王姍姍， 易八賢， 殷勤偉

（1.北京軍區(qū)總醫(yī)院轉化醫(yī)學中心，北京 100700；2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 200040）

小RNA基因藥研發(fā)的現(xiàn)狀和展望

王姍姍1， 易八賢2， 殷勤偉1

（1.北京軍區(qū)總醫(yī)院轉化醫(yī)學中心，北京 100700；2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 200040）

RNA干擾技術的核心成份包括siRNA，miRNA，sh RNA和ds RNA，由于其在沉默疾病特異的靶基因方面的高度特異性和有效性，已成為一個人類研發(fā)未來新型基因藥的戰(zhàn)略平臺.然而十多年的小RNA基因藥研發(fā)顯示，此技術的產業(yè)化路程充滿挑戰(zhàn).本綜述總結了小RNA基因藥研發(fā)的現(xiàn)狀、存在的問題和未來愿景.

小RNA；基因藥物；研發(fā)進展

核酸是生命的基本物質，它存在于單細胞微生物、多細胞植物及復雜的人體等所有生物細胞中，是生物遺傳密碼的載體和生物發(fā)育的藍圖，是指導生命活性成分合成的模板和指令，也是調節(jié)和控制細胞生命活動的重要分子.隨著生命科學技術的進步和生物工程的迅猛發(fā)展，相關的核酸高新技術，如基因治療和小RNAs（siRNA／miRNA）沉默技術等以其獨特的藥理作用形成了一個新興產業(yè)，正日益彰顯出其特有而重要的經(jīng)濟價值和社會影響.本文主要綜述小RNA基因藥方面的最新研發(fā)進展.

1998年，F(xiàn)ire等［1］發(fā)現(xiàn)一種小RNA可以作為基因表達的調節(jié)者，這個對細胞中基因信息流傳遞進行精細調控的發(fā)現(xiàn)于2006年獲得了諾貝爾獎.它也為miRNA對翻譯的控制，s RNA對染色質重塑的指導以及對非編碼RNA功能的重新認識都產生了深遠的影響.可以說s RNAs是基因功能檢驗的試金石，利用sRNA沉默技術可以縮短對人類基因功能的了解和認識的時間，在不久的將來，有望將人類大部分基因的功能和作用全部弄清楚［2-4］；另一方面，有望利用該技術獲得使致病基因失活的新型基因藥物，而基因藥物一直是當代生物技術界追捧的對象.然而，小RNA基因藥要進入實際臨床應用，目前迫切需要解決的主要問題是基因沉默藥物的靶向給藥方式［2］、小RNA的脫靶效應［5］、自然免疫激活作用［6］、入胞后難釋放發(fā)揮作用［7］、可能的表觀遺傳修飾功能以及在血液中會被酶快速降解等問題［8］，故小RNA基因藥要通過臨床的嚴格試驗成功地進入藥品市場還有較長的路要走.

1 小RNA的結構和作用機制

主要的小RNA有兩種：siRNA和miRNA，都是19～23對核苷酸堿基構成的雙體.siRNAs（small or short interference RNAs）最初是在轉基因和病毒誘導的沉默子中發(fā)現(xiàn)的［1］.因此，可以說siRNA是一種天然的基因藥物，在低等生物和植物防御外來遺傳物質的侵襲方面發(fā)揮著重要作用.本課題組通過計算機預測、Solexa測序和生物芯片分析在人體細胞中發(fā)現(xiàn)了1 345條內源性sh RNAs和siRNAs［9］.其他實驗室研究結果也證實了在小鼠的胚胎干細胞中存在天然的內源性siRNAs，它們可來自基因的內含子、假基因起源的反義轉錄子或基因重復序列等［10］.miRNA分子大多數(shù)是一段小的非完全互補的雙鏈RNA，在轉錄后階段調控基因的表達.目前為止，在生物體內已發(fā)現(xiàn)了1 500多個miRNA序列，并存儲在miRBase（http：／／w ww. mirbase.org／index.shtml）中，可調節(jié)約60%的蛋白質編碼基因［11］.內源性的非編碼miRNAs或sh RNAs轉錄子首先由最初的非完全互補的雙鏈前體在細胞核內經(jīng)RNase III酶（Drosha）初步作用成一個短發(fā)夾結構，在Exportin 5和Ran-GTP共因子的幫助下通過核孔進入胞漿［12］，在Dicer酶的作用下產生約21個核苷酸（NT）的雙鏈RNA，具有典型的末端（5’磷酸和3’尾端）［13］.

siRNA沉默途徑的特征是siRNA雙體中的功能鏈與mRNA編碼區(qū)中的靶目標鏈是完全互補的.在siRNA雙體與RNA誘導的沉默復合體（RISC）結合后，其中的引導鏈（或稱功能鏈）可引導RISC識別靶mRNA并與其結合，RISC中的核酸內切酶介導靶基因的裂解.mRNA的降解是由Ago2誘發(fā)的［14］，由此產生的基因片段為核酸外切酶酶解消化.進一步的研究發(fā)現(xiàn)，siRNA也可以作用于靶m RNA分子的其他區(qū)域，如非編碼區(qū).如果siRNAs與靶區(qū)中的核酸序列不完全匹配，它仍然可以抑制翻譯過程［15］.

研究動物和人體內miRNA的翻譯抑制機制時發(fā)現(xiàn)，miRNA分子與目標基因相互作用的主要抑制途徑是通過“種子點”方式來實現(xiàn)的.miRNA的第2個到第7、8個堿基對與靶mRNA的非編碼區(qū)域內序列進行配對，而其部分與靶mRNA的互補是不完全的［16-17］.但植物細胞中miRNA的功能特點與siRNA分子作用模式一樣.最初認為miRNA的下調只有通過與mRNA的非編碼區(qū)作用，進而抑制基因的翻譯和保持靶mRNA的結構完整不變.研究表明，miRNA也能與mRNA的編碼區(qū)相互作用，降低m RNA的表達水平［18］.故miRNA與siRNA的作用機制非常類似，它與靶目標鏈的完全互補能導致mRNA的裂解.雖然miRNA依賴的翻譯抑制作用和（或）mRNA不穩(wěn)定的分子機制還未完全闡明，但miRNA-mRNA的互補程度仍是調控機制的關鍵因素.一個完全的配對允許Ago2催化mRNA的裂解，而匹配率低的不會引起mRNA的裂解，但能促進m RNA的翻譯抑制［19］.研究數(shù)據(jù)表明，大多數(shù)靶基因在m RNA水平和翻譯水平均能被抑制.基因分析顯示細胞內質網(wǎng)上相關核糖體中mRNA的翻譯抑制比游離胞漿核糖體強.此外，mRNA水平減少可只通過Ago催化裂解m RNA來實現(xiàn)，催化方式包括去頭端、去腺苷酸、核酸外切活性等.

有趣的是，一些研究表明miRNA不僅能抑制蛋白的表達，而且還能夠提高翻譯水平［20］.此時，miRNA的結合位點位于目標RNA5’端的非編碼區(qū)，而不是3’區(qū).綜上所述，mRNA的沉默，無論是siRNA還是miRNA誘導，都須有21～23個堿基對參與，以及RISC的介導.翻譯抑制是miRNA抑制基因表達最常見的機制，而m RNA的降解是si-RNA最常見的機制.其次，miRNA的完全配對可能參與基因的裂解，而siRNA的不完全配對也可能參與基因的抑制.再者，miRNA通過降低目標m RNA的穩(wěn)定性來減少mRNA的表達，而后者與RISC介導的裂解作用無關.

2 小RNA在細胞生長發(fā)育和疾病中的作用

由于小RNA干擾技術是研究特定基因功能的強有力工具，也是解析基因組調控網(wǎng)絡的有效方法，有關小RNA調控機制的研究對人體組織器官的形成、生長發(fā)育以及疾病的發(fā)生發(fā)展、診斷和治療具有很大意義.不管是內源性siRNAs還是miRNAs，都參與細胞的增殖、生長分化和代謝等過程，至今已有4 100種miRNA和疾病的相關性被報道.此外，miRNA分子也對生物體分化的不同組織類型和維持某一特定的分化狀態(tài)是必須的.未分化或低分化細胞對miRNAs依賴較少，例如缺乏Dicer酶的小鼠胚胎干細胞，不能生成成熟的miRNAs，是可發(fā)育的，但不能進行正常的分化.有證據(jù)表明，一些mi-RNAs的表達對干細胞的自我更新是重要的，如miR-302，miR-367等［21］.研究顯示，在成體細胞中導入一組miRNA分子能將其重編程為干細胞樣的誘導的多能干細胞（iPS）［22］.細胞的生長分化也須miRNA的參與，如小鼠和人類胚胎干細胞表達一組特定的miRNAs，當這些干細胞分化成胚胎后，原有的miRNAs發(fā)生下調，而另一些miRNAs卻上調.繼而發(fā)現(xiàn)，一些miRNAs在維持分化狀態(tài)上起重要作用；miR-181在B淋巴細胞中是優(yōu)先表達的，如在小鼠中異常地過度表達miR-181將導致B淋巴細胞比例的增加，同時引起T淋巴細胞比例的減少［23］.在轉基因小鼠的心臟中，過度表達的miR-1可導致心肌細胞有缺陷的增殖和心室心肌不能擴張，其原因是miR-1可引起心肌細胞過早分化［24］.綜上所述，小RNA在控制細胞生長發(fā)育和分化中，可能是通過控制基因表達網(wǎng)絡的開關發(fā)揮了重要的調節(jié)作用.由于這些調節(jié)作用在任何特定的細胞組織中都是至關重要的，因此，這些小RNA分子表達的失調可能會影響到生物體的生長和分化乃至引起疾病.

miRNA具有基因調節(jié)作用，其本身的發(fā)生也受到極其嚴格的控制.因此，它們發(fā)生失調不僅影響著細胞的正常分化和功能，在腫瘤細胞的始發(fā)、生長和增殖中也起重要作用.研究顯示，腫瘤和正常組織miRNA的表達方式有顯著差別［25］.進一步的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA分子可以致瘤、抑癌因子的方式發(fā)揮作用［26］，如miR-21在多種腫瘤細胞（乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和淋巴瘤）中高表達.其他同時能始發(fā)腫瘤和引起腫瘤轉移的低表達miRNAs包括let-7 miRNA家簇（let-7a-1，7a-2，7a-3，7b，7c，7d，7e，f7-1，7f-2，7g，7i，mir-98和mir-202），這是由于癌基因的高表達所致.另外，50%的miRNA基因位于腫瘤基因和染色質脆點區(qū)域，故癌基因高表達亦可引起miRNAs表達的失控［27］.根據(jù)上述研究，可以設想下調致癌的miRNA分子的表達，或上調抑癌的miRNAs也許都可以控制癌細胞發(fā)生發(fā)展.2014年，科學家們發(fā)現(xiàn)了一種新型的傳送平臺，利用腫瘤微環(huán)境的獨特特性可以讓類似于miRNA鏡像的反義分子進入到癌細胞中［28］.這些研究結果開發(fā)了以miRNA為基礎的抗癌藥物以及靶向性藥物傳遞的一種新模式.研究還顯示，不少miRNA可能影響腫瘤對化療的敏感性，有的miRNA可能增加腫瘤化療敏感性，而另一些則作用相反.可能增加腫瘤化療敏感性的miRNA，如miR-34a、miR-134、miR-379、miR-495和miR-21等，如將這些miRNA導入腫瘤細胞，可導致化療誘導的細胞死亡增加［29］.

近年，在小RNA研究方面的另一新進展就是細胞外小RNA分子的發(fā)現(xiàn)［30］，盡管其須在細胞內發(fā)揮功能，但該發(fā)現(xiàn)可用于細胞間的相互影響和調節(jié)的研究、疾病的診斷［31］、預后的評估以及疾病的預防和治療.大量研究結果顯示，不管是正常的還是腫瘤細胞都能產生細胞外囊泡［32-33］，一般有3種類型：40～100 n M的外胞體（Exosome），100～1 000 n M的微泡（Microvesicle）和800～5 000 n M的凋亡小體.這些囊泡中可含有較高濃度的多種miRNAs和其他成分，如Ago2等.在人體的這些囊泡中，已鑒定了700多種不同的miRNAs［34］.如MCF-7可產生這種囊泡，內含2%細胞內的mi-RNAs，尤其是miR-720、miR-451和miR-107等.這些含有miRNAs的囊泡可以在細胞間轉運，從而影響遠近細胞的生物學功能、形態(tài)的轉化以及內在基因型的變化［30，33，35］.此外，這些生物體內自然產生的囊泡，也給人們深刻的啟示，這也許是一種轉運小RNA基因藥物的最佳方式.

3 小RNA非病毒傳遞系統(tǒng)的研制

即使艱難地通過了血液清除的考驗，具有負極性特點和屬于大分子范疇的siRNA分子也很難穿過帶負電的細胞膜雙分子屏障進入細胞內部，因此，如何將其安全高效地送達指定細胞部位是小RNA基因藥物給藥的一大難題.現(xiàn)已研制了多種分子遞送系統(tǒng)，包括直接將小RNA分子噴入氣管和肺泡、注入眼球和病變部位，或是以納米顆粒、陽離子多肽、膽固醇基團或是含有特異性抗體的脂質體為載體運載小RNA通過血液去接近靶組織器官.雖然這些方法大都已經(jīng)在體外、動物或人體上進行過多種實驗，但可用于臨床試驗，能真正起效者寥寥無幾，其中較為有效的有以下幾種：

（1）核酸脂顆粒（SNALP）方法是將修飾過的siRNA包裹進一個陽離子或中性脂質雙分子層顆粒中，顆粒上還結合了聚乙二醇（PEG）分子抗吞噬以減少血液的清除［36］.這種SNALP顆粒將siRNA遞送進細胞后，載有siRNA的顆粒會被內體系統(tǒng)降解，釋放出小RNA分子.使用這種脂質顆粒遞送系統(tǒng)可將靶向針對APOB基因mRNA的siRNA分子遞送到靈長類動物的肝臟細胞內.一次靜脈注射后基因沉默的療效就可持續(xù)11天，沉默效率超過了90%，且不會發(fā)生毒性反應，被認為是目前最有希望的一種運載系統(tǒng).

（2）MEA動態(tài)多聚顆粒（MEA-DPC）與SNALPS顆粒比較相似，但體積更小一些，且含有配體分子能幫助顆粒到達特定的靶細胞［37］.MEADPC顆粒分子上還加入了對p H值不穩(wěn)定的化學鍵，故更有利于內體系統(tǒng)釋放siRNA分子.針對細胞周期蛋白D1基因的siRNA被結合到了穩(wěn)定的納米顆粒上，該納米顆粒表面結合了一種能夠特異性識別該粒細胞表面受體的抗體.在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，使用這種方法也能有效下調粒細胞內細胞周期蛋白D1基因的表達水平、抑制粒細胞的增殖，并逆轉人工誘導的小鼠結腸炎病程.

（3）外胞體［38］是生物體內細胞自發(fā)產生的一種微泡，大小為100 n M左右，用電穿孔的方式將人工合成的siRNA分子轉入其中，再偶聯(lián)上特異的靶向多肽，靜脈注射后，這些外胞體可將siRNA分子送到特定的腦組織而非其他部位，成功地下調靶基因.

（4）將膽固醇分子共價結合到被修飾siRNA分子上［39-40］，從而增強小RNA分子的親脂性和穩(wěn)定性.如將特異性靶向APOB載脂蛋白的siRNA與膽固醇基團結合，能夠將其遞送進肝內和空腸細胞，抑制細胞內APOB基因的表達，達到降低血脂的作用.

（5）多聚陽離子納米顆?？赏ㄟ^其表面與靶細胞上某個受體結合的配體［41-42］，如轉鐵蛋白等通過受體介導的胞飲作用將siRNA分子遞送進特定靶細胞內.在小鼠試驗中，使用轉鐵蛋白和環(huán)糊精多聚陽離子聚合物遞送靶向尤文氏肉瘤的Ews-Fli1融合mRNA的siRNA分子，從而有效地抑制腫瘤細胞的擴散.

（6）化學連接或在siRNA轉錄時加上RNA配體分子也可將siRNA分子遞送到特定的表達該配體受體分子的靶細胞內［43］.實驗結果表明，一種結合了前列腺特異性膜抗原PSMA（又稱FOLH1）的RNA配體分子與靶向PLK1基因的siRNA分子結合，就能高選擇性地將該siRNA分子遞送到前列腺癌細胞中發(fā)揮抑制作用.

（7）聚氨基葡萄糖具有黏膜黏著特性，也可被用于siRNA分子的載體，經(jīng)鼻腔吸入到細支氣管上皮細胞上.在小鼠和非人類的靈長類動物模型上已經(jīng)證實，這是一種非常有效的siRNA遞送方式，可以完全阻斷呼吸道合胞病毒對動物上呼吸道的感染［44-45］.

（8）使用魚精蛋白或其他陽離子物質將特異性的抗體結合到siRNA分子上，也可以將siRNA分子遞送到特定的靶細胞［46-48］.將魚精蛋白和HIV-1包膜蛋白gp160（HIV-1 ENV gp160）抗體的Fab鏈結合.帶正電荷的魚精蛋白結合了帶負電荷的靶向HIV病毒gag基因的siRNA后，在抗體的制導下就能選擇性地將這些小RNA分子遞送到細胞表面表達有gp160蛋白的細胞中.從而下調HIV病毒gag基因的表達.

（9）siRNA分子被遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)［49］，這項實驗中使用的siRNA是針對日本腦炎病毒的小RNA分子，這些siRNA分子上連接了狂犬病毒糖蛋白短肽，從而可以與神經(jīng)元細胞上的乙酰膽堿受體結合.靜脈注射后，80%的實驗小鼠在感染日本腦炎病毒后都能繼續(xù)存活，而未給藥對照組則全部死亡.

（10）本課題組將siRNA與靶向黑色素細胞表面分子連接的多肽進行自組裝成納米顆粒［50］，這種納米顆粒能成功地將抗黑色素生成的siRNA分子遞送到黑色素細胞內，從而抑制有關黑色素生成的轉錄因子及其下游的相關基因，大大地減少黑色素的形成，達到防治高色素病的目的，現(xiàn)已被用于祛斑美白的化妝品中.

4 小RNA產業(yè)發(fā)展的歷史和現(xiàn)狀

至今，RNAi藥物的產業(yè)化可分為4個時期：2002～2005年可作為sRNA藥物的發(fā)現(xiàn)期，此期從發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象存在人的細胞中開始，漸被人們認識到可作為一種疾病的治療手段.2002～2005年可作為RNAi藥物的發(fā)現(xiàn)期，一批以核酸干擾藥物開發(fā)為己任的制藥企業(yè)紛紛成立，加上一批由其他技術平臺轉入核酸干擾藥物開發(fā)的公司，整個核酸干擾藥物產業(yè)群在美歐已經(jīng)快速形成.主要由一些小公司，如Ribozyme Pharmaceuticals（aka Sirna Therapeutics），Atugen（aka Silence Therapeutics），Transderm，Quark，Calando Pharma，PTC Therapeutics和Protiva（aka Tekmira）介導.Alnylam Pharmaceutical加入增加了知識產權的要素.2005～2008年可作為sRNA藥物的勃發(fā)期，各個生物技術公司在核酸干擾技術領域的競爭日趨激烈.美國的Alnylam公司和Sirna公司擁有使RNA分子保持穩(wěn)定的重要專利.Alnylam公司和德國的Ribopharma公司的合并使其在核酸干擾技術的專利上獨具優(yōu)勢.而美國的Intradigm等公司則主要在核酸干擾藥物導入領域進行技術開拓.另外幾家公司，如Dharmacon、Qiagen以及Ambion則占據(jù)了核酸干擾實驗試劑市場.繼而一些大的制藥公司進入，高調開發(fā)核酸干擾藥物已經(jīng)使這一領域變得炙手可熱.此期已有7項核酸干擾藥物的項目在美國進入臨床試驗，包括：1項治療呼吸道感染的藥物，1項治療乙肝的藥物，1項治療艾滋病的藥物，1項治療皮膚病的藥物和3項治療老年型眼睛黃斑的藥物.其中，美國Opko公司治療老年性黃斑變性的藥物已經(jīng)推入到第III期臨床試驗.2008～2012年可作為sRNA藥物研發(fā)的調整期，由于全球性的金融風暴，加之制藥公司巨頭認識到RNAi制藥領域中siRNA分子的脫靶效應、競爭效益不高、傳遞系統(tǒng)的限制和天然免疫的激活等風險的存在，Pfizer、Merck、Abbott Labs和Roche公司紛紛緊縮投資.從2012年至今，可作為s RNA藥物的恢復期，一些新的siRNA／miRNA藥物進入臨床試驗，已有20余種siRNA藥物處于臨床試驗的不同時期；系統(tǒng)給藥的傳遞技術得到進一步改進，如穩(wěn)定的核酸脂顆粒（SNALP）技術平臺的建立，已有7種臨床試驗藥：ALN-VSP02、TKMApoB、ALN-TTR01、TKM-PLK1、ALNPCS02、TKM-EBOLA和ALN-TTR02采用了此傳遞技術；通過化學和結構修飾，如甲氧和乙氧以及閉鎖核酸的替代，使siRNA分子的競爭效益獲得明顯提高；同時通過生物信息學技術和化學修飾等方法，使siRNA分子的脫靶效應得到極大改善.這方面的生物公司有：輝瑞制藥有限公司（Pfizer，Inc，擁有針對超過20個靶點的先導化合物）、miRagen Therapeutics公司（心血管疾?。?、Shire plc（罕見遺傳性疾病）、葛蘭素史克公司（GlaxoSmith Kline，擁有4個病毒疾病候選藥物）、Quark（視神經(jīng)病變QP1-1007）和Enzon Pharmaceuticals公司（8個癌癥靶向藥物，其中3個已進入I期臨床研究）等多達20個.

在microRNA（miRNA）研究和開發(fā)方面，由于此小RNA在診斷和治療方面的潛力巨大，近來增長迅速，從而帶動了全球miRNA工具和服務市場的發(fā)展.據(jù)Frost&Sullivan公司預計，到2017年，全球miRNA市場的規(guī)模有望突破3億～5億美元.丹麥制藥公司Santaris首先成功研制了閉鎖核酸（LNA）藥物，這是一種基于microRNA靶向性的、可應用于臨床試驗的RNA技術平臺.2010年9月，Santaris制藥A／S公司成功地將miravirsen（一種靶向miR-122的microRNA候選藥物）推入了II期臨床試驗治療丙型肝炎病毒感染患者.目前，Santaris制藥A／S公司推動兩種m RNA靶向性藥物，即靶向PCSK9的SPC5001和靶向apoB的SPC4955在2011年上半年進入I期臨床試驗治療高膽固醇患者.2012年8月，來自英國的公司Silence制藥因其獨特的miRNA藥物技術獲得一次合作的機會，澳大利亞的研發(fā)公司MiReven希望Silence的技術可以被應用于抗癌藥物miR-7上，這一藥物被認為能夠沉默誘發(fā)癌癥的罪魁禍首——表皮生長因子受體.

在我國，小核酸藥物產業(yè)主要是海外歸國創(chuàng)業(yè)人員為主體的企業(yè)（海歸創(chuàng)業(yè)企業(yè)）主導的，主要分布在長三角地區(qū)，其中，75%以上集中在江蘇省.具有一定規(guī)模和實力的企業(yè)包括：①吉康生物技術有限公司，已開發(fā)出全球第一款基于RNAi技術的商業(yè)化產品——泊爾亭娜，并獲得了國家食品藥品監(jiān)查局的特殊功效化妝品的批文，防治各類活性色斑的有效率高達90%［51-52］；2014年，又相繼完成了治療黃褐斑的siRNA藥物的臨床前試驗，包括原料和制劑的生產工藝，原料和制劑的化學組成和結構，原料和制劑的質量標準，原料和制劑的穩(wěn)定性，大小動物體內藥效學和毒理學以及安全性（致畸變、治過敏和致腫瘤）等研究，正在申請一類新藥的臨床研究；②博奧邁科生物技術有限公司，主要從事治療AMD眼病的siRNA藥物的藥效學和治療乙肝和肝癌的siRNA藥物的藥效學研究和大規(guī)模的siRNA合成；③蘇州圣諾生物醫(yī)藥技術公司，致力于用于改善皮膚傷口愈合使傷口愈合后的疤痕最小化，用于呼吸道流感病毒感染的治療和用于治療HPV感染／宮頸癌的小RNA藥物的研究；④蘇州瑞博生物技術有限公司，從事小核酸設計、穩(wěn)定化、合成、代謝等研究，尤其在小核酸液相合成方面，抗脂肪肝小核酸藥物、抗視神經(jīng)病變小核酸藥物（QP1-1007）、抗EV71的小核酸藥物研發(fā)以及防治類風濕性關節(jié)炎（RA）的小核酸藥物研究；⑤上海吉凱基因化學技術有限公司和廣州銳博生物技術公司，主要提供化學合成siRNA產品，從事RNAi產品生產和研發(fā)服務；⑥上海吉瑪制藥技術有限公司，從事siRNA化學合成和RNA單體合成技術、普通和修飾的siRNA oligo合成技術、核酸熒光標記技術、多種核苷酸化學修飾技術和shRNA質粒載體構建技術，慢病毒載體構建以及包裝技術、micro RNA熒光定量PCR檢測試劑盒的研發(fā).在國家863、創(chuàng)新藥物重大專項、地方科技項目和一些大公司的資助下，我國的小核酸技術和藥物的研發(fā)已具備了一定基礎條件、設備儀器和技術平臺.在此基礎上，應進一步建立基于機理的理性siRNA藥物高通量篩選和設計技術平臺；建立安全有效的靶向小RNA分子的運載系統(tǒng)，建立規(guī)?；铣筛咝Х€(wěn)定的siRNA（如閉鎖核酸）藥物的生產工藝，建立小核酸藥物安全評價技術平臺、小核酸新藥臨床評價研究技術平臺、具有持續(xù)研發(fā)能力的siRNA藥物創(chuàng)新技術平臺以及小核酸原料藥的質量標準等.這樣才能在小RNA藥物領域趕超世界先進水平和保持我國的優(yōu)勢所在，在未來的歲月中，打造我國的sRNA藥物航空母艦，豎起引領國際小RNA藥物的標桿，有可能在國際上研發(fā)出第一個和多個sRNA藥物.

5 問題和展望

隨著小RNA調控機制研究的不斷深入和RNA沉默技術應用的逐漸展開，小RNA作為一種高效實用的基因功能研究方法和天然生物的活性成分，預示著一個嶄新的小RNA基因藥時代遲早會到來.這種造藥模式比現(xiàn)有的化藥制作更簡單實用，且其靶域更寬廣.如化藥的靶子往往是酶和受體，可用于5 000～10 000個蛋白活性中心的抑制，而人體實際上有30 000多個可引起疾病的蛋白.可見小RNA基因藥物與普通藥物相比，具有更好的應用前景.再者，小RNA基因藥物非常高效，極少量的小RNA分子或其抑制劑就能使相關的靶分子沉默.近年來各種修飾技術的出現(xiàn)，如甲氧和乙氧等化學修飾使小RNA脫靶效應明顯降低［7-8］，分子結構穩(wěn)定性大大提高，通過血液系統(tǒng)給藥成為可能.

研究表明，小RNA基因藥物在自然界已被多種生物用來抵抗病毒遺傳物質的侵擾，如植物細胞利用這種制藥模式來抵抗枯草病毒的繁殖，于是科學家們自然想到，這種小RNA基因藥物有望用于各種病毒引起的人類疾病的防治，如肝炎、艾滋病和腫瘤等，隨著技術的進步和完善，小RNA基因藥物也可能用來治療人體的其他疾病，如心肌梗塞和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等.可以預見，在全球各大生物技術公司堅持不懈的努力下，小RNA技術逐步完善，尤其是給藥系統(tǒng)的創(chuàng)新后，會再次推出利用小RNA藥物治療人類疾病的各種研發(fā)項目.如2014年，研究者在癌癥患者體內直接導入特定miRNA，阻斷癌癥細胞發(fā)育，從而達到根治腫瘤的目的.具估計，該技術可能產生多種銷售額達數(shù)十億美元的新藥.

對小RNA基因藥物的研發(fā)熱情已促使這種藥

物以很快的速度進入臨床試驗階段，但目前大部分小RNA基因藥物的研究仍然停留在早期開發(fā)階段——臨床前研究階段.雖然已解決了一些問題，如干擾素效應、飽和效應和脫靶效應等［53-56］，但還有很多的難題和障礙需要解決.主要難題有兩個：其一是本文已提到的靶向型高效傳遞系統(tǒng)，這一問題解決之日，就是小RNA基因藥物蓬勃發(fā)展之時；其二是藥物效率，尤其是希望通過靶基因的抑制而達到摧毀或完全抑制宿主細胞的目的，如治療腫瘤.這預示著小RNA基因藥物批量進入市場還有很長的路要走，有待各方面的共同努力，如政府和社會的政策和與資金的長期穩(wěn)定支持、研究人員的技術創(chuàng)新和不懈努力、相關高級人才的培養(yǎng)和使用以及制藥公司的膽識和長遠規(guī)劃.可以預見，一個制造小RNA基因藥物的公司巨人總有一天會出現(xiàn).

［1］ Fire A，Xu S，Montgomery M K，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391：806-811.

［2］ Davidson B L，McCray Jr P B.Current prospects for RNA interference-based therapies［J］.Nat Rev Genet，2011，12：329-340.

［3］ Yin J Q，Wan Y.RNA-mediated gene regulation system：Now and the future［J］.Int J Mol Med，2002，10（4）：355-365.

［4］ Chen F，Yin J Q.miRNA regulating expression of genes［J］.Science Bulletin，2005，50（13）：1289-1299.

［5］ Jackson A L，Bartz S R，Schelter J，et al.Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi［J］.Nat Biotechnol，2003，21：635-637.

［6］ Karpala A J，Doran T J，Bean A G.Immune responses to ds RNA：Implications for gene silencing technologies［J］.Immunol Cell Biol，2005，83：211-216.

［7］ Scaggiante B，Dapas B，F(xiàn)arra R.Improving siRNA bio-distribution and minimizing side effects［J］.Curr Drug Metab，2011，12（1）：11-23.

［8］ Singh S，Narang A S，Mahato R I.Subcellular fate and off-target effects of siRNA，sh RNA and miRNA［J］. Pharm Res，2011，28（12）：2996-3015.

［9］ Yin J Q，Zhao R C.Identifying expression of new small RNAs by microarrays［J］.Methods，2007，43（2）：123-130.

［10］ Watanabe T，Totoki Y，Toyoda A，et al.Endogenous siRNAs from naturally formed dsRNAs regulate transcripts in mouse oocytes［J］.Nature，2008，453：539-543.

［11］ Friedman R C，F(xiàn)arh K K，Burge C B，et al.Most mammalian m RNAs are conserved targets of micro-RNAs［J］.Genome Res，2009，19（1）：92-105.

［12］ Yi R，Qin Y，Macara I G，et al.Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs［J］.Genes Dev，2003，17（24）：3011-3016.

［13］ Lee Y S，Nakahara K，Pham J W，et al.Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA／miRNA silencing pathways［J］.Cell，2004，117（1）：69-81.

［14］ Meister G，Landthaler M，Patkaniowska A，et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs［J］.Mol Cell，2004，15（2）：185-197.

［15］ Bartel D P.MicroRNAs：Target recognition and regulatory functions［J］.Cell，2009，136（2）：215-233.

［16］ Doench J G，Sharp P A.Specificity of microRNA target selection in translational repression［J］.Genes Dev，2004，18（5）：504-511.

［17］ Denli A M，Tops B B，Plasterk R H，et al.Processing of primary micro RNAs by the microprocessor complex［J］.Nature，2004，432（7014）：231-235.

［18］ Guo H，Ingolia N T，Weissman J S，et al.Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target m RNA levels［J］.Nature，2010，466（7308）：835-840.

［19］ Nguyen T T，Brenu E W，Staines D R，et al.Micro-RNAs in the intracellular space，regulation of organelle specific pathways in health and disease［J］.Microrna，2015，3（2）：98-107.

［20］ Vasudevan S，Tong Y，Steitz J A.Switching from repression to activation：MicroRNAs can up-regulate translation［J］.Science，2007，318（5858）：1931-1934.

［21］ Li M A，He L.microRNAs as novel regulators of stem cell pluripotency and somatic cell reprogramming［J］.Bioessays，2012，34（8）：670-680.

［22］ Lipchina I，Studer L，Betel D.The expanding role of miR-302-367 in pluripotency and reprogramming［J］. Cell Cycle，2012，11（8）：1517-1523.

［23］ Spierings D C，McGoldrick D，Hamilton-Easton A M. et al.Ordered progression of stage-specific miRNA profiles in the mouse B2 B-cell lineage［J］.Blood，2011，117（20）：5340-5349.

［24］ Lu T Y，Lin B，Li Y，et al.Overexpression of micro-RNA-1 promotes cardiomyocyte commitment from human cardiovascular progenitors via suppressing WNT and FGF signaling pathways［J］.J Mol Cell Cardiol，2013，63：146-154.

［25］ Lu J，Getz G，Miska E A，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers［J］.Nature，2005，435（7043）：834-838.

［26］ Lin H，Michael T J，Hemann M T，et al.A microRNA polycistron as a potential human oncogene［J］. Nature，2005，435（7043）：828-833.

［27］ Esquela-Kerscher A，Slack F J.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer［J］.Nat Rev Cancer，2006，6（4）：259-269.

［28］ Cheng C J，Bahal R，Babar I A，et al.MicroRNA silencing for cancer therapy targeted to the tumour microenvironment［J］.Nature，2014，518：107-110.

［29］ Park E Y，Chang E，Lee E J，et al.Targeting of miR34a-NOTCH1 axis reduced breast cancer stemness and chemoresistance［J］.Cancer Res，2014，74（24）：7573-7582.

［30］ Srivastava A，F(xiàn)ilant J，Moxley K M，et al.Exosomes：A role for naturally occurring nanovesicles in cancer growth，diagnosis and treatment［J］.Curr Gene Ther，DOI：10.1007／s00018-014-1811-0，2014（published online）.

［31］ Clancy C，Joyce M R，Kerin M J.The use of circulating microRNAs as diagnostic biomarkers in colorectal cancer［J］.Cancer Biomark，DOI：10.3233／CBM-140456，2014（published online）.

［32］ Penfornis P，Vallabhaneni K，Whitt J，et al.Extracellular vesicles as carriers of microRNA，proteins and lipids in tumor microenvironment［J］.Int J Cancer，DOI：10.1002／ijc.29417，2015（published online）.

［33］ Valadi H，Ekstr?m K，Bossios A，et al.Exosomemediated transfer of m RNAs and microRNAs is a novel mechanismof genetic exchange between cells［J］. Nat Cell Biol，2007，9（6）：654-659.

［34］ Choi D S，Kim D K，Kim Y K，et al.Proteomics，transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes［J］.Proteomics，2013：13（10-11）：1554-1571.

［35］ Nishida-Aoki N，Ochiya T.Interactions between cancer cells and normal cells via miRNAs in extracellular vesicles［J］.Cell Mol Life Sci，DOI：10.1007／s00018-014-1811-0，2015（published online）.

［36］ Wolfrum C，Shi S，Jayaprakash K N，et al.Mechanisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs［J］.Nat Biotechnol，2007，25（10）：1149-1157.

［37］ Gosselin M A，Lee R J.Folate receptor-targeted liposomes as vectors for therapeutic agents［J］.Biotechnol Annu Rev，2002，8：103-131.

［38］ Alvarez-Erviti L，Seow Y，Yin H，et al.Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes［J］.Nat Biotechnol，2011，29（4）：341-345.

［39］ Soutschek J，Akinc A，Bramlage B，et al.Therapeuticsilencing of an endogenous gene by systemic administration of modified Chol-siRNAs［J］.Nature，2004，432（7014）：173-178.

［40］ Nishina K，Unno T，Uno Y，et al.Efficient in vivo delivery of siRNA to the liver by conjugation of alphatocopherol［J］.Mol Ther，2008，16（4）：734-740.

［41］ Schiffelers R M，Ansari A，Xu J，et al.Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle［J］.Nucleic Acids Res，2004，32（19）：e149.

［42］ Dickerson E B，Blackburn W H，Smith M H，et al. Chemosensitization of cancer cells by siRNA using targeted nanogel delivery［J］.BMC Cancer，2010，10：10.

［43］ Chu T C，Twu K Y，Ellington A D，et al.Aptamer mediated siRNA delivery［J］.Nucleic Acids Res，2006，34（10）：e73.

［44］ Shim M S，Kwon Y J.Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo［J］.FEBS J，2010，277（23）：4814-4827.

［45］ Jeong J H，Mok H，Oh Y K，et al.siRNA conjugate delivery systems［J］.Bioconjug Chem，2009，20（1）：5-14.

［46］ Ikeda Y，Taira K.Ligand-targeted delivery of therapeutic siRNA［J］.Pharm Res，2006，23（8）：1631-1640.

［47］ Cesarone G，Edupuganti O P，ChenC P，et al.Insulin receptor substrate 1 knockdown in human MCF7 ER+breast cancer cells by nuclease-resistant IRS1 siRNA conjugated to a disulfide-bridged D-peptide analogue of insulin-like growth factor 1［J］.Bioconjug Chem，2007，18（6）：1831-1840.

［48］ Kim S H，Mok H，Jeong J H，et al.Comparative evaluation of target-specific GFP gene silencing efficiencies for antisense ODN，synthetic siRNA，and siRNA plasmid complexed with PEI-PEG-FOL conjugate［J］.Bioconjug Chem，2006，17（1）：241-244.

［49］ Kumar P，Wu H，McBride J L，et al.Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system［J］.Nature，2007，448（7149）：39-43.

［50］ 張洪杰，殷勤偉.細胞穿透肽及其結構改造在siRNA傳遞中的應用［J］.Prog Biochem Biophys，2012，39（5）：402-409.

［51］ 張洪杰，殷勤偉.基于RNAi技術產品的商業(yè)化［J］.生物產業(yè)技術，2011，4：201-208.

［52］ Yi X，Zhao G，Zhang H，et al.MITF-siRNA formulation is a safe and effective therapy for human melasma［J］.Mol Ther，2011，19（2）：362-371.

［53］ Anderson E M，Birmingham A，Baskerville S，et al. Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity［J］.RNA，2008，14（5）：853-861.

［54］ Khvorova A，Reynolds A，Jayasena S D.Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias［J］.Cell，2003，115（2）：209-216.

［55］ Chen P Y，Weinmann L，Gaidatzis D，et al.Strandspecific 5’-O-methylation of siRNA duplexes controls guide strand selection and targeting specificity［J］. RNA，2008，14（2）：263-274.

［56］ Chalk A M，Sonnhammer E L.siRNA specificity searching in-corporating mismatch tolerance data［J］. Bioinformatics，2008，24（10）：1316-1317.

（編輯 呂丹）

Status Quo and Perspective of Small RNA Gene Medicine Research and Development

WANG Shan-shan1， YI Ba-xian2， YIN Qin-wei1
（1.Translational Center，The General Military Hospital of Beijing，Beijing 100700，China；2.China State Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 200040，China）

The key components of RNAi technology include siRNA，miRNA，sh RNA and dsRNA.Owing to their high specificity and efficiency in the knockdown of target genes specific for diseases，RNAi technology has turned out to be a promising strategic platform for the development of new drugs in future. However，through more than one decade of research and development，it has become clear that the industrialization of this revolutionary technology is full of different challenges.The review has summarized present conditions，related problems and future trends.

small RNA；gene medicine；research development

R 394；Q 52

A

1671-7333（2015）01-0001-08

10.3969／j.issn.1671-7333.2015.01.001

2015-01-23

王姍姍（1981-），女，助理研究員，主要研究方向為小RNA誘導干細胞轉分化等.E-mail：Wangss_2007＠yahoo.com.cn

殷勤偉（1956-），男，教授，博士生導師，主要研究方向為生物信息學、功能基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和小RNA組學等. E-mail：jamesyin2010＠126.com