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狂犬病口服疫苗研究進(jìn)展

路明華，劉延亭，侯艷紅

（北京中聯(lián)康生物科技有限公司北京100085）

狂犬病是一種重要人畜共患病。防制狂犬病的最佳方法是疫苗免疫，而口服是免疫的最佳途徑。現(xiàn)口服疫苗的研制取得了許多成果，本文就狂犬病口服狂犬疫苗的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

狂犬?。豢诜?；疫苗

狂犬病（Rabies）是有狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的一種危害人類健康的最古老的疾病[1]。狂犬病流行廣，病毒可感染幾乎所有溫血?jiǎng)游铮且环N危害嚴(yán)重的人獸共患病。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)道，每年至少有50萬(wàn)人進(jìn)行暴露后疫苗免疫，每年世界范圍內(nèi)病毒感染導(dǎo)致全球有大約5.5萬(wàn)人死于狂犬病，其中大部分發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[2]。該病死亡率100%，目前尚未能有效控制?？袢∈且环N可以用疫苗進(jìn)行預(yù)防的疾病，犬是本病主要傳染源，在拉美通過(guò)免疫犬使得人和犬狂犬病感染率得到了顯著下降，因此通過(guò)對(duì)犬進(jìn)行免疫的方法可以更好的控制狂犬病[3-4]。調(diào)查表明，我國(guó)犬免疫率不足，無(wú)法形成免疫屏障，口服疫苗的方式不同于傳統(tǒng)注射的免疫方式，更為方便，便于擴(kuò)大免疫覆蓋率，是簡(jiǎn)便有效的方式。本文就狂犬病口服疫苗的研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 狂犬病病毒疫苗毒株的研究現(xiàn)狀

1962年美國(guó)科學(xué)家首次將狂犬病弱毒疫苗通過(guò)胃管導(dǎo)入狐貍的胃中，沒(méi)有免疫成功[5]，美國(guó)CDC于1970年狂犬病弱毒疫苗對(duì)狐貍進(jìn)行口服免疫試驗(yàn)，并比較了CVS、LEP、HEP、ERA株的免疫效果，試驗(yàn)一年后在實(shí)驗(yàn)室獲得成功，結(jié)果表明ERA株具有最好的口服免疫原性，為以后口服疫苗的開發(fā)打下了基礎(chǔ)。

ERA株源于SAD株，SAD株經(jīng)瑞士科學(xué)家在BHK-21細(xì)胞上適應(yīng)后變?yōu)?SAD Bern株和SADswiss株；德國(guó)科學(xué)家通過(guò)BHK21細(xì)胞克隆研制出SAD突變株SAD B19。然而，SADBern株和SAD B19株對(duì)成年野生嚙齒動(dòng)物、犬和部分野生動(dòng)物有一定毒力，所以科學(xué)家又用單克隆抗體對(duì)SAD株進(jìn)行克隆，選育出SAG1株，該毒株為雙缺失株，即病毒糖蛋白的第Ⅲ位點(diǎn)和第Ⅱ位點(diǎn)發(fā)生突變，失去了對(duì)幼犬及六種成年嚙齒類動(dòng)物的毒力[6]。

SAG2株是由SADBern株選育而來(lái)的。SAD B19、SAD Bern和SAG2是目前歐洲用作口服疫苗的毒株。而在美國(guó)和加拿大則主要是使用重組牛痘病毒和重組人腺病毒表達(dá)的狂犬病毒ERA株糖蛋白，即V-RG和ONRAB[7-10]。

另外還有CTN-1株，CTN-1株是中國(guó)科學(xué)家用狂犬病街毒經(jīng)鼠腦傳代后成為固定毒，又經(jīng)二倍體細(xì)胞傳代得到的二倍體適應(yīng)株CTN-1株，用該株制備口服疫苗一次免疫可提高長(zhǎng)達(dá)15個(gè)月的保護(hù)力[11]。

2 狂犬病口服疫苗的研究現(xiàn)狀

在得到合適的毒株后，人們開始尋找簡(jiǎn)單方便的免疫方式，口服無(wú)疑是最佳的選擇。于是學(xué)者們不斷嘗試研制狂犬病口服疫苗，到目前為止取得了許多的成果。

鄭海發(fā)等[12]將CTN-1株經(jīng)Vero細(xì)胞傳15代后給犬口服，30 d陽(yáng)轉(zhuǎn)率為100%，又用10倍劑量給犬口服，取犬腦和唾液在BHK21細(xì)胞盲傳2代，同時(shí)小鼠腦內(nèi)盲傳，進(jìn)行病毒分離，均為陰性，結(jié)果表明該口服疫苗具有較好的安全性和口服免疫原性。

另外，為了延長(zhǎng)疫苗對(duì)動(dòng)物機(jī)體的刺激時(shí)間，緩釋材料也被嘗試用在疫苗的研制過(guò)程中。孫加燕[13]以狂犬病病毒雞胚低代毒（Flury-lep）為模型，海藻酸鈉為緩釋材料制備緩釋微丸，研制Flury株的口服疫苗，并進(jìn)行了口服疫苗的安全性、有效性和無(wú)菌性研究。結(jié)果表明該狂犬病口服疫苗，收到了良好的免疫效果，這就為動(dòng)物口服疫苗的研究提供了一個(gè)新的研究方向。

狂犬病病毒為人獸共患病病毒，不僅要考慮免疫動(dòng)物的安全性還要考慮對(duì)人和環(huán)境的安全性，因此狂犬病病毒弱毒則成為活疫苗的最佳選擇。Darkaoui S等[14]利用SAG2株制備了口服疫苗，根據(jù)WHO推薦的方法分別對(duì)農(nóng)村犬、流浪犬和野生犬進(jìn)行了口服疫苗的免疫，結(jié)果顯示三種方式分別有77%、46.7%和73%的誘餌被采食。這表明誘餌對(duì)犬有良好的適口性，口服疫苗的方式是可行的。

眾所周知，疫苗的保護(hù)率是評(píng)價(jià)一個(gè)疫苗的重要指標(biāo)，所以在提高保護(hù)率方面學(xué)者們也做了很大努力。Yang DK等[15]通過(guò)反向遺傳系統(tǒng)構(gòu)建了一株重組病毒（ERAG3G株），通過(guò)口服免疫小鼠研究其效果，并通過(guò)肌肉注射免疫貓來(lái)觀察其安全性。結(jié)果全部小鼠均產(chǎn)生對(duì)狂犬病毒重組病毒的保護(hù)力，貓免疫后28 d中和抗體效價(jià)高達(dá)2.62～23.9 IU/mL，為口服重組疫苗的研制提供了參考。說(shuō)明構(gòu)建的重組病毒可以為動(dòng)物提供較好的保護(hù)。

要達(dá)到免疫的作用，主要是要機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)該病毒的中和抗體，而中和抗體的產(chǎn)生并非一定要全病毒的存在，只要能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的抗原存在即可，因此可以利用分子生物學(xué)的手段得到這些抗原，從而避免使用全病毒，這樣安全性便可得到保障。現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展為疫苗的研制提供了強(qiáng)有力的工具，使得人們可以按照意愿在病毒基因水平進(jìn)行改造，從而在狂犬病疫苗的研發(fā)中起到了重大的作用。Rupprecht CE等[16]試驗(yàn)了重組狂犬病毒經(jīng)口服免疫犬后的安全性、免疫原性和效果，并與商品化的以牛痘病毒為載體表達(dá)狂犬病毒糖蛋白的重組疫苗效果進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果表明，首免后1-2周多數(shù)動(dòng)物都產(chǎn)生了狂犬病毒中和抗體，之后用街毒進(jìn)行攻毒，對(duì)照組全部發(fā)病，免疫組均未發(fā)病，疫苗對(duì)照組有一只發(fā)病，顯示出該疫苗良好的安全性和效果。Zhang S等[17]制備了以犬腺病毒2型為載體表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的重組病毒疫苗的誘餌，并在犬進(jìn)行試驗(yàn)。用該重組疫苗滴鼻免疫46只犬，口服免疫90只犬。結(jié)果表明87.5%的免疫犬產(chǎn)生中和抗體，免疫后2～3周可以檢測(cè)到免疫反應(yīng)，5～6周達(dá)到高峰90.8%的犬中和抗體持續(xù)超過(guò)24個(gè)月，抗體滴度維持在0.5 IU/mL以上。免疫后2年用60 000只小鼠半數(shù)致死量的CVS-24進(jìn)行10只犬的攻毒試驗(yàn)，犬均存活，顯示出重組疫苗口服良好的效果。

由以上可以看出目前口服疫苗的研究多為病毒活載體疫苗及基于反向遺傳技術(shù)的弱毒活疫苗，而郭恒[18]則利用減毒沙門氏菌為運(yùn)載體，構(gòu)建了口服狂犬病疫苗。該研究為狂犬口服疫苗的研制提供了一種成本更加低廉的備選方案。

雖然國(guó)內(nèi)目前在狂犬病口服疫苗方面做了很多的研究，但是尚未有產(chǎn)品上市銷售，國(guó)際上也僅有兩種產(chǎn)品，分別為ONRAB?和V-RG?。Mainguy J等[19]比較了ONRAB?和V-RG?兩種口服疫苗的野外投撒效果，抗體產(chǎn)生率結(jié)果數(shù)據(jù)顯示ONRAB?疫苗比V-RG?具有更好的免疫效果。

研制出的口服疫苗需要通過(guò)上市銷售來(lái)被使用，企業(yè)也需要盈利，這樣制作口服疫苗的成本也必須成為考慮因素之一，因此尋找更為廉價(jià)的生產(chǎn)方式是必然要求，特別對(duì)于發(fā)展中國(guó)家，這種疫苗更有推廣價(jià)值。植物為重組蛋白大規(guī)模生產(chǎn)提供了新的廉價(jià)系統(tǒng)，增加了生產(chǎn)進(jìn)程。在植物組織中表達(dá)的狂犬抗原在肌內(nèi)和口服免疫后的小鼠身上具有免疫原性和保護(hù)性。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物是表達(dá)外源抗原更為有效的方法之一，為了生產(chǎn)植物源性的狂犬抗原，用煙草的病原相關(guān)蛋白基因替代狂犬糖蛋白基因中的信號(hào)肽。無(wú)論是口服還是肌內(nèi)注射在小鼠身上植物源性抗原都可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的黏膜和體液免疫反應(yīng)[20]。雖然植物源性的抗原具有很多優(yōu)點(diǎn)，但是在植物源性的狂犬疫苗應(yīng)用到家畜之前還有一些問(wèn)題需要解決，其中最重要的就是需要提高在未成熟轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，并且減少不同系和后代中蛋白表達(dá)水平的主體性變異。另外，還有必要縮短從不同植物中獲取蛋白的時(shí)間。另外，狂犬病病毒糖蛋白目前在可食性植物中的表達(dá)水平還相當(dāng)?shù)?，如果表達(dá)水平方面的技術(shù)難題一旦攻破，將為生產(chǎn)安全廉價(jià)有效的新型狂犬病口服疫苗提供空前繁榮的前景。

3 展望

犬是狂犬病的主要宿主，動(dòng)物狂犬病是人狂犬病的根源,已經(jīng)造成了人類死亡病例的將近99%。消滅動(dòng)物狂犬病關(guān)鍵要加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物的免疫接種，雖然我國(guó)狂犬病疫苗經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，已經(jīng)研制成功安全有效且純化濃縮的組織細(xì)胞狂犬病疫苗，疫苗質(zhì)量已接近或達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，但其中還存在接種價(jià)格昂貴，接種不方便的原因。另外近幾年來(lái)高新技術(shù)在狂犬病疫苗研究廣泛應(yīng)用，以生物反應(yīng)器培養(yǎng)狂犬病病毒，制備狂犬病的口服疫苗，不僅成本更為低廉，在接種方式上也更為方便，便于大規(guī)模的使用，無(wú)論是寵物、農(nóng)村犬還是流浪犬和野生犬，都可以用口服疫苗進(jìn)行免疫，這樣在動(dòng)物會(huì)形成更高的免疫覆蓋率，形成免疫屏障，使得狂犬病的發(fā)病率和病毒的攜帶率極大降低，為動(dòng)物和人類的生命健康做出重要貢獻(xiàn)。

在狂犬病口服疫苗的研制方面，筆者認(rèn)為除了疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生高效抗體外，還需要對(duì)疫苗保存進(jìn)行研究?？诜呙绲膽?yīng)用不僅限于寵物犬和農(nóng)村犬，對(duì)于流浪犬和野生犬也同樣適用，這樣疫苗投撒到外部環(huán)境后必須在一定的時(shí)間、溫度和濕度內(nèi)保持疫苗的免疫效力，否則動(dòng)物采食后也起不到免疫的效果。因此在疫苗的保護(hù)劑方面還需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

緩釋技術(shù)對(duì)疫苗的免疫效果同樣具有重要的影響，延長(zhǎng)免疫原在動(dòng)物體內(nèi)的存留時(shí)間便可延長(zhǎng)疫苗對(duì)動(dòng)物的保護(hù)期，因此提高緩釋材料對(duì)病毒的包埋率，以及減小包埋后對(duì)抗原活性的影響是研究重點(diǎn)。

口服的方式是最為方便直接的免疫方式，狂犬病口服疫苗無(wú)疑將會(huì)成為未來(lái)狂犬病疫苗研發(fā)的方向?！觯ň庉嫞旱一郏?/p>

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Progress on Oral Rabies Virus Vaccine

Lu Minghua,Liu Yanting,Hou Yanhong(United Health Co.,Ltd Beijing,100085)

Rabies is a major zoonosis.vaccination is the best way to prevent it,and the best immunity route is oral.As so far,there is a lot of achievements were acquired,so this article reviewed the progress of oral rabies vaccine.

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