尹鵬 胡君 儲著凌 霍中華 侯樂偉 呂盛 欒榮剛 胡國強

（解放軍第四五四醫(yī)院普外燒傷整形外科，南京 江蘇 210002）

由于我國人口飲食結(jié)構(gòu)以及生活方式的改變，結(jié)腸癌（colon cancer）的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，以每年4%到5%的速度遞增［1－5］。臨床研究和流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示目前結(jié)腸癌已成為發(fā)病率第三位的惡性腫瘤性疾?。?－5］。研究表明在正常生理狀態(tài)下NOTCH1信號通路對于調(diào)節(jié)細胞分化（cell differentiation）和組織器官生成發(fā)育（development）有重要的價值［6－9］。進一步的研究顯示NOTCH1信號通路還在腫瘤的增殖分化、浸潤、轉(zhuǎn)移及凋亡過程中均扮演著重要的角色［10－12］。研究證實抑制和下調(diào)NOTCH1信號通路的活性可以有效抑制肺腺癌A549細胞、鼻咽癌5－8F細胞和CNE－1細胞以及卵巢癌A2780細胞等多種腫瘤的增殖和分化［13－15］。同時大量研究顯示γ－分泌酶抑制劑（γ－secretase inhibitor）DAPT 對NOTCH1信號通路有顯著抑制作用［13，14，16］。本研究旨在探討γ－分泌酶抑制劑DAPT 能否通過下調(diào)NOTCH1信號通路抑制結(jié)腸癌HCT116細胞增殖，以及對NOTCH1信號通路下游分子Hes1表達的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 結(jié)腸癌HCT116細胞購買于從中國科學(xué)院上海細胞庫；PCR 試劑盒購自寶生物工程有限公司；鼠抗人NOTCH1抗體、鼠抗人Hes1抗體和鼠抗人β－actin 抗體購于美國Cell Signaling 公司；γ－分泌酶抑制劑DAPT 購買于德國Merck公司；DMEM 培養(yǎng)基購買于美國Gibco公司；小牛血清購買于杭州四季清公司；MTT 試劑盒購買于美國Promega公司；超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 細胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌HCT116細胞常規(guī)接種在含10%FBS、100g／L 青霉素、100g／L 鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37°C、95%空氣、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48h換液、傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞活性檢測 取對數(shù)生長期細胞消化制成單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100μL約含5×103個細胞。貼壁后無血清培養(yǎng)細胞16h 至24h，使細胞同步化。加入不同終濃度（0μM、1μM 和10μM）的DAPT，在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)細胞，0μM DAPT 干預(yù)組細胞作為對照組（Control組）。使用MTT 比色試驗對不同時間點（0h、24h和48h）的細胞生長狀態(tài)進行測定，實驗重復(fù)4次。對應(yīng)時間點的細胞活性（%）＝（OD 干預(yù)組／OD 對照組）×100（%）［2］。

1.4 細胞NOTCH1和Hes1 mRNA 表達檢測 按照RT－PCR 試劑盒說明書提取細胞總RNA。以2μg總RNA 為模板，用Oligo（dT）18作為引物，按照試劑盒說明書介紹要求合成cDNA 第1鏈。NOTCH1正 義5′－GCAAGAAGAAGCGGAGAG－3′，反 義5′－AGCTGGCACCCTGATAGATG－3′；Hes1 正 義5′－GCAGCAGCAGTTGCAAGCTC－3′，反 義5′－TCTTGTCATCTTTTATTGCC－3′；β－actin 正 義：5′－CTCCATCCTGGCCTCGCTGT－3′，反 義：5′－GCTGTCACCTTCACCGTTCC－3′，PCR 反應(yīng)體系如下：2μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物模板、PCR Master Mix（2×）25μL、正反引物各2μL，以超純水補充至50μL。PCR 反應(yīng)條件為：95℃5min；91℃30s，55℃60s，73℃60s，循環(huán)35輪，最后74℃延伸10min。PCR 產(chǎn)物8μL 與5×loading buffer 2 μl 混勻后，1.2% 瓊脂糖凝 膠20V／cm電壓進行電泳約30min。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)（Bio－rad）攝影，Quantity One軟件對目的條帶進行掃描分析。用與β－actin PCR 產(chǎn)物條帶灰度比值作為TIMP－1和PPAR－γmRNA 的相對表達量。

1.5 Western blot法檢測細胞中NOTCH1和Hes1蛋白表達 按照試劑盒操作要求，首先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入鼠抗人單克隆抗體NOTCH1（1∶1000）、Hes1（1∶1000）和β－actin（1∶1500），4℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2000），用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 計量資料以均數(shù)±標準差表示。采用SPSS17.0進行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD 法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT 法結(jié)果分析 在不同濃度（0μM、1μM 和10μM）的DAPT 干預(yù)后，使用MTT 法對不同時間點（0h、24h 和48h）結(jié)腸癌HCT116 細胞活性進行測定。發(fā)現(xiàn)給予DAPT 干預(yù)后HCT116細胞活性呈濃度依賴性和時間依賴性下降，差異均存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05），見表1。

表1 MTT比色法測定HCT116細胞活性［n（×10－2）］Table 1 Cell viabilities of HCT116cells in different time points（0h，24h，and 48h）

2.2 NOTCH1 mRNA 和蛋白的表達 在給予HCT116細胞不同濃度（0μM、1μM 和10μM）DAPT干預(yù)48h后，使用RT－PCR 和western blot法對細胞NOTCH1mRNA 和蛋白的表達進行分析。發(fā)現(xiàn)給予DAPT 干預(yù)后NOTCH1 mRNA 和蛋白表達水平呈濃度依賴性降低，差異均存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），見表2，圖1。

表2 HCT116細胞NOTCH1和Hes1 mRNA 和蛋白表達水平（n＝4，）Table 2 The mRNA and protein expression levels of NOTCH1and Hes1 in HCT116cells

表2 HCT116細胞NOTCH1和Hes1 mRNA 和蛋白表達水平（n＝4，）Table 2 The mRNA and protein expression levels of NOTCH1and Hes1 in HCT116cells

注：與0μM 相比較①P＜0.05，與1μM 相比較②P＜0.05。

2.3 Hes1mRNA 和蛋白的表達 在給予HCT116細胞不同濃度（0μM、1μM 和10μM）DAPT 干預(yù)48h后，使 用RT－PCR 和western blot 法對細胞Hes1 mRNA 和蛋白的表達進行分析。發(fā)現(xiàn)給予DAPT 干預(yù)后Hes1mRNA 和蛋白表達水平呈濃度依賴性降低，差異均存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05），見圖2，表2。

圖1 HCT116細胞NOTCH1mRNA和蛋白的表達（n＝4）Figure 1 The mRNA and protein expression of NOTCH1in HCT116cells（n＝4）.

圖2 HCT116細胞Hes1mRNA和蛋白的表達（n＝4）Figure 2 The mRNA and protein expression of Hes1in HCT116cells

3 討論

結(jié)腸癌（colon cancer）是人類最常見的消化道惡性腫瘤之一，目前臨床研究和流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)由于人口老齡化的加劇、飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的的改變導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，據(jù)統(tǒng)計結(jié)腸癌的發(fā)病率呈每年4%～5%的速度遞增［1－5］。數(shù)據(jù)顯示目前在我國結(jié)腸癌已成為發(fā)病率第三位的惡性腫瘤性疾?。?－5］。尋求新的治療藥物和方法刻不容緩。

NOTCH 基因及其信號通路首先在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，進一步研究表明NOTCH 信號通路廣泛存在于低等及高等動 物，在進化上 高度保守［6－10］。完整的NOTCH 信號通路主要是由NOTCH 受體（NOTCH receptors）、NOTCH 配 體（NOTCH ligands）、CSLDNA 結(jié)合蛋白（CSL－DNA binding proteins）及NOTCH 調(diào)節(jié)分子（NOTCH regulators）等構(gòu)成，其中NOTCH 受體包括NOTCH1到NOCTH4共4個亞型，目前對NOTCH1的研究較為深入［6－10］。生理狀態(tài)下NOTCH1信號通路對胚胎的生長發(fā)育、組織器官的生成、細胞的增殖和分化等均具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［6－9］。張樹君等 研究發(fā)現(xiàn) 在主動脈－性 腺－中 腎（aorta－gonad－mesonephros，AGM）區(qū)NOTCH1信號通路在造血祖細胞的增殖和分化過程中扮演著重要的角色［17］。肖迎等的研究發(fā)現(xiàn)NOTCH1 信號通路順序開放和激活是調(diào)節(jié)胚胎干細胞向神經(jīng)細胞的特異性分化的重要因素［18］。朱英等人的研究證實在牙根的發(fā)育過程中NOTCH1信號通路對于牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的發(fā)育和成熟具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［19］。同時進一步的研究表明NOTCH1信號通路對腫瘤的增殖和分化、腫瘤血管生成、腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移以及炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程也有重要的調(diào)節(jié)作用［10－15］。吳利英等的研究發(fā)現(xiàn)γ－分泌酶抑制劑DAPT 可以通過抑制NOTCH1及下游分子Hes1的表達使人卵巢癌A2780細胞的細胞周期停滯在G1期，從而抑制腫瘤細胞的增殖和分化［14］。陳始明等的研究證實抑制NOTCH1信號通路可以有效地抑制人鼻咽癌5－8F細胞和CNE－1細胞的增殖和分化［15］。大量的研究證實γ－分泌酶抑制劑DAPT 可以特異性的有效抑制NOTCH1 的表達，從而抑制 NOTCH1 信號通路［13，14，16］。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)在使用不同濃度的（0μM、1μM 和10μM）DAPT 干預(yù)后結(jié)腸癌HCT116細胞活性呈濃度依賴性和時間依賴性下降，差異均存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05）。該結(jié)果表明γ－分泌酶抑制劑DAPT 對結(jié)腸癌HCT116細胞的增殖和分化有顯著的抑制作用。

Hes1是NOTCH1信號通路的重要靶蛋白，是參與NOTCH1信號通路生物活性的關(guān)鍵分子［18－20］。本實驗中我們使用RT－PCR 和western blot法對結(jié)腸癌HCT116細胞NOTCH1和Hes1mRNA 和蛋白的表達水平進行檢測。結(jié)果表明在給予不同濃度（0μM、1μM 和10μM）γ－分泌酶抑制劑DAPT 干預(yù)后HCT116細胞NOTCH1和Hes1mRNA 和蛋白的表達水平呈濃度依賴性降低。該結(jié)果表明γ－分泌酶抑制劑DAPT 對結(jié)腸癌HCT116 細胞NOTCH1 和Hes1基因的表達有明顯的抑制作用。

4 結(jié)論

γ－分泌酶抑制劑DAPT 可以通過下調(diào)NOTCH1信號通路，抑制結(jié)腸癌HCT116細胞增殖。γ－分泌酶抑制劑具有成為治療結(jié)腸癌等惡性腫瘤藥物的潛在可能。

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