任高彤，孫佳琦，柴治國，焦 凱，沈麗娟，牛麗娜，陳吉華

(陜西西安，710032:1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)系;2.軍事口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院:*修復(fù)科，＊＊口腔解剖生理學(xué)教研室)

新型抗菌仿生硅化膠原支架的制備

任高彤1，孫佳琦2*，柴治國2*，焦 凱2＊＊，沈麗娟2*，牛麗娜2*，陳吉華2*

(陜西西安，710032:1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)系;2.軍事口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院:*修復(fù)科，＊＊口腔解剖生理學(xué)教研室)

目的:制備抗菌仿生硅化膠原材料。方法:使用濁度分析確定穩(wěn)定的正硅酸礦化液中葡萄糖酸氯己定的最小有效濃度，用氯己定穩(wěn)定的硅酸前體液，對膠原海綿進行仿生硅化處理，并通過傅里葉紅外光譜儀分析及透射電子顯微鏡(TEM)觀察確定硅化效果。結(jié)果:20g/L的葡萄糖酸氯己定可使正硅酸穩(wěn)定3d而不發(fā)生凝膠化，以此為礦化液可使經(jīng)聚丙烯氯化銨處理的膠原支架發(fā)生纖維內(nèi)硅化。TEM觀察結(jié)果顯示，纖維內(nèi)礦物質(zhì)充實了膠原纖維內(nèi)部空隙，傅里葉紅外光譜分析中的C=C伸縮振動峰表明，在仿生硅化膠原引入了葡萄糖酸氯己定，形成抗菌仿生纖維內(nèi)硅化膠原。結(jié)論:以膠原為模板、聚丙烯氯化銨為催化劑、氯己定穩(wěn)定的硅酸前體液為礦化基材，成功制備了新型抗菌仿生硅化膠原支架。

氯己定;抗菌材料;纖維內(nèi)硅化;膠原

焦 凱，E －mail:kjiao1@fmmu.edu.cn

隨著外傷、腫瘤、先天畸形等原因造成的骨組織缺損不斷增加，人們對植骨材料的需求也日益增多，資料顯示，目前全球每年的植骨手術(shù)達到近220萬例，植骨手術(shù)的費用則達到近25億美元［1］。感染性骨缺損及植骨部位術(shù)中、術(shù)后感染的發(fā)生已成為導(dǎo)致植骨失敗的主要原因之一，如在下頜骨缺損的骨移植修復(fù)中，有10%～20%的病例因感染而導(dǎo)致植骨失?。?］。長期以來，研制具有抗菌功能的生物材料替代自體骨修復(fù)骨缺損一直是醫(yī)學(xué)和材料學(xué)領(lǐng)域的重要課題［3］;如何克服植骨部位的感染已成為骨缺損修復(fù)領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點，而人體口腔的多細菌環(huán)境則對頜面部植骨材料的抗菌性能提出了更高要求。氯己定作為一種陽離子表面活性劑，由于其具有廣譜殺菌及抑菌作用、不易產(chǎn)生耐藥性等特點，廣泛用于口腔內(nèi)感染的治療，已成為與植骨材料相復(fù)合，使植骨材料具備抗菌性能的理想選擇。

在本課題組的前期研究中，我們基于聚胺誘導(dǎo)硅酸前體膠原內(nèi)仿生硅化的理念，以膠原為模板、聚丙烯氯化銨為催化劑、氯化膽堿穩(wěn)定的硅酸前體液為礦化基材，制備了纖維內(nèi)硅化膠原［4］。該材料不僅具有良好的生物相容性和機械性能，更具有良好的促進成骨成血管作用［5］，屬于較理想的植骨材料，但這種材料仍不具有抗菌性。

為進一步改善纖維內(nèi)硅化膠原材料的性能，本研究使用氯己定替代氯化膽堿，將抗菌劑氯己定整合入纖維內(nèi)仿生硅化膠原材料內(nèi)部，使抗菌成分緩釋與植骨材料降解同步化，實現(xiàn)纖維內(nèi)仿生硅化膠原材料的抗菌功能化轉(zhuǎn)變，并構(gòu)建有自主抗菌功能的對骨再生、血管形成具有促進作用的抗菌仿生硅化膠原植骨材料，從而為頜面部感染性骨缺損的修復(fù)提供更好的解決途徑。

1 材料和方法

1.1 穩(wěn)定硅酸前體液的制備

室溫下將正硅酸四乙酯(Silbond 40，Silbond公司，美國)、無水乙醇、去離子水及370g/L鹽酸按15∶182.8 ∶2.167 ∶0.008 的質(zhì)量比(摩爾比為1.875 ∶396.79 ∶12.03 ∶0.0218)在磁力攪拌器攪拌情況下混勻1 h，使正硅酸乙酯在酸性條件下水解為正硅酸及其低聚體。將此正硅酸液與0、5、10、20、40、80 g/L 葡 萄 糖 酸 氯 己 定(C22H30Cl2N10 －2C6H12O7，C9394，Sigma－Aldrich，美國)按1∶1的體積比均勻混合后，分別將其pH值調(diào)至5.5，3 000 r/min離心3 min，取上清進行濁度分析。

1.2 濁度分析

上述各溶液于37℃、100%濕度條件下孵育0、0.5、1、3、5、12、24、48、72、96、128 h 后，采用多功能酶標儀(波長405 nm)進行濁度分析(n=8)，溶液吸光度達到穩(wěn)定水平的時間為其凝膠時間。根據(jù)實驗結(jié)果，從中選取能夠使正硅酸液在pH=5.5、37℃條件下穩(wěn)定3d，而不發(fā)生凝膠化的最小葡萄糖酸氯己定濃度(20g/L)為后續(xù)實驗的工作濃度。

1.3 重組I型膠原海綿的仿生硅化

將重組膠原海綿修剪為直徑10mm、厚度2mm的膠原塊，用Milli－Q 水(18.2 mΩ－cm)沖洗3次后置于6.67×10－4mol/L聚丙烯氯化銨(Sigma－Aldrich，美國)液中浸泡4 h。Milli－Q水反復(fù)沖洗后，將經(jīng)聚丙烯氯化銨處理的膠原塊置于1 mL上述制備的硅化液中孵育4d，每天換液1次。

1.4 衰減全反射－傅立葉變換紅外光譜術(shù)

仿生硅化處理4d后用去離子水反復(fù)沖洗仿生硅化膠原支架，無水硫酸鈣中干燥24 h。使用傅立葉變換紅外光譜儀(Thermo Scientific，美國)，并通過衰減全反射變換紅外光譜技術(shù)，分別采集葡萄糖酸氯己定和仿生硅化膠原支架的紅外光譜，以鑒定硅化膠原支架表面官能團。設(shè)定光譜收集范圍為400～4 000 cm－1，掃描次數(shù)為32，分辨率為4 cm－1。

1.5 硅化膠原的透射電鏡(TEM)觀察

分別將仿生硅化處理2、4d的膠原支架用去離子水反復(fù)沖洗后，梯度乙醇(500、700、800、950、1 000 mL/L)脫水，環(huán)氧丙烷及樹脂浸透后，100%樹脂包埋，56℃烤箱烘干24～48 h后形成包埋塊。二次包埋后使用 UM UC6切片機(萊卡，德國)制備70～90 nm厚的電鏡切片，并使用 JEM－1230透射電鏡(JEOL公司，美國)進行觀察。

2 結(jié)果

2.1 凝膠時間

正硅酸與不同濃度的葡萄糖酸氯己定按1∶1的體積比均勻混合后濁度分析結(jié)果如圖1。當氯己定的濃度低于10g/L時，正硅酸均在2d內(nèi)發(fā)生凝膠化，而20、40、80g/L葡萄糖酸氯己定均可使正硅酸穩(wěn)定3d而不發(fā)生凝膠化，故選取20g/L的葡萄糖酸氯己定為后續(xù)實驗的工作濃度。

圖1 葡萄糖酸氯己定濃度對正硅酸的穩(wěn)定性的影響(n=8)

2.2 傅里葉紅外光譜分析

仿生硅化膠原的紅外光譜中，1 650、1 550 cm－1處分別對應(yīng)膠原分子中酰胺Ⅰ的C=O伸縮峰、酰胺Ⅱ的NH彎曲和CN伸縮峰。葡萄糖酸氯己定中1650、1550 cm－1處的NH彎曲峰分別與仿生硅化膠原的紅外光譜中酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ重疊。硅化處理在膠原支架中引入了水合二氧化硅的特征峰:460 cm－1處對應(yīng) Si－O－Si橫向光學(xué)搖擺運動模式(TO1模式);800 cm－1處對應(yīng) Si－O－Si(TO2模式);1 070 cm－1處對應(yīng)非對稱伸縮的Si－O－Si峰(TO3模式);940～960 cm－1對應(yīng)Si－OH振動峰。仿生硅化膠原中1 486cm－1處的峰對應(yīng)于苯環(huán)中的C=C伸縮振動峰，表明在仿生硅化膠原引入了葡萄糖酸氯己定(圖2)。

2.3 TEM 觀察

以10g/L的葡萄糖酸氯己定穩(wěn)定的正硅酸為礦化液，其所制備的硅化膠原TEM觀察結(jié)果如圖3。仿生硅化處理2d，膠原纖維束內(nèi)有部分高電子密度礦物質(zhì)沉積(圖3a)，高倍顯示，礦物質(zhì)沉積使膠原纖維的節(jié)律性橫紋結(jié)構(gòu)清晰可見(白色箭頭所示)(圖3b);仿生硅化處理4d，整個膠原纖維束呈現(xiàn)高電子密度的狀態(tài)(圖3c)，表明有大量礦物質(zhì)沉積，高倍可見膠原橫斷面內(nèi)為礦物質(zhì)充實(白色箭頭所示)(圖3d)。

圖2 葡萄糖酸氯己定及仿生硅化膠原支架的傅里葉紅外光譜圖

圖3 硅化膠原的TEM觀察結(jié)果(白色箭頭示節(jié)律性橫紋結(jié)構(gòu))

3 討論

由于在感染性骨缺損的治療中，全身用藥存在局部藥物濃度低、全身毒副作用大、治療時間長且費用高等缺點，因此，兼具良好成骨活性和局部抗感染能力的新型植骨材料的研發(fā)具有很大的臨床應(yīng)用價值和社會經(jīng)濟效益［6］。在本課題組的前期研究中，以引導(dǎo)組織再礦化的理念為指導(dǎo)、聚胺誘導(dǎo)的液相硅酸納米顆粒為前體，首次實現(xiàn)了三維重組I型膠原纖維內(nèi)的仿生硅化［4］。在以往的研究中，膠原類材料雖然具有良好的生物相容性和成骨活性，但由于較差的機械性能而被認為不宜單獨用于修復(fù)骨缺損［7］。而本課題組合成的纖維內(nèi)仿生硅化膠原，不僅具有膠原類材料良好的生物相容性和生物活性，更由于膠原纖維內(nèi)部仿生硅化而具有良好的機械性能［4－5］。進一步研究表明，加載有細胞歸巢因子SDF－1的纖維內(nèi)仿生硅化膠原具有良好的促進成骨成血管的作用［4］。

本研究在纖維內(nèi)仿生硅化膠原的研究基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性地將引導(dǎo)組織再礦化理念與抗菌功能化修飾相結(jié)合，將抗菌劑氯己定整合入纖維內(nèi)仿生硅化膠原材料內(nèi)部，完成對纖維內(nèi)仿生硅化膠原材料的抗菌功能化修飾，以賦予其良好的抗菌性能。由于20g/L的葡萄糖酸氯己定能夠使正硅酸在pH=5.5、37℃ 條件下穩(wěn)定3d，不發(fā)生凝膠化，使得我們能夠用葡萄糖酸氯己定取代氯化膽堿，達到穩(wěn)定液相硅酸前體的目的，使其有充足的時間滲透入膠原內(nèi)部。隨后我們使用聚丙烯氯化銨聚陽離子對膠原纖維進行預(yù)處理，使其與膠原纖維表面陰性電荷位點結(jié)合，形成富含多聚陽離子的膠原纖維內(nèi)環(huán)境，從而有利于吸引并促進帶負電荷的液相硅酸納米顆粒對膠原纖維粘附、滲透，進而占據(jù)膠原纖維內(nèi)部空隙，在硅化早期可見纖維內(nèi)二氧化硅的沉積使膠原纖維的節(jié)律性橫紋結(jié)構(gòu)清晰(圖3b)。隨著硅化時間的延長，液相硅酸納米顆粒進一步滲透膠原內(nèi)間隙并縮聚為無定形水合二氧化硅，從而充滿纖維內(nèi)間隙(圖3d)。傅里葉紅外光譜分析證實所引入礦物質(zhì)為無定形水合二氧化硅，并且C=C伸縮振動峰的出現(xiàn)表明仿生硅化膠原引入了葡萄糖酸氯己定［4］。

氯己定作為一種陽離子表面活性劑，能夠有效地去除菌斑，在口腔治療中被認為是衡量其他抗菌斑、抗齦炎藥物的金標準［8］，并且通過與軟硬組織的吸附結(jié)合，在局部保持長時間的有效抗菌濃度［8］。其殺菌機制為:氯己定吸附于細胞壁，改變細菌細胞壁表面結(jié)構(gòu)與滲透平衡，使胞漿成分滲漏，高濃度時可使胞漿凝固，抑制細胞壁的修復(fù)。具有廣譜殺菌、抑菌作用的氯己定，其作用方式不易產(chǎn)生耐藥性，且毒理學(xué)安全性評價顯示其無毒性、無刺激性［9］，能夠在感染性骨缺損的修復(fù)中很好地完成抗菌任務(wù)。本課題組的前期研究中，纖維內(nèi)仿生硅化膠原材料能夠緩慢地釋放硅酸。并且加載有SDF－1的纖維內(nèi)仿生硅化膠原，在硅酸緩慢釋放的同時SDF－1也隨之緩慢釋放，且SDF－1的釋放規(guī)律與硅酸相似［5］。而在本實驗所制備的抗菌纖維內(nèi)仿生硅化膠原中，由于氯己定伴隨著液相硅酸前體滲透進入膠原纖維內(nèi)部，因此我們設(shè)想，在活性硅酸從膠原纖維內(nèi)部釋放的同時，氯己定也會隨之緩慢釋放，從而在發(fā)揮抗菌作用的同時，使抗菌成分緩釋與植骨材料降解同步化。未來我們將重點進行該方面的研究。

在引入氯己定構(gòu)建新型抗菌纖維內(nèi)仿生硅化膠原材料后，氯己定的引入是否會對纖維內(nèi)仿生硅化膠原的理化機械性能與對成骨成血管的促進作用造成影響;整合進入膠原纖維內(nèi)部的氯己定是否能發(fā)揮有效的抗菌作用，以及氯己定發(fā)揮抗菌作用的時效性;是否能夠做到抗菌成分氯己定緩釋與植骨材料纖維內(nèi)仿生硅化膠原降解同步化，都有待于本課題組進行進一步深入的研究。

本實驗以膠原為模板、聚丙烯氯化銨為催化劑、氯己定穩(wěn)定的硅酸前體液為礦化基材，制備了纖維內(nèi)硅化膠原支架。這種材料不僅具有良好的生物相容性和機械性能，更具有良好的促進成骨成血管的作用，同時氯己定的引入有可能賦予其良好的抗菌效果，在后期的研究中我們將針對這種新型材料的抗菌性能展開研究。

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Development of a novel antibacterial intrafibrillar－silicified collagen scaffold

RENgao－tong*，SUN Jia－qi，CHAI Zhi－guo，JIAO Kai，SHEN Li－juan，NIU Li－na，CHEN Ji－h(huán)ua
(*Undergraduatedepartment of Oral Science，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi＇an 710032，China)

AIM:Todevelop a novel antibacterial intrafibrillar－silicified collagen scaffold.METHODS:Silicic acid solution was prepared by hydrolyzing tetraethyl orthosilicate.A chlorhexidine stabilized silicic acid was prepared and used as silicifying medium.Gelling time test was used todetermine the minimum concentration ofgluconic acid chlorhexidine that was able to stabilize silicic acid for 72 hours.The reconstituted type I collagen spongedisc was pretreated with 6.67 ×10－4M poly allylamine hydrochloride for 4 h and then placed in the silicifying medium for 4d to produce silicified collagen scaffold.Attenuated total reflection－fourier transform infrared spectroscopy(ATR－FTIR)and transmission electron microscopy(TEM)were used to characterize the antibacterial intrafibrillar－silicified collagen scaffold.RESULTS:2.0%gluconic acid chlorhexidine could stabilize the silicic acid for 3d withoutgelation and was used as silicifying medium.With this method，silicic acid could infiltrate into the inside space of the type I collagen and then condense into orderlydeposited silicondioxideinside collagen fibrils，resulting in intrafibrillar－silicified collagen scaffolddoped with chlorhexidine.FTIR confirmed the incorporation of silica and chlorhexidine in the scaffold.CONCLUSION:A novel antibacterial intrafibrillar－silicified collagen scaffold isdeveloped with reconstituted type I collagen sponge pretreated by poly allylamine hydrochloride and silicic acid stabilized bygluconic acid chlorhexidine.

chlorhexidine;antibacterial materials;intrafibrillar－silicified;collagen

牛麗娜，E－mail:niulina831013@126.com

R783.1

A

1005－2593(2015)06－0363－04

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.06.007

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2015，25(6):363］

2015－01－25;

2015－04－01

國家自然科學(xué)基金(81130078，81400555)

軍隊青年培育項目(13QNP138)

教育部創(chuàng)新團隊(IRT13051)

任高彤(1990－)，男，漢族，河南輝縣人。本科生(導(dǎo)師:焦凱)

·治療與應(yīng)用·