汪艷麗，劉如秀，劉宇，李泱，劉金鳳

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強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清對(duì)乳鼠受損竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位的影響

汪艷麗，劉如秀，劉宇，李泱，劉金鳳

目的研究強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清對(duì)乳鼠受損竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位的影響。方法分離培養(yǎng)Wistar乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞，分為6組：正常組、模型組、100 μl含藥血清組、200 μl含藥血清組、300 μl含藥血清組、空白血清組。除正常組外，其余各組均模擬缺血-再灌注制備細(xì)胞損傷模型。采用膜片鉗技術(shù)在電流鉗模式下記錄各組細(xì)胞自發(fā)性動(dòng)作電位，測量各組細(xì)胞復(fù)極至20%、50%、90%動(dòng)作電位時(shí)程（APD20、APD50、APD90）、最大舒張電位（MDP）及動(dòng)作電位幅值（APA）。結(jié)果于造模后細(xì)胞外液分別加入100 μl、200 μl、300 μl強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清，與模型組比較，100 μl含藥血清組、200 μl含藥血清組、300 μl含藥血清組APD20縮短，分別為[（77.2±5.5）ms vs. （35.7 ± 7.1）ms]、[（77.2±5.5）ms vs. （50.1±7.5）ms]、[（77.2±5.5）ms vs. （39.7±4.3）ms]，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）；APD50縮短，分別為[（147.5±5.1）ms vs. （90.6±5.8）ms]、[（147.5±5.1）ms vs. （111.0± 4.1）ms]、[（147.5±5.1）ms vs. （109.0±2.4）ms]，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。與正常組比較，經(jīng)缺血-再灌注造模后（模型組）細(xì)胞的MDP上升，APA減小，為[（-61.9±5.4）mV vs. （-54.5±4.6）mV]，[（84.7±5.0）mV vs. （71.4±4.7）mV]，差異均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。于造模后細(xì)胞外液分別加入100 μl、200 μl、300 μl強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清，與模型組比較，各組MDP值無明顯改變，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。100 μl含藥血清組和300 μl含藥血清組APA均較模型組增大，分別為[（83.2 ±5.9）mV vs. （71.4±4.7）mV]和[（82.2±6.4）mV vs. （71.4±4.7）mV]，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。結(jié)論強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清能縮短乳鼠受損竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位的APD20、APD50，增大APA，縮短動(dòng)作電位時(shí)程，進(jìn)而加快細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng)頻率。

強(qiáng)心復(fù)脈方；含藥血清；竇房結(jié)細(xì)胞；膜片鉗；動(dòng)作電位；乳鼠

竇房結(jié)細(xì)胞（sino-atrial node cells，SNC）具有自律性，與心房肌細(xì)胞相比，SNC不需要外來的刺激而自發(fā)的、有節(jié)律的產(chǎn)生自動(dòng)去極化，引發(fā)新一輪動(dòng)作電位（AP）。SNC動(dòng)作電位時(shí)程（APD）決定著SNC搏動(dòng)頻率，SNC受損時(shí)，APD延長，心率減慢，從而引發(fā)緩慢性心律失常。本研究則利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，記錄正常及模擬缺血-再灌注（I-R）后乳鼠SNC的AP，并觀察中藥復(fù)方（強(qiáng)心復(fù)脈方）含藥血清對(duì)乳鼠受損細(xì)胞AP相關(guān)參數(shù)的影響，從細(xì)胞電生理水平闡明強(qiáng)心復(fù)脈方保護(hù)受損SNC的機(jī)制。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑和儀器DMEM液體培養(yǎng)基（北京邁晨科技公司）；PBS緩沖液（北京邁晨科技公司）；胎牛血清（GIBCO，美國）；胰蛋白酶1:250（Sigma，美國）；HEPES（Sigma，美國）；L-乳酸鈉（Alfa，美國）；95% N2-5% CO2混合氣體（北京北普飛龍氣體有限公司）、多非利特（Dofetilide）、氯化鎘（CdCl2）、河豚毒（TTX）等。強(qiáng)心復(fù)脈方浸膏（湖南九鼎制藥廠提供，批號(hào)20091210）。倒置相差顯微鏡（日本）、二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）、超凈工作臺(tái)（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠）、醫(yī)用離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械）、膜片鉗放大器（美國Axon公司）、AID-DIA轉(zhuǎn)換器（美國Axon公司）、pCLAMP 9.0 軟件（美國）、平衡防震臺(tái)（美國Newport公司）、玻璃微電極（北京正天易科貿(mào)有限公司），另有自制細(xì)胞缺氧培養(yǎng)裝置等。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年雄性Wistar大鼠20只，SPF級(jí)，體重300～350g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（軍）2007－004。出生24 h內(nèi)Wistar乳鼠200只，清潔級(jí)，雌雄不拘，由斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2011－0004。

1.2 主要溶液的配制①模擬缺血溶液（mmol/ L）：NaCl 98.5，KCl 10，NaH2PO4 0.9，NaHCO36，CaCl21.8，MgSO41.2，乳酸鈉 40，HEPES 20。②模擬再灌注溶液（mmol/L）：NaCl 129.5，KCl 5，NaH2PO40.9，NaHCO320，CaCl21.8，MgSO41.2，Glucose 55，HEPES 20。③記錄動(dòng)作電位（AP）的細(xì)胞外液（mmol/L）：NaCl 140，KCl 5.4， CaCl21.8， MgCl20.5，NaH2PO4 0.33，Glucose 5.5，HEPES 5.0。④記錄動(dòng)作電位（AP）的電極內(nèi)液（mmol/L）：K-Aspartate 120，KCl 20，MgCl25，Na2ATP 5，HEPES 10。

1.3 方法

1.3.1 乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及分組參照Marvin[1]及課題組前期實(shí)驗(yàn)方法[2,3]，采用“酶解+差速貼壁”法分離培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞，經(jīng)形態(tài)學(xué)及電生理學(xué)鑒定后，將分離的細(xì)胞吹打均勻后分裝小培養(yǎng)皿，分為六組：正常組、模型組、100 μl（強(qiáng)心復(fù)脈方）含藥血清組、200 μl（強(qiáng)心復(fù)脈方）含藥血清組、300 μl（強(qiáng)心復(fù)脈方）含藥血清組、空白血清組。除正常組外，其余各組均模擬缺血-再灌注制備細(xì)胞損傷模型[2,4]。

1.3.2 空白血清及強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清的制備成年雄性Wistar大鼠20只，分成2組，空白血清組和強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清組，每組10只。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后灌胃，連續(xù)7 d，每日2次，強(qiáng)心復(fù)脈方給藥劑量采用國際標(biāo)準(zhǔn)[5]，按鼠（以200 g大鼠體表面積為準(zhǔn)）與人（以70 kg成人體表面積為準(zhǔn)）體表面積折合換算，得到等效劑量后，再擴(kuò)大10倍，為13 g強(qiáng)心復(fù)脈方浸膏/kg體重（相當(dāng)于88.01 g強(qiáng)心復(fù)脈方生藥/kg體重），用蒸餾水配制成混懸液?？瞻籽褰M給予等量蒸餾水。末次給藥后2 h腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h，2500 r/min離心25 min分離血清，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝備用。

1.3.3 乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位的測定參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)[6-8]。選取胞膜完整、邊緣整齊、表面光潔、橫紋清晰、立體感強(qiáng)的梭形細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)作電位檢測。先用記錄AP的細(xì)胞外液替換DMEM培養(yǎng)液，沖洗3次后進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。電極與細(xì)胞膜順利封接且破膜，待破膜穩(wěn)定后，轉(zhuǎn)到“I-Clamp 1”模式下，保持細(xì)胞靜息電位，未給予任何頻率刺激，記錄各組細(xì)胞的自發(fā)性動(dòng)作電位。記錄造模后細(xì)胞動(dòng)作電位后，分別于細(xì)胞外液中加入100 μl、200 μl、300 μl強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清及100 μl空白血清，穩(wěn)定3 min后，再次記錄動(dòng)作電位，分別測量各組加血清前、后細(xì)胞的復(fù)極至20 %動(dòng)作電位時(shí)程（APD20）、復(fù)極至50 %動(dòng)作電位時(shí)程（APD50）、復(fù)極至90 %動(dòng)作電位時(shí)程（APD90）、最大舒張電位（MDP）及動(dòng)作電位幅值（APA）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布的兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的兩組間比較用Wilcoxon檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清對(duì)乳鼠受損竇房結(jié)細(xì)胞APD20、APD50、APD90的影響與正常組細(xì)胞比較，經(jīng)缺血-再灌注造模后（模型組）細(xì)胞的APD20和APD50均明顯延長，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01），而APD90雖有延長，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。于造模后細(xì)胞外液分別加入100 μl、200 μl、300 μl強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清，與模型組比較，100 μl含藥血清組、200 μl含藥血清組、300 μl含藥血清組APD20縮短，分別為[（77.2±5.5）ms vs. （35.7 ± 7.1）ms]、[（77.2 ±5.5）ms vs. （50.1±7.5）ms]、[（77.2±5.5）ms vs. （39.7±4.3）ms]，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）；APD50縮短，分別為[（147.5 ±5.1）ms vs. （90.6±5.8）ms]、[（147.5±5.1）ms vs. （111.0±4.1）ms]、[（147.5±5.1）ms vs.（109.0±2.4）ms]，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。于造模后細(xì)胞外液加入100 μl空白血清，與模型組比較，APD20、APD50和APD90均無明顯變化（P均＞0.05）。提示，強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清可縮短乳鼠受損竇房結(jié)細(xì)胞的APD20、APD50，無明顯的濃度依賴性，以提高SNC自發(fā)性搏動(dòng)頻率，而對(duì)APD90無明顯影響（表1）。

2.2 強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清對(duì)乳鼠受損竇房結(jié)細(xì)胞MDP和APA的影響與正常組比較，經(jīng)缺血-再灌注造模后（模型組）細(xì)胞的MDP上升，APA減小，為[（-61.9 ± 5.4）mV vs. （-54.5 ± 4.6）mV]，[（84.7±5.0）mV vs. （71.4±4.7）mV]，差異均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。于造模后細(xì)胞外液分別加入100 μl、200 μl、300 μl強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清，與模型組比較，各組MDP值無明顯改變（P均＞0.05）。100 μl含藥血清組和300 μl含藥血清組APA均較模型組增大，分別為[（83.2 ± 5.9）mV vs. （71.4 ± 4.7）mV]和[（82.2 ± 6.4）mV vs. （71.4 ± 4.7）mV]，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01），200 μl含藥血清組APA雖有增大，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。空白血清組較模型組MDP及APA均無明顯改變（P均＞0.05）。提示，強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清可增大乳鼠受損SNC的APA，而對(duì)MDP無明顯影響（圖1）。

3討論

SAN是心臟的正常起搏點(diǎn)，SNC因其舒張期自動(dòng)去極化而產(chǎn)生自發(fā)性AP。SNC屬慢反應(yīng)節(jié)律性心肌細(xì)胞。其AP的形狀與心房肌細(xì)胞和心室肌細(xì)胞等快反應(yīng)細(xì)胞不同。SAN的靜息電位和動(dòng)作電位幅度均較小，AP中沒有平臺(tái)期，只有0、3、4期，其中4 期不穩(wěn)定，在前一個(gè)AP復(fù)極完畢后，就開始自動(dòng)、緩慢地除極，使膜電位逐漸減小，當(dāng)達(dá)到閾電位（約-40 mV）時(shí)即可觸發(fā)AP，因此，4期自動(dòng)除極是SNC自律性形成的基礎(chǔ)。SNC動(dòng)作電位時(shí)程延長和形狀改變可導(dǎo)致竇房結(jié)自律性和起搏頻率下降，從而引起心動(dòng)過緩。因此SNC 4期自動(dòng)去極化速度降低、APD及復(fù)極時(shí)間延長等是病態(tài)竇房結(jié)綜合征（SSS）的病理基礎(chǔ)[9,10]。

中藥復(fù)方有效成分為多種，而且中藥多為口服，如果中藥粗制劑直接加入離體實(shí)驗(yàn)體系中，由于中藥本身復(fù)雜的理化性質(zhì)、雜質(zhì)成分等，可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。1998年日本國立京都醫(yī)院的田代真一提出中藥“血清藥理學(xué)”[11]，國內(nèi)陸續(xù)開展這方面的研究工作，并迅速發(fā)展起來。目前認(rèn)為，中藥血清藥理學(xué)研究方法適合在細(xì)胞、亞細(xì)胞、分子水平對(duì)中藥及中藥復(fù)方進(jìn)行深入的機(jī)制研究，科學(xué)性、真實(shí)性、可行性較中藥粗制劑直接體外研究具有一定優(yōu)勢(shì)[12,13]。中藥血清藥理學(xué)研究方法，是中藥粗制劑經(jīng)過口服吸收，用含有藥物成分的血清進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)研究，更接近藥物在機(jī)體中的作用，且能排除一些影響因素。

表1 強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清對(duì)乳鼠受損竇房結(jié)細(xì)胞APD20、APD50、APD90的影響

強(qiáng)心復(fù)脈方是國醫(yī)大師劉志明老中醫(yī)從醫(yī)70余年的臨證精華，具有通陽活血、溫經(jīng)復(fù)脈之功效，是治療緩慢性心律失常病態(tài)竇房結(jié)綜合征的有效經(jīng)驗(yàn)方。該方主要由人參、當(dāng)歸、黃芪、熟地等組成，其中人參、當(dāng)歸為君藥，人參味甘，性溫。歸心、脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣溫陽之功；當(dāng)歸味甘、辛，性溫，入心、肝、肺三經(jīng)，具有補(bǔ)血、活血之功。二者合用，共奏通陽活血之功，且溫而不燥，補(bǔ)而不滯。黃芪為臣藥，重在益氣，加強(qiáng)君藥補(bǔ)益之功，熟地黃臣藥，益精填髓，意在陰中求陽。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參皂苷對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP及cGMP含量具雙向調(diào)節(jié)作用，對(duì)實(shí)驗(yàn)兔竇房結(jié)功能損傷有保護(hù)作用，可防止缺氧缺糖心肌細(xì)胞無氧酵解，促進(jìn)糖原合成，緩解心肌缺血-再灌注損傷[14,15]。當(dāng)歸對(duì)大鼠心肌缺血-再灌注的心律失常有保護(hù)作用，明顯增加心肌環(huán)磷酸腺苷的含量[16]。當(dāng)歸醇提取物及阿魏酸鈉注射液能對(duì)抗哇巴因中毒所致的心律失常，使之轉(zhuǎn)為正常節(jié)律；阿魏酸能增加小鼠的心肌血流量，并穩(wěn)定缺氧心肌細(xì)胞膜，起保護(hù)線粒體及溶酶體的作用，增強(qiáng)抗缺氧的能力[17]。當(dāng)歸及其揮發(fā)油具有調(diào)節(jié)血管生成、抑制心肌細(xì)胞肥大和抗心律失常的作用[18]。當(dāng)歸揮發(fā)油的中性非酚性部位（A3）具有明顯的抗心律失常作用，縮短復(fù)極20%時(shí)程和復(fù)極90%時(shí)程，其作用機(jī)理可能與A3阻滯Ca2+、Na+內(nèi)流和促進(jìn)K+外流有關(guān)[19]。

圖1 強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清對(duì)乳鼠受損竇房結(jié)細(xì)胞MDP和APA的影響（與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01）

前期研究證明該方能明顯改善SSS患者臨床癥狀，提高患者24 h總心率及平均心率，增強(qiáng)SSS模型竇房結(jié)自律性及傳導(dǎo)功能，改善電生理相關(guān)指標(biāo)。從臨床、整體實(shí)驗(yàn)、組織細(xì)胞、分子、基因等水平揭示強(qiáng)心復(fù)脈方治療SSS的機(jī)制[2,20-23]。

本研究結(jié)果表明，強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清可加快乳鼠受損SNC自發(fā)性搏動(dòng)頻率，縮短APD20、APD50，而對(duì)APD90無明顯影響，強(qiáng)心復(fù)脈方含藥血清具有保護(hù)乳鼠受損SNC的作用。并且我們推測，強(qiáng)心復(fù)脈方提高SNC自律性可能是通過縮短APD20和APD50、增大APA以加快復(fù)極化和縮短動(dòng)作電位時(shí)程而實(shí)現(xiàn)的，從而提高心率。

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Influence of medicated serum of Qiangxin Fumai Fang on action potential of injured sino-atrial node cells in neonatal rats

WANG Yan-li*, LIU Ru-xiu, LIU Yu, LI Yang, LIU Jin-feng.*Department of Cardiology, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100053, China.

LIU Ru-xiu, E-mail: liuruxiu1@yahoo.com.cn

ObjectiveTo study the influence of medicated serum of Qiangxin Fumai Fang on action potential of injured sino-atrial node cells (SNC) in neonatal rats.MethodsSNC were isolated in Wistar neonatal rats and divided into 6 groups including normal group (group 1), model group (group 2), 100 l medicated serum group (group 3), 200 l medicated serum group (group 4), 300 l medicated serum group (group 5) and blank serum group (group 6). Except of group 1, other groups were given simulating ischemia-reperfusion (I-R) for establishing cell injury model. The cell spontaneous action potential was recorded by using patch clamp technique under current clamp mode in all groups. The durations from repolarization to 20% action potential (APD20), 50% action potential (APD50) and 90% action potential (APD90), the maximal diastolic potential (MDP), and action potential amplitude (APA) were detected in all groups.ResultsCompared with group 2, APD20was shortened in group 3, group 4 and group 5 [(77.2 ±5.5) ms vs. (35.7±7.1) ms], [(77.2±5.5) ms vs. (50.1±7.5) ms], [(77.2±5.5) ms vs. (39.7±4.3) ms, all P＜0.01], and APD50was shortened in group 3, group 4 and group 5 [(147.5±5.1) ms vs. (90.6±5.8) ms], [(147.5±5.1) ms vs. (111.0±4.1) ms], [(147.5±5.1) ms vs. (109.0±2.4) ms, all P＜0.05]. Compared with group 1, MDP increased and APA decreased in group 2 [(-61.9±5.4) mV vs. (-54.5±4.6) mV], [(84.7±5.0) mV vs. (71.4±4.7) mV, all P＜0.01]. Compared with group 2, MDP had no significant changes in group 3, group 4 and group 5 (all P＞0.05). APA increased in group 3 and group 5 compared with group 2 [(83.2±5.9) mV vs. (71.4±4.7) mV], [(82.2±6.4) mV vs. (71.4±4.7) mV, all P＜0.01].ConclusionThe medicated serum of Qiangxin Fumai Fang can shorten APD20and APD50of action potential of injured SNC, increased APA, shorten duration of action potential, and improve frequency of spontaneous beat in neonatal rats.

Qiangxin Fumai Fang; Medicated serum; Sino-atrial node cells; Patch clamp; Action potential; Neonatal rats

R540.42

A

1674-4055(2015)04-0444-04

2015-03-12 ）

（責(zé)任編輯：姚雪莉）

北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(7102135)

100053 北京,中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院心內(nèi)科(汪艷麗,劉如秀,劉宇,劉金鳳);中國人民解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所(李泱)

劉如秀,E-mail:liuruxiu1@163.com

10.3969/j.1674-4055.2015.04.04