5，溫度50 ℃酶解6 h，在此條件下總氨基酸釋放率為2.16%;復(fù)合酶法水解香菇柄所得游離氨基酸、呈味核苷酸、多糖含量、感官評分分別為2.16%、1.57%、7.25%、82分，均優(yōu)于另外2種方法。

關(guān)鍵詞：香菇Lentinus edodes）柄;纖維素酶;中性蛋白酶;復(fù)合水解

中圖分類號：S646.1+2 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5823-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.051

香菇（Lentinuus edodes）屬擔(dān)子菌綱、傘菌目、口蘑科、香菇屬，是繼雙孢菇之后的世界第二大食用菌，在民間素有“山珍”之稱。中國香菇出口貿(mào)易量近10年逐步上升，居世界第一位[1]。香菇柄約占香菇干重的20%～30%[2]，因粗韌難嚼，吞咽困難，為了保證香菇的質(zhì)量和滿足出口要求，必須將其除去。據(jù)不完全統(tǒng)計，僅湖北省，香菇加工中每年產(chǎn)生2萬t左右的菇柄，絕大部分都被廢棄，造成了極大的資源浪費。

香菇柄中含有大量的營養(yǎng)活性成分，其中以香菇多糖和膳食纖維最為突出[3-5]。前期本課題組以香菇柄膳食纖維和活性多糖為目標，進行了深入研究[6-9]。實際上，香菇柄中風(fēng)味成分的含量也十分豐富，由于纖維類物質(zhì)的包裹，菇柄的風(fēng)味成分很難釋放，其鮮香味遠不如香菇菇蓋濃郁醇厚。本研究擬應(yīng)用生物酶解技術(shù)，使菇柄風(fēng)味成分高效釋放，以期為利用菇柄開發(fā)菌類調(diào)味品提供理論支撐。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

香菇柄：由湖北裕國菇業(yè)股份有限公司提供;食用菌水解酶，由酶A（纖維素酶）和酶B（中性蛋白酶）組成，南寧龐博生物工程有限公司提供;纖維素酶，上海東風(fēng)生化技術(shù)有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 ?儀器設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋（DZKW-D-2型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠）;紫外可見分光光度計（T6新世紀型，北京普析通用儀器有限公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52型，上海亞榮生化儀器）;循環(huán)水式真空泵[SHZ-D（Ш）型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司];植物粉碎機（LG-500A型，瑞安百信藥機械廠）;低速自動平衡離心機（DT5-4B型，北京時代北利離心機有限公司）;SW-CJ-1FD型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）;自動精密酸度計（pHS-3C型，上海雷磁分析儀器廠）。

1.3 ?試驗方法

1.3.1 ?復(fù)合酶解工藝工藝流程 ?香菇柄→粉碎→加水混合→調(diào)pH→加熱→加入酶A保溫酶解→再次調(diào)pH→加入酶B保溫酶解→滅酶→過濾→低溫減壓濃縮→冷藏備用[10]。

酶A酶解試驗：加入食用菌水解酶酶A進行酶解試驗，以樣品的可溶性蛋白質(zhì)含量為指標，分別考察料液比、pH、酶A添加量、酶解溫度和酶解時間對酶解的影響。

酶B酶解試驗：取酶A酶解處理后的樣品，加入酶B進行酶解試驗，以樣品的氨基酸含量為指標，考察pH、酶B添加量、酶解溫度和酶解時間對酶解的影響。

1.3.2 ?纖維素酶單酶法酶解工藝 ?工藝條件參照文獻[11]，即：加酶量0.5%、酶解時間2 h、料液比1∶25（m∶V，下同）、pH 6.0、酶解溫度50 ℃。

1.3.3 ?熱水浸提法工藝 ?工藝條件參照文獻[12]，即：料液比1∶30、浸提溫度70 ℃、浸提時間2 h，提取2次。

1.3.4 ?不同工藝香菇柄中活性成分釋放率的比較 ? 對熱水浸提法、纖維素酶單酶法、復(fù)合酶解法3種方法釋放香菇柄中游離氨基酸、呈味核苷酸、多糖的效果進行比較。

感官評分：選取9個經(jīng)過嚴格培訓(xùn)的評定員組成感官鑒定小組，對不同工藝得到的酶解液的色澤外觀和風(fēng)味進行綜合評價?？偡譂M分為100，色澤外觀、風(fēng)味的評分根據(jù)各項指標所占比例（20%、80%）的不同，計算最終得分，評分標準如表1所示。

1.4 ?測定方法

可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法;游離氨基酸含量測定參照GB/T5009.124—2003 的方法;呈味核苷酸測定參照SB/T 10484—2008的方法;粗多糖含量測定參照NY/T 1676—2008的方法。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?酶A酶解工藝優(yōu)化

2.1.1 ?料液比對可溶性蛋白質(zhì)溶出率的影響 ?取一定量香菇柄粗粉，分別按料液比1∶3、1∶6、1∶12、1∶24加水，加入酶A，用量（以底物的質(zhì)量計算，下同）0.20%，在pH為4.5的條件下恒溫55 ℃水解2 h。由圖1可知，可溶性蛋白質(zhì)溶出率隨著料液比的倍數(shù)增加而升高，當料液比高于1∶6時，可溶性蛋白質(zhì)溶出率增長趨緩，繼續(xù)提高料液比，可溶性蛋白質(zhì)的溶出率仍有升高，但提高的量不明顯;若料液比過低則提取不徹底，而料液比過高，則降低了提取液的固形物含量，濃縮成本較大，不利于以后的分離。因此，確定料液比為1∶6。

2.1.2 ?pH對可溶性蛋白質(zhì)溶出率的影響 ?取一定量香菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，酶A用量0.20%，在不同pH （3.5、4.5、5.5、6.5）條件下恒溫55 ℃水解2 h，結(jié)果見圖2。由圖2可知，可溶性蛋白質(zhì)溶出率隨著pH的升高先增加后降低，pH 在4.5時可溶性蛋白質(zhì)的溶出率最高，可能的原因是每種酶都有一個最適pH，當在此條件下反應(yīng)時，酶的活性最高，反應(yīng)條件與其偏離的越遠，酶的活性越低，從pH作用的范圍來看，酶A這種纖維素酶最適pH為4.5。

2.1.3 ?酶A添加量對可溶性蛋白質(zhì)溶出率的影響

取一定量香菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，選擇不同酶A添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%），在pH為4.5條件下保溫55 ℃水解2 h，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，可溶性蛋白質(zhì)溶出率隨著加酶量的增加而升高，當酶添加量達到0.2%后，再增加酶用量，可溶性蛋白質(zhì)溶出率增加緩慢，這可能是由于在低酶濃度的情況下，底物能夠完全與酶結(jié)合，從而破壞細胞壁，使其內(nèi)容物釋放，但在較高酶濃度情況下，底物不能對酶達到飽和，從而使一部分酶分子無法發(fā)揮效用。此外，從經(jīng)濟效益出發(fā)，酶添加量不宜過高，因此取0.20%為宜。

2.1.4 ?酶解溫度對可溶性蛋白質(zhì)溶出率的影響 ?取一定量香菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，酶A添加量0.20%，pH 4.5條件下，選擇在不同溫度（40、45、50、55、60 ℃）水解2 h，結(jié)果見圖4。每種酶都有一個最適溫度，當在此條件下反應(yīng)時，酶的活性最高，反應(yīng)條件與其偏離的越遠，酶的活性越低。由圖4可知，在較低溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的上升酶活性也隨之提高，可溶性蛋白質(zhì)的溶出增多，在55 ℃左右達到最高，隨著溫度繼續(xù)上升將使酶的穩(wěn)定性下降，部分酶蛋白分子開始失活。因此，選擇酶解溫度為55 ℃適宜。

2.1.5 ?酶解時間對可溶性蛋白質(zhì)溶出率的影響 ?取一定量菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，酶A用量0.20%，pH 4.5，溫度55 ℃，選擇在不同時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）內(nèi)進行酶解，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著酶解時間的延長，可溶性蛋白質(zhì)溶出率逐漸增加，當酶解時間超過2.0 h后，可溶性蛋白質(zhì)溶出率增加趨緩，可能是在較短的反應(yīng)時間內(nèi)，酶分子快速破壞細胞壁，使細胞內(nèi)容物釋放，隨著時間的延長，細胞壁已經(jīng)被完全破壞，內(nèi)容物已充分溶解，使得可溶性蛋白質(zhì)溶出率升高趨勢變緩，因此，酶解時間確定為2.0 h。

由以上分析可知，食用菌水解酶酶A的酶解工藝條件為料液比1∶6，酶A添加量0.20%，最適pH 4.5，溫度55 ℃，酶解2.0 h，在此條件下可溶性蛋白溶出率為4.12%。

2.2 ?酶B酶解條件

2.2.1 ?pH對氨基酸釋放率的影響 ?取酶A酶解處理后的樣品，選取不同pH （3.5、4.5、5.5、6.5、7.5），酶B添加量0.1%，溫度50 ℃，酶解4 h，結(jié)果見圖6。氨基酸的釋放率隨著pH的升高而增加，至6.5左右達到最高，隨后出現(xiàn)下降，由反應(yīng)結(jié)果可知，該酶的pH作用范圍為6～7，因此選擇pH為6.5。

2.2.2 ?酶B添加量對氨基酸釋放率的影響 ?取酶A酶解處理后的樣品，選取不同的酶B添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%），pH 6.5，溫度50 ℃，酶解4 h，結(jié)果見圖7。由圖7可知，隨著酶添加量的增加，氨基酸釋放率上升，達到0.15%后，繼續(xù)提高添加量氨基酸釋放率上升平緩。綜合考慮成本等因素，選擇酶B添加量為0.15%。

2.2.3 ?酶解溫度對氨基酸釋放率的影響 ?取酶A酶解處理后的樣品，選取在不同溫度（30、40、50、60 ℃）下，酶B添加量為0.1%，pH 6.5，酶解4 h，結(jié)果見圖8。由圖8 可以看出，溫度對氨基酸釋放率影響較大。隨著溫度的升高，氨基酸釋放率先增加后降低，溫度低于30 ℃或高于60 ℃均不利于水解，最適溫度為50 ℃。

2.2.4 ?酶解時間對氨基酸釋放率的影響 ?取酶A酶解處理后的樣品，選取不同處理時間（2、4、6、8 h），酶B添加量為0.1%，溫度50 ℃，pH 6.5，結(jié)果見圖9。由圖 9 可知，隨著酶解時間的延長，氨基酸的釋放率也隨之增加，當酶解時間超過6 h 后，氨基酸釋放率的增幅趨于平緩，可能是在較短反應(yīng)時間內(nèi)，酶分子快速破壞蛋白質(zhì)分子，使其快速轉(zhuǎn)化為氨基酸，隨著時間的延長，蛋白質(zhì)分子大部分被水解成了多肽和氨基酸，使得氨基酸釋放率升高趨勢變緩，考慮到實際生產(chǎn)情況，揮發(fā)性物質(zhì)因水解時間過長損失較大， 對產(chǎn)品的滋味和氣味不利，酶解作用6 h 較為適宜。

由以上分析可知，香菇菇柄經(jīng)過酶A處理后，酶B進行酶解的最適工藝條件為pH 6.5，酶B添加量 0.15%，溫度50 ℃，酶解6 h。此條件下，總氨基酸釋放率為2.16%。

2.3 ?不同工藝的比較試驗

對熱水浸提法、纖維素酶酶解法、復(fù)合酶法3種方法釋放香菇柄中呈味物質(zhì)的效果進行了比較，結(jié)果見圖10。由圖10可知，游離氨基酸、呈味核苷酸和多糖的釋放效果由高到低依次為復(fù)合酶法、纖維素酶單酶法和熱水浸提法。復(fù)合酶法的氨基酸釋放率較熱水浸提法有大幅提高，復(fù)合酶的使用比單獨加入纖維素酶效果更好，因為有蛋白酶參與作用，使胞內(nèi)溶出的蛋白質(zhì)加快分解，酶解液中氨基態(tài)氮含量得以顯著提高，酶解液風(fēng)味得到很大改善。復(fù)合酶法同時也大幅提高了多糖的溶出率，可能與纖維素酶的破壁作用有關(guān)。

2.4 ?酶解液感官判定分析

3種方法制備香菇柄酶解液感官評定結(jié)果如圖11所示。從圖11可看出，復(fù)合酶酶解液的感官效果最好，評定分數(shù)達到82分，其次是纖維素酶解液，而熱水浸提液感官效果較差;感官評價結(jié)果與圖10呈味物質(zhì)比較結(jié)果吻合。

綜合分析可知，利用復(fù)合酶中不同酶的作用特點進行分步酶解可以達到較好的酶解效果，復(fù)合酶法是3種釋放香菇柄中風(fēng)味成分綜合效果最好的方法。

3 ?討論

通過優(yōu)化，得到香菇柄復(fù)合酶解的工藝條件為料液比1∶6，酶A添加量0.20%，最適pH 4.5，溫度55 ℃，酶解2.0 h，然后調(diào)pH至6.5，加入酶B 0.15%，溫度50 ℃，酶解6 h。此條件下，總氨基酸釋放率為2.16%，呈味核苷酸釋放率為1.57 %，多糖溶出率為7.25%;較熱水浸提法和纖維素酶單酶法均有大幅提高。復(fù)合酶通過搭配使用，不僅可以提高酶解液中氨基酸等呈味物質(zhì)的含量，而且改善了產(chǎn)品的感官風(fēng)味，突出蛋白水解物的特征味[13]，且易與其他呈味成分配伍，賦予食品多層次、圓潤味的特點[14]。香菇柄酶解之后仍有大量殘渣產(chǎn)生，尚需尋求另一種香菇柄高效破壁技術(shù)與之協(xié)同使用。

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