馮明飛，劉俊輝，盧斌斌，孫世豪，洪廣峰，劉帥東，張建勛

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

N-亞硝基降煙堿（NNN）是由煙草生物堿降煙堿和煙堿經(jīng)亞硝化形成的煙草特有亞硝胺（TSNAs）［1］，對大鼠的食道和鼻黏膜、倉鼠的呼吸道和小鼠的肺部有致腫瘤作用［2］。NNN 的致癌性來源于體內(nèi)的代謝活化，在嚙齒類動物體內(nèi)，其主要代謝途徑是吡咯烷環(huán)的2'-和5'-羥基化，生成麥斯明、4-羥基-1-（3-吡啶基）-1-丁酮［4-Hydroxy-1-（3-pyridyl）-1-butanone，HPB］、1-（3-吡啶基）-1，4-丁二醇［1-（3-Pyridyl）-1,4-butanediol，PBD］、內(nèi)半縮醛、內(nèi)酯等，進(jìn)一步生成尿液中NNN 的主要代謝物——吡啶基丁酮酸和吡啶基羥基酸［3-4］（圖1）。其他代謝途徑有吡啶環(huán)N-氧化生成的NNN-N-氧化物、吡咯烷環(huán)的3'-和4'-羥基化，及生成去甲基可替寧等。

圖1 NNN 在嚙齒類動物體內(nèi)的代謝途徑

NNN 及其代謝物的檢測方法主要是高效液相色譜（HPLC）法。Carmella 等［5］用優(yōu)化后的HPLC系統(tǒng)分離了NNN 及NNK 的11 種代謝物，Hecht等［6］通過體外培養(yǎng)的大鼠食道研究NNN 的代謝，Upadhyaya 等［3］采用HPLC 法分析了NNN 在赤猴體內(nèi)的代謝過程。HPLC-MS/MS 法較HPLC 法簡單、靈敏、快速，廣泛用于卷煙煙絲、煙氣及動物體內(nèi)TSNAs 的測定［7-10］。趙貝貝等［11］通過HPLCMS/MS 方法對家兔血液中的NNN 及其代謝物進(jìn)行了測定，但關(guān)于NNN 及其7 種代謝物在小鼠血液中的研究尚未見報(bào)道。痕量分析時(shí)由于受基質(zhì)背景干擾大，三重四極桿質(zhì)譜在定性時(shí)準(zhǔn)確性較低。基于高分辨率質(zhì)譜可以有效降低基質(zhì)干擾，且具有MS/MS 二級確證，Q Exactive 軌道阱高分辨質(zhì)譜儀在痕量分析時(shí)可以較好保證定性準(zhǔn)確［12］。因此，在趙貝貝等［11］的HPLC-MS/MS 法的基礎(chǔ)上，通過所確立的UPLC-Q Exactive 軌道阱高分辨質(zhì)譜方法，增加NNN 及其7 種代謝物的線性分析范圍，分析了NNN 在小鼠血液中的變化規(guī)律，旨在為進(jìn)一步研究NNN 的代謝特征提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

SPF 級C57BL/6 雌性小鼠［6～8 周，體質(zhì)量18～22 g，常州卡文斯動物實(shí)驗(yàn)有限公司，許可證號:SCXK（蘇）2011-0003］。

NNN、NNN-d4（內(nèi)標(biāo)）、NNN-N-氧化物、4-羥基-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（HPB）、HPB-d4（內(nèi)標(biāo)）、麥斯明、去甲基可替寧、1-（3-吡啶基）-1，4-丁二醇（PBD）、1-（3-吡啶基）-1-丁醇-4-羧酸銨（吡啶基羥基酸銨）、1-（3-吡啶基）-1-丁酮-4-羧酸（吡啶基丁酮酸）（＞98%，加拿大TRC 公司）；超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）；乙腈（CP，美國J&T Baker 公司）；甲酸銨（CP，美國Tedia 公司）。

優(yōu)譜佳UHPLC+高效液相色譜儀、Thermo Scientific Q Exactive 質(zhì)譜儀（美 國 Thermo 公司）；BL-50A 型立式壓力蒸汽滅菌器、SW-CJ-2F型潔凈工作臺、GR-70 型熱空氣消毒箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；Milli-Q Advantage A10 型超純水儀（美國Millipore 公司）；KH-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；S25 型圓周振蕩器（德國IKA 公司）；TGL18 型高速冷凍離心機(jī)（長沙英泰儀器有限公司）；CPA225D 型電子天平［感量0.000 01 g，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；13 mm×0.22 μm 有機(jī)相針式濾器（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 樣品的處理和分析

［11,13-14］的方法，摘下注射過NNN小鼠的眼球，取血約0.5 mL，4下6 000 r/min 離心10 min；取100 μL 上清血漿，加入20 μL 20 ng/mL的NNN-d4和HPB-d4混合內(nèi)標(biāo)溶液以及280 μL 乙腈，渦旋30 s，超聲10 min，14 000 r/min 離心10 min；取上清液，用針式濾器過濾，取樣分析。分析條件為:

色譜柱及柱溫條件和流動相A 同文獻(xiàn)［11］；進(jìn)樣量:10 μL；流速:0.3 mL/min；流動相B:乙腈；洗脫梯度:5%A 于2 min 內(nèi)線性升至15%，2～7 min線性升至25%，于0.5 min 內(nèi)線性降至5%，維持7.5 min。

離子源:加熱型電噴霧（HESI）；離子源溫度:300；正離子模式下電噴霧電壓:3.5 kV；鞘氣:206.85 kPa；輔助氣流速:3.33 L/min；傳輸毛細(xì)管溫度:320；掃描模式:FS/ddMS2［12］，一級全掃描（分辨率R=70 000，掃描質(zhì)量范圍100～500 amu），二級掃描分辨率R=17 500。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

NNN 及其代謝物的極性較強(qiáng)，參照文獻(xiàn)［11］中的色譜條件，選擇HILIC 色譜柱。按文獻(xiàn)［11］的洗脫梯度及降低流速（0.3 mL/min）后均不能將化合物完全分離。實(shí)驗(yàn)中調(diào)整了流動相的洗脫梯度，調(diào)整后8 種化合物的分離效果良好（圖2）。

所選內(nèi)標(biāo)NNN-d4和HPB-d4均為分析物的同系物，選擇的原則是低濃度時(shí)內(nèi)標(biāo)的峰形良好，基質(zhì)干擾少，低濃度時(shí)靈敏度低。

圖2 NNN 及其代謝物的分離色譜圖

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

由于Q Exactive 質(zhì)譜儀具有高分辨率，一級全掃描時(shí)通過各分析物的母離子可以進(jìn)行定量分析。通過MS/MS 二級掃描確認(rèn)各分析物的碎片離子，可對化合物進(jìn)行更為準(zhǔn)確的定性。圖3 顯示的是NNN 的質(zhì)量濃度為2、20、100 ng/mL 時(shí)有全掃描數(shù)據(jù)依賴觸發(fā)MS/MS 二級掃描的結(jié)果。質(zhì)荷比（m/z）為148.099 6，120.068 5 的兩個峰表示NNN 的兩個碎片離子，二級掃描通過確認(rèn)其是否存在可進(jìn)一步定性確證。各分析物的質(zhì)子化離子質(zhì)量及相對豐度較大的碎片離子質(zhì)量如表1 所示。

圖3 不同濃度下NNN 的二級碎片離子掃描結(jié)果

2.3 工作曲線和檢出限

各標(biāo)準(zhǔn)品分別用甲醇溶解，用乙腈定容，分別得100 μg/mL 的儲備液，-40保存。采用經(jīng)處理的空白血漿配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。NNN 的濃度梯度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 ng/mL，其余分析物的對應(yīng)濃度梯度為0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00、250.00、500.00 ng/mL，兩種內(nèi)標(biāo)的濃度均為1 ng/mL。采用內(nèi)標(biāo)法定量，NNN 的內(nèi)標(biāo)為NNN-d4，其余分析物的內(nèi)標(biāo)為HPB-d4。以各分析物的色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)（Y），以濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R2）。將各標(biāo)樣的最低濃度設(shè)10 次重復(fù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別以3 倍和10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為方法得到檢出限和定量限，見表2。可知，各分析物的回歸方程線性良好，定量限為0.064～0.225 ng/mL。與趙貝貝等［11］的HPLC-MS/MS 方法相比，本方法中工作曲線的最低濃度降低了一個數(shù)量級，定量限較低，說明UPLC-Q Exactive 軌道阱高分辨質(zhì)譜法更適合于復(fù)雜樣品中痕量分析物的檢測。

表1 各分析物的質(zhì)子化離子質(zhì)量及碎片離子

2.4 重復(fù)性和回收率

將分析物的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白血漿中，制備5種不同濃度的質(zhì)控樣品，NNN 的濃度分別為0.5、2.0、20.0、100.0 和500.0 ng/mL，其他分析物的濃度均為0.25、1.00、10.00、50.00 和250.00 ng/mL，內(nèi)標(biāo)的濃度為1 ng/mL。5 種濃度的質(zhì)控樣品分別取6份進(jìn)行日內(nèi)分析，回收率和精密度結(jié)果（表3）表明，5 個濃度水平樣品的精密度在0.47%～8.38%之間，低于趙貝貝等［11］的HPLC-MS/MS 方法的精密度；回收率為78.0%～117.5%。

表2 各分析物的工作曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 小鼠血液中NNN 隨時(shí)間的代謝

50 只小鼠隨機(jī)分為10 個小組，每個小組5 只，每個小組對應(yīng)一個時(shí)間點(diǎn)。小鼠空腹12 h 后腹腔注射NNN（6.64 mg/kg 體質(zhì)量，溶于生理鹽水）。NNN 注射5、10、15、30、45、60、90、120、180、240 min后，分別摘眼球，取血，隨后進(jìn)行樣品處理與分析。以NNN 及其代謝物的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖（圖4）。

由圖4 可知，NNN 的濃度在30 min 內(nèi)迅速下降，說明NNN 在體內(nèi)代謝很快。注射NNN 后，短時(shí)間內(nèi)代謝物均已產(chǎn)生，并且隨時(shí)間的延長，大部分代謝物的濃度呈下降趨勢；各分析物濃度在約90 min 后趨于穩(wěn)定。對各分析物的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC）比較可知，在NNN 的所有代謝物中，吡啶基羥基酸在血液中的總量最大。這與家兔血液中的研究結(jié)果［11］一致，其次是去甲基可替寧和吡啶基丁酮酸。由圖1 可知，吡啶基羥基酸來源于NNN 的5'-羥基化，吡啶基丁酮酸主要來源于NNN 的2'-羥基化。這說明NNN 的5'-羥基化可能是小鼠血液中的主要代謝途徑。

表3 不同濃度下各分析物的精密度和回收率（n=6）

圖4 小鼠血液中NNN 及其代謝物濃度隨時(shí)間的變化

3 結(jié)論

①建立了一種同時(shí)檢測小鼠血液中NNN 及其7 種代謝物的UPLC-Q Exactive 軌道阱高分辨質(zhì)譜法。②NNN 及其代謝物的檢出限為0.019～0.067 ng/mL，日內(nèi)精密度為0.47%～8.38%，回收率在78.0%～117.5%之間；該方法檢出限低、靈敏度高，適合于小鼠血漿中NNN 及其代謝物的檢測。

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