陳小蓉, 阮志勇, 王彥偉, 王慧敏, 郭 翔, 孔德龍, 邵承斌

1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院, 重慶 400060;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所, 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081;3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610041

隨著全球石油使用量的快速增加、長(zhǎng)期不科學(xué)使用以及運(yùn)輸開(kāi)采過(guò)程中泄漏等問(wèn)題，一些高毒、高殘留、難降解、致癌、致畸等烴類物質(zhì)進(jìn)入土壤和地下水，對(duì)環(huán)境造成污染并嚴(yán)重危害人類健康[1]。烷烴作為石油的主要成分，在石油中的含量高達(dá)50%～95%[2]，同時(shí)也是石油污染物中的主要成分[3]。如何有效的減少或消除石油烴污染，已成為人們廣泛關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。目前治理石油污染的方法主要包括物理修復(fù)法、化學(xué)修復(fù)法和生物修復(fù)法，其中生物修復(fù)法相比于其他兩種修復(fù)方法，具有高效、無(wú)二次污染、易操作和成本低等優(yōu)點(diǎn)，已成為石油污染修復(fù)的重要方法[4]。

如何快速高效降解烷烴是石油污染修復(fù)的關(guān)鍵技術(shù)，分離烷烴降解微生物并了解降解菌的生理生化特征及分類進(jìn)化地位是實(shí)現(xiàn)生物修復(fù)石油污染環(huán)境的重要基礎(chǔ)。目前，已經(jīng)分離報(bào)道的烷烴降解菌有黃桿菌(Flacobacterium)[5]、戈登氏菌(Gordonia)[6]、假單孢菌(Pseudominas)、海桿菌(Marinobacte)[7]和迪茨氏菌(Dietzia)[8]等。

由于已公開(kāi)報(bào)道的大多烷烴降解菌株可降解的烷烴濃度都較低，在實(shí)際應(yīng)用中易受到限制，因此考慮高烷烴濃度污染下的生物修復(fù)。本研究開(kāi)展了從烴類污染土壤中富集高效烷烴降解菌的工作，以篩選出高烷烴濃度耐受性的菌株為目的，分離篩選到一株高耐受性烷烴降解菌LAM0048，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)、細(xì)胞化學(xué)組分分析和16S rRNA基因序列分析，初步確定其為戈登氏屬(Gordonia)的一個(gè)種，將其定名為Gordoniasp. LAM0048，并對(duì)其烷烴降解能力進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

所有試劑除特殊說(shuō)明外均為市售分析純或色譜純。

富集培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(nutrient broth，NB，BD/Difco 234000，美國(guó))。添加瓊脂15～20 g/L制成斜面或平板(NA)；無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO40.50 g,Na2HPO4·12H2O 1.00 g,NH4Cl 1.10 g,MgSO4·7H2O 0.20 g, 微量元素液2 mL, 酵母提取物0.03 g,蒸餾水1 L，pH 7.3；微量元素液：EDTA 0.500 0 g,ZnSO4·7H2O 0.220 0 g, CaCl20.050 0 g, MnCl2·4H2O 0.051 0 g, FeSO4·7H2O 0.019 9 g,(NH4)6Mo2O24·4H2O 0.011 0 g, CuSO4·5H2O 0.015 7 g, CoCl2·6H2O 0.016 1 g, 蒸餾水 1 L，pH 6.0；脂肪酸分析培養(yǎng)基為T(mén)SA培養(yǎng)基(BD/Difco 236950,美國(guó))。

1.2 烷烴降解菌株的分離

利用富集培養(yǎng)的方法篩選烷烴降解菌，所用土樣采自長(zhǎng)期受烷烴及多環(huán)芳烴污染環(huán)境中的下層土壤。

取1.0 g土樣加入已滅菌的50 mL富集培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)。富集培養(yǎng)24 h后，取2 mL富集液接種至50 mL濃度為2 g/L的正十六烷無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3 d，重復(fù)3次。采用連續(xù)梯度稀釋法進(jìn)行分離，取100 μL培養(yǎng)液均勻涂布于含200 mg/L正十六烷的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫倒置培養(yǎng)3 d。根據(jù)菌落生長(zhǎng)時(shí)間、形態(tài)及顏色的不同進(jìn)行分離純化。挑取單菌落接種于含200 mg/L正十六烷的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)，以未接種的培養(yǎng)基作為對(duì)照，期間觀察菌株生長(zhǎng)和正十六烷烴狀態(tài)變化情況。3 d后獲得6株生長(zhǎng)迅速、正十六烷烴明顯變化的菌株。將分離得到的6株菌株經(jīng)多次純化后，15%甘油中-80℃低溫保藏。將篩選出的正十六烷烴狀態(tài)變化最明顯的菌株編號(hào)為L(zhǎng)AM0048，并將其保存至中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(保藏編號(hào)為ACCC 19754)。

1.3 菌株LAM0048的鑒定

對(duì)菌株LAM0048進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)、細(xì)胞化學(xué)組分分析以及16S rRNA基因序列分析，確定其分類地位；菌株的形態(tài)及生理生化特性參考Ruan等[9]的方法進(jìn)行。

菌株的DNA提取與純化參照Marmur等[10]的方法進(jìn)行。以提取的基因組DNA為模板，采用16S rRNA基因的通用引物27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R: 5′-ACGGHTAC-CTTGTTTACGACTT-3′對(duì)其進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒 (天根公司) 回收后，酶連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，挑選陽(yáng)性克隆子，由上海英駿公司測(cè)序。16S rRNA測(cè)序結(jié)果在EzTaxon-e Serveice中對(duì)比[11]，尋找具有較高同源性的16S rRNA基因序列；比對(duì)結(jié)果采用MEGA6[12]軟件包進(jìn)行多序列對(duì)比分析，采用鄰近法(Neighbor-joining)構(gòu)建基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

將菌株LAM0048接種到TSA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)18 h，收集新鮮的菌體后，根據(jù)MIDI系統(tǒng)操作手冊(cè)提取脂肪酸，采用含MIS Library Generation Software的高效氣相色譜儀檢測(cè)其脂肪酸組成[9]。

將菌株LAM0048在NB培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)18 h，離心收集菌體并用生理鹽水沖洗2次，按照Xu等[13]的方法進(jìn)行極性脂的提取與分析。

1.4 菌株LAM0048降解正十六烷烴能力的測(cè)定

將菌株在NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600=0.6)，離心菌體并用無(wú)菌水沖洗，最后按1%(V/V)的接種量，分別接種至含0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.8%和1.0%(V/V)正十六烷的50 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃，160 r/min培養(yǎng)，設(shè)置3組平行，以不加菌的含烷烴培養(yǎng)基為空白對(duì)照，36 h后利用氣相色譜(GC)檢測(cè)正十六烷殘留量，計(jì)算菌株對(duì)正十六烷的降解率。

1.5 正十六烷殘留量的測(cè)定與分析方法

烷烴降解率的測(cè)定方法參照陸健等[14]的方法進(jìn)行，具體操作步驟：在50 mL烷烴培養(yǎng)液中加入15 mL色譜純正己烷，輕輕振蕩以溶解表層烷烴相。將此混合液倒入250 mL分液漏斗中劇烈振蕩，靜置分層，吸取上清液至50 mL容量瓶中，在殘液中加入15 mL正己烷按以上步驟重復(fù)萃取2次，合并萃取液并用正己烷定容至50 mL。將此萃取液過(guò)0.22 μm濾膜除雜，取1 μL進(jìn)行GC測(cè)定。色譜柱為DN-5MS石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm)，色譜條件：80℃保持5 min，以5 ℃/min升至140℃保持1 min，以5 ℃/min升至280℃。進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別為260℃和280℃。

1.6 正十六烷降解率的計(jì)算方法

在測(cè)定的正十六烷殘留量色譜圖中，計(jì)算殘留正十六烷的峰面積與空白對(duì)照中正十六烷的峰面積的比值，以百分之百減去峰面積比值，即得降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株LAM0048的初步鑒定

菌株LAM0048在NA平板上菌落呈橘紅色、不透明、邊緣光滑、表面微粗糙。菌體形態(tài)如圖1(彩圖見(jiàn)封三圖版)所示，為短桿狀，大小為1.0～1.5 μm，革蘭氏陽(yáng)性菌。生長(zhǎng)溫度為15～48℃，pH范圍：5～9，耐受NaCl濃度為7% (W/V)，能利用吐溫-40、吐溫-80、麥芽三糖、鼠李糖、核糖、蔗糖、丙酮酸甲酯、丙酮酸和甘油。

圖1 菌株LAM0048的菌體形態(tài)Fig.1 Morphology of strain LAM0048.(彩圖見(jiàn)封三圖版)

通過(guò)PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1 433 bp的16S rRNA基因序列片段。將測(cè)得的16S rRNA序列在NCBI上進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示菌株LAM0048與棒桿菌亞目(Corynebacterineae)、諾卡菌科(Nocardiaceae) 的GordoniaterraeNBRC 10016T、GordonialacunaeDSM 45085T、GordonianamibiensisNBRC 108829T和GordoniabronchialisDSM 43247T的進(jìn)化關(guān)系接近，16S rRNA序列相似性分別為99.03%、98.73%、97.28%和97.21%。圖2為菌株LAM0048及相關(guān)菌株的16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，可以看出，菌株LAM0048與GordonialacunaeDSM 45085T處于同一亞支且與GordoniaterraeNBRC 100016T處于同一大支，穩(wěn)定性較高。結(jié)合16S rRNA序列比對(duì)結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析，將其歸為戈登氏屬(Gordonia)，并命名為Gordoniasp. LAM0048。

菌株LAM0048的主要脂肪酸為C16∶0、C18∶1、TSBA(10-methyl C18∶0)和Summed feature 3(C16∶1ω7c/C16∶1ω6c)，詳細(xì)脂肪酸含量見(jiàn)表1。同G.terreaNBRC 100016T相比，菌株LAM0048脂肪酸組成和含量的差異性較為明顯，主要體現(xiàn)在脂肪酸C16∶1cis9與Summed feature 3上，具體差異見(jiàn)表1。

菌株LAM0048的主要極性脂如圖3所示，主要為雙磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol，DPG)、磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)、兩種磷脂酰肌醇甘露糖苷(phosphatidylinositol mannoside，PIM)和四種糖脂(glycolipids，GL)。與菌株GordoniaterraeNBRC 100016T相比，其主要極性脂組成一致，而次要組成上存在較明顯差異，具體結(jié)果如表2所示。

圖2 利用NJ法構(gòu)建的基于16S rRNA的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain.

脂肪酸LAM0048G.terrea[15]C14∶02.52C16∶1cis9ND17C16∶034.133C18∶124.434C18∶02.51TBSA19.512Summedfeature313.4ND

注：Summed feature 3為C16∶1ω7c/C16∶1ω6c；ND：未檢測(cè)到。

圖3 菌株LAM0048的極性脂F(xiàn)ig.3 Total polar lipids of strain LAM0048.

表2 菌株LAM0048與相似菌株G. terrea的極性脂比較Table 2 Polar lipid comparation of strain LAM0048 and G. terrea NBRC 100016T.

通過(guò)菌株LAM0048的形態(tài)學(xué)特征、生理生化指標(biāo)以及16S rRNA基因序列的對(duì)比結(jié)果，表明該菌株屬于戈登氏屬(Gordonia)，但是該菌株與其系統(tǒng)進(jìn)化最接近的菌株相比，在底物利用、脂肪酸組成與含量以及極性脂的組成等方面存在較為明顯的差異，推測(cè)其可能為戈登氏屬的一個(gè)新種，其確定的分類地位還需要通過(guò)DNA-DNA雜交或者基因組學(xué)分析進(jìn)一步明確。

2.3 菌株LAM0048的烷烴降解特性

在30℃，培養(yǎng)36 h時(shí)，菌株LAM0048對(duì)不同濃度正十六烷(C16)的降解率如圖4所示，當(dāng)C16濃度為0.05%時(shí)，其降解率為100%，而隨C16濃度的增加，菌株對(duì)烷烴的降解率有所降低，但濃度升高至1.0%(V/V)時(shí)，降解率仍然能夠達(dá)到46.4%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株LAM0048對(duì)正十六烷(C16)具有良好的降解能力，且能耐受高濃度的烷烴，是一株具有良好應(yīng)用前景的高效烷烴降解菌。

圖4 菌株LAM0048在不同C16濃度下的降解率變化Fig.4 Degradation change of n-hexadecane with different concentrations by strain LAM0048.

3 討論

本研究以正十六烷為唯一碳源，從土樣中分離到一株高效烷烴降解菌LAM0048。經(jīng)過(guò)形態(tài)特征觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rRNA基因序列比對(duì)分析，將其劃分到戈登氏屬(Gordonia)。細(xì)胞脂肪酸和極性脂的比對(duì)分析結(jié)果表明，菌株LAM0048可能為該屬的一個(gè)新種。

在烷烴利用實(shí)驗(yàn)中，菌株LAM0048表現(xiàn)出良好的烷烴降解能力，36 h內(nèi)能夠完全降解0.05%(V/V)的C16，且對(duì)烷烴的耐受濃度較高，在含1.0% (V/V) C16的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，36 h時(shí)的降解率仍高達(dá)46.4%，對(duì)烷烴降解效果明顯。

近年來(lái)已經(jīng)公開(kāi)報(bào)道的烴類降解微生物較多，雖然其中大多數(shù)菌株的降解效果較為理想，如Wang 等[8]報(bào)道的烷烴降解菌株DietziaDQ12-45-1b 在含0.3%(V/V)C16的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)21 d 時(shí)，能降解81.17 mg正十六烷。張楠[16]報(bào)道的烷烴降解菌Pseudomonasaeruginosa在培養(yǎng)6 d時(shí)，對(duì)0.26%(V/V)的C16降解率為97.3%。吳佩春等[17]報(bào)道的石油降解菌Streptomycesexfoliatus，14 d時(shí)對(duì)原油[0.03%(V/V)]的降解為83%，但其菌株對(duì)正十六烷烴類濃度都有一定要求，一般濃度都在0.39%(V/V)以下。而本研究所分離的烷烴降解菌株LAM0048對(duì)正十六烷烴濃度耐受性較高，能夠在高濃度[1.0%(V/V)]下高效率降解烷烴。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)石油污染的環(huán)境修復(fù)具有十分重要的意義，為高濃度污染源的修復(fù)提供了理論基礎(chǔ)，豐富了石油污染修復(fù)的菌種資源。

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