吳桐 ，劉吉成 ，邱永強(qiáng) ，李美謙 ，何寧 ，李鴻梅 ，李喜春

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院，黑龍江齊齊哈爾 160006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 160006；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 160006

乳腺癌是由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的復(fù)雜 疾病，乳腺癌在世界范圍內(nèi)女性中排名首位的致病致死惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性生命健康。近年來，全球范圍內(nèi)，乳腺癌發(fā)病呈年輕化趨勢。然而，乳腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌發(fā)病有家族聚集性，并存在種族差異[1]，說明遺傳因素在乳腺癌發(fā)病中起重要作用。針對乳腺癌這類復(fù)雜性疾病,國內(nèi)外學(xué)者從群體遺傳學(xué)角度進(jìn)行了基于候選基因途徑和全基因組相關(guān)研究（GWAS）的大量研究，找到了很多易感基因和風(fēng)險位點[2]，這些易感基因和易感位點有望作為腫瘤標(biāo)志物改善乳腺癌的風(fēng)險預(yù)測及早期診斷，為確定高危人群、尋找預(yù)警標(biāo)志物及個體化醫(yī)療提供理論依據(jù)。rs6551328是該研究室前期在湖南人群中關(guān)于乳腺癌GWAS研究中篩選到的易感位點，為探討該單核苷酸多態(tài)性（SNP）與黑龍江省漢族女性乳腺癌發(fā)病相關(guān)性，以及等位基因變化對疾病的風(fēng)險作用，該研究對該位點基因頻率及基因型頻率分布進(jìn)行了病例/對照研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究對象選自黑龍江地區(qū)2013年1月—2015年1月臨床收治漢族女性患者共計150例，年齡25～68歲，平均（46.18±4.86）歲。經(jīng)病理組織學(xué)確診患者；300例對照選自臨床體檢健康漢族女性，年齡26～68歲，平均年齡（44.92±5.21）歲。排除既往有放化療史，其他腫瘤病史，自身免疫系統(tǒng)疾病史，精神病史，內(nèi)分泌疾病史，職業(yè)暴露史，以及家族一級親屬患有乳腺癌、卵巢癌者，排除在黑龍江地區(qū)居住不滿15年者。采集收集病例組臨床病理資料及對照組健康查體資料；采集兩組研究對象外周靜脈血5 mL，EDTA抗凝管保存?zhèn)溆谩＝?jīng)調(diào)查問卷收集患者一般資料：初潮年齡、月經(jīng)周期、是否生育、首次懷孕年齡、生育次數(shù)、哺乳史、惡性腫瘤家族史等；收集患者完整病例資料：確診年齡、腫瘤大學(xué)、是否轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、雌激素受體、孕激素受體等。該研究經(jīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)備案，所有受試者均知情同意。

1.2 基因分型

全血基因組DNA提取采用試劑盒提取法（天根生化科技有限公司，DP348-03），提取后經(jīng)紫外分光光度計質(zhì)控，OD260/280在1.6～1.8之間，DNA工作液濃度在(50±2)ng/uL。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PCR引物，上游引物為 CAGAACCCGCAGTAACCC（5'-3'），下游引物為 CAGCCATCTCAGCAACCC（5'-3'），引物由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為：2×EasyTaq PCR Super Mix 12.5uL（北京全式金生物技術(shù)有限公司，AS111-12），2pM上下游引物各1 uL，DNA模板1 uL，超純水9.5 uL；擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，30 個循環(huán)后，72℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，產(chǎn)物為412 bp，并由北京六合華大基因科技股份有限公司完成測序。

1.3 統(tǒng)計方法

PCR測序結(jié)果由DNAstar軟件判讀，患者一般資料及臨床病理資料采用Epidata3.1軟件錄入，Hardy-Weinberg平衡用Haploview軟件計算，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 單核苷酸多態(tài)性rs6551328位點基因分型

rs 6551328位于3號染色體3p1.1區(qū)，有C/T兩個等位基因，其基因型為CC，CT，TT三種。PCR產(chǎn)物目的條帶電泳和測序結(jié)果見圖1。

圖1 rs 6551328PCR產(chǎn)物目的條帶電泳和測序結(jié)果

2.2 rs 6551328等位基因及基因型在所選人群中的分布

測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病例組中CC型為74例，CT型為67例，TT型為1例；對照組中CC型為151例，CT型為77例，TT型為1例。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗,P＞0.05,提示該位點各基因型分布在乳腺癌組和對照組中符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，說明研究對象在遺傳學(xué)方面可以代表本地人群。

該位點兩等位基因頻率分別為，病例組中C頻率為75.7%,計算方法為（2×NCC+NCT）/[2×（NCC+NCT+NTT）]，T 頻率為 24.3%，計算方法為（NCT+2×NTT）/[2×（NCC+NCT+NTT）]；對照組中C頻率為80.6%,T頻率為19.4%，兩組等位基因頻率分布無明顯差異（χ2=2.578，P=0.108）。

表1 rs6551328多態(tài)性與臨床病理特征關(guān)系

分析三個基因型在兩組中的分布，χ2=9.468，P=0.009，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相對于CC型，CT型的風(fēng)險值OR=1.776，95%CI為1.155～2.728;TT型的風(fēng)險值OR=0.292(0.035～2.413)（P＞0.05）;相對于純合型（CC+TT）,雜合型 CT 的風(fēng)險值OR=1.883，95%CI為 1.195～2.281。

2.3 rs6551328多態(tài)性與臨床病理特征關(guān)系

rs6551328多態(tài)性與臨床病理特征如表1所示，其中雜合型(CT)與純合型（CC+TT）在乳腺癌病例是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組中，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示，rs6551328CT雜合型對乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移有較高風(fēng)險。

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球呈明顯的上升趨勢，目前，全球每年約有120萬新發(fā)乳腺癌病例，約有50萬婦女死于乳腺癌，乳腺癌嚴(yán)重威脅著婦女的健康和生命。中國是乳腺癌發(fā)病率增長最快的國家之一，據(jù)2010年1月《中國乳腺疾病調(diào)查報告》顯示，我國主要城市10年來發(fā)病率增長37%，城市地區(qū)乳腺癌的死亡率增長了38.91%，而該省每年新增乳腺癌患者近6000例，發(fā)病率年增長約3%，遠(yuǎn)高于每年0.5%的世界平均水平，且呈明顯年輕化趨勢[3]。目前，乳腺癌發(fā)病率已居我國女性腫瘤發(fā)病首位，乳腺癌發(fā)病率的上升將會使更多的女性遭受身體和精神上的痛苦，加重家庭和社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。我國已經(jīng)把乳腺癌防治列為腫瘤控制計劃的重點。乳腺癌的發(fā)病呈明顯的家庭聚集現(xiàn)象，在群體中表現(xiàn)出易感個體差異性和種族差異性，提示遺傳因素在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[4]。因此，通過全基因組相關(guān)研究策略，篩選乳腺癌易感基因，識別乳腺癌的高危人群，并能有針對性的開展早期預(yù)防，降低乳腺癌的發(fā)病率和死亡率，是該省、我國乃至全世界當(dāng)前面臨的重要挑戰(zhàn)，也是全球乳腺癌研究的熱點問題。

在GWAS研究技術(shù)問世之前，研究人員已通過家系相關(guān)研究和候選基因途徑等，篩選出某些與乳腺癌易感相關(guān)基因，這些易感基因已經(jīng)或有望應(yīng)用于臨床，作為腫瘤標(biāo)志物，以提高乳腺癌的風(fēng)險預(yù)測及早期診斷的準(zhǔn)確性[5]。但盡管這些基因與乳腺癌高風(fēng)險有關(guān)，但這些突變在人群中非常少，也只能解釋極小部分基于家系的乳腺癌患者的遺傳病因?qū)W，起的作用只占相對較小的比率[6]。近年興起的全基因組相關(guān)研究（GWAS）為篩選復(fù)雜疾病的易感基因提供了有力的技術(shù)支持。特別是高通量SNPs基因分型芯片和多種表達(dá)芯片、甲基化分析芯片等相繼問世和廣泛應(yīng)用；以及可用于完成海量數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析的遺傳統(tǒng)計軟件的研發(fā)和應(yīng)用為人們開展惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展全基因在研究提供技術(shù)支持和較簡單易行手段[7]。GWAS技術(shù)的問世讓我們找到了許多從前未曾發(fā)現(xiàn)的基因以及染色體區(qū)域,為復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制提供了更多的線索，通過GWAS研究篩選乳腺癌易感性單核苷酸多態(tài)性（SNP）成為乳腺癌遺傳病因?qū)W的一個熱點，GWAS研究為包括乳腺癌在內(nèi)的復(fù)雜疾病的易感基因研究提供了重要的生物信息數(shù)據(jù)，確定了大量的乳腺癌低共顯性遺傳易感性位點，表明乳腺癌的遺傳易感性主要可能與常見的低共顯性基因的變異有關(guān)[8]。然而，目前尚不清楚低外顯率等位基因的確切數(shù)目及其影響乳腺癌易感性的機(jī)制。

研究人員在前期北京漢族女性人群的GWAS研究中已獲得了若干個P＜5.0×10-8～-7的乳腺癌易感相關(guān)SNP位點，在該研究中發(fā)現(xiàn)，其中rs6551328與黑龍江地區(qū)漢族女性乳腺癌發(fā)病相關(guān)，其雜合型基因型CT可能是黑龍江地區(qū)漢族女性乳腺癌發(fā)病的風(fēng)險因素。且該基因型可能是導(dǎo)致與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險因素。由于乳腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及細(xì)胞凋亡、增殖失衡、分化紊亂、相關(guān)基因功能失調(diào)，以及信號傳導(dǎo)系統(tǒng)異常等多種復(fù)雜作用，考慮到單一基因的突變對腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用可能相對較小，且乳腺癌發(fā)病呈現(xiàn)地域差異和種族差異性，因此該實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性還有待于更加系統(tǒng)、更大規(guī)模的研究加以驗證。

綜上，該研究中發(fā)現(xiàn)rs6551328多態(tài)性位點與黑龍江地區(qū)漢族女性乳腺癌發(fā)病有關(guān)，其中基因型CT是乳腺癌發(fā)病易感基因型，攜帶有該基因型，其患病后，易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。

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