李睿歆，姚婷婷，劉昀昀，謝慶生，謝曉飛，梁金曉，林仲秋

宮頸癌作為最常見的婦科惡性腫瘤，其早期篩查的推廣、手術(shù)放化療的綜合應(yīng)用提高了患者的生存率，但腫瘤轉(zhuǎn)移仍是影響預(yù)后的重要因素。在一些腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的過程中，上皮細(xì)胞顯示出了間質(zhì)細(xì)胞的特性，即發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT），從而脫離原發(fā)灶，形成局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的眾多因子中，Hes1（hairy and enhancer of split 1）影響骨肉瘤、胰腺癌[2-3]細(xì)胞的侵襲，且可導(dǎo)致胃癌、乳腺癌[4-5]細(xì)胞的EMT。在宮頸癌SiHa細(xì)胞中Hes1有促進增殖、抑制分化的作用[6]，但其對宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲的作用尚無定論。本實驗主要針對Hes1對宮頸SiHa、HeLa細(xì)胞的遷移、侵襲能力的影響及導(dǎo)致該影響的可能機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌細(xì)胞株SiHa、HeLa、C33A、CaSki由中科院上海細(xì)胞庫購入。低限基本培養(yǎng)基MEM培養(yǎng)基、改良型1640培養(yǎng)基（Hyclone），胎牛血清（BI，百旺），opti-MEM（Hyclone），Hes1小干擾 RNA （siRNA，上海吉瑪制藥），LiPofectamine 2000試劑（Invitrogen），Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBERⅡ、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物（TAKALA），Hes1抗體（Abcam），EMT 抗體（CST），Transwell小室（濾膜孔徑 8 μm，Corning），基質(zhì)膠（BD）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SiHa、HeLa、C33A細(xì)胞在含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，CaSki細(xì)胞在含10%胎牛血清的改良型1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 siRNA下調(diào)Hes1按siRNA及LiPofectamine 2000試劑說明書，將待轉(zhuǎn)序列或陰性對照序列混合，室溫反應(yīng)5 min后加入6孔板中，48 h后收集細(xì)胞提取RNA、蛋白，或16 h后種入小室。Hes1備選下調(diào)序列有3條，見表1。

表1 Hes1備選下調(diào)序列及對照序列引物

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測 常規(guī)提取細(xì)胞總RNA、逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，在BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR儀器進行擴增。PCR反應(yīng)條件為：95℃變性5 s，60 ℃延伸 30 s，循環(huán) 40 次后，根據(jù)結(jié)果統(tǒng)計分析。3′-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，引物序列見表2。實驗獨立重復(fù)3次。

表2 引物序列

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測 常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白及定量，8%、10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚乙酰凝膠分別電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙基（PVDF）膜，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，4℃搖床一抗孵育過夜，山羊抗兔、抗鼠二抗室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光免疫（ECL）法顯影，SYNGENE Chemi XT4曝光機曝光。β-actin為內(nèi)參。

1.2.5 遷移實驗 6孔板中各組細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)16 h后，轉(zhuǎn)入24孔板中行遷移實驗。200 μL細(xì)胞懸液加入上室，600 μL含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基加入下室。SiHa及HeLa細(xì)胞數(shù)量分別為4×104個/孔、8.5×104個/孔。置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色10 min，棉簽擦去未穿過膜的細(xì)胞。Nikon Ti-S顯微鏡400倍鏡下計數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)。每個濾膜選取5個視野。每組實驗設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.6 侵襲實驗 基質(zhì)膠與無血清MEM培養(yǎng)基1∶9混合，每小室加入100μL混合膠，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中凝固4h，吸出膠析出的上清液。上室加入200 μL細(xì)胞的懸液，下室加入600 μL含20%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后固定染色計數(shù)。SiHa及HeLa細(xì)胞數(shù)量分別為3×104個/孔、8.5×104個/孔。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。PCR數(shù)據(jù)：EMT主要相關(guān)分子符合正態(tài)分布和方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗；Hes1符合正態(tài)分布，但方差不齊，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，2組間采用t′檢驗。遷移、侵襲數(shù)據(jù)采用t檢驗分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hes1 mRNA、蛋白在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)Hes1 mRNA 在 SiHa、HeLa、C33A 和 Caski細(xì)胞系中表達(dá)的 2-ΔΔCT值分別為 18.17±0.57、3.07±0.19、23.43±0.19、1.00±0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.390，P=0.016）。與宮頸癌轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞CaSki比較，非轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞SiHa、C33A中Hes1 mRNA表達(dá)均升高（均P＜0.05）。Hes1蛋白表達(dá)也呈現(xiàn)出相同趨勢，蛋白質(zhì)印跡檢測可見SiHa、C33A細(xì)胞的Hes1條帶較CaSki細(xì)胞的Hes1條帶灰度升高，即Hes1蛋白表達(dá)量升高，見圖1。

圖1 Hes1蛋白在4種宮頸癌各細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2 篩選Hes1下調(diào)序列 SiHa、HeLa細(xì)胞分別分為空白對照（0）、陰性對照（NC）、序列（1、2、3）組，瞬轉(zhuǎn)后檢測Hes1下調(diào)情況。SiHa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞Hes1 mRNA表達(dá)量5組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。SiHa細(xì)胞中序列1組與0組、NC組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。序列2組、序列3組與0組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；但與NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。HeLa細(xì)胞中序列1組、2組、3組與0組、NC組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。3組下調(diào)序列中，僅序列1組Hes1條帶灰度明顯降低，表現(xiàn)出對SiHa、HeLa細(xì)胞Hes1蛋白表達(dá)的抑制作用，見圖2。結(jié)合PCR結(jié)果，選擇序列1進行后續(xù)實驗。

表3 siRNA對SiHa、HeLa細(xì)胞Hes1 mRNA 表達(dá)量的抑制 （±s）

表3 siRNA對SiHa、HeLa細(xì)胞Hes1 mRNA 表達(dá)量的抑制 （±s）

組別 n SiHa 2-ΔΔCT值 HeLa2-ΔΔCT值0 組 3 1.00±0.01 1.00±0.01 NC 組 3 0.65±0.01 1.00±0.02序列 1 組 3 0.13±0.01 0.15±0.02序列 2 組 3 0.56±0.05 0.63±0.13序列 3 組 3 0.70±0.03 0.87±0.03 χ2 12.100 12.370 P 0.017 0.015

圖2 siRNA抑制SiHa、HeLa細(xì)胞Hes1蛋白表達(dá)

2.3 遷移、侵襲實驗結(jié)果 SiHa、HeLa細(xì)胞分別分NC組和下調(diào)序列1組。顯微鏡下可見，兩細(xì)胞系下調(diào)序列組的遷移、侵襲能力，均較NC組增強。遷移實驗和侵襲實驗顯示，穿膜細(xì)胞數(shù)SiHa NC組與SiHa 1組、HeLa NC組與HeLa 1組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表 4。

表4 下調(diào)Hes1對SiHa、HeLa細(xì)胞遷移、侵襲能力的抑制 （±s）

表4 下調(diào)Hes1對SiHa、HeLa細(xì)胞遷移、侵襲能力的抑制 （±s）

組別 n SiHa細(xì)胞 HeLa細(xì)胞遷移 NC 3 74.33±2.96 57.50±4.17遷移 1 3 157.67±3.84 95.00±3.87 t（P）17.170（＜0.001）6.590（＜0.001）侵襲 NC 3 54.67±0.88 86.67±2.91侵襲 1 3 152.67±4.91 162.00±2.30 t（P）19.640（0.001）20.300（＜0.001）

2.4 Hes1下調(diào)后EMT相關(guān)分子改變的檢測SiHa、HeLa細(xì)胞分別分為0組、NC組、下調(diào)序列1組，PCR、蛋白質(zhì)印跡檢測EMT相關(guān)分子的表達(dá)。PCR結(jié)果顯示：SiHa及HeLa的E-cadherin表達(dá)量均減少（均 P＜0.05），SiHa細(xì)胞 ZEB1、Slug表達(dá)量增加（均 P＜0.05）；HeLa細(xì)胞 vimentin、Slug表達(dá)量增加（均P＜0.05），見表5。與PCR結(jié)果趨勢相同，蛋白質(zhì)印跡中EMT相關(guān)分子條帶的灰度，即蛋白表達(dá)量也發(fā)生了相應(yīng)的變化，見圖3。

表5 下調(diào)Hes1對SiHa、HeLa細(xì)胞中EMT相關(guān)分子mRNA的影響 （±s）

表5 下調(diào)Hes1對SiHa、HeLa細(xì)胞中EMT相關(guān)分子mRNA的影響 （±s）

組別 n E-cadherin ZEB1 Slug SiHa 0 組 3 1.00±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01 NC 組 3 1.02±0.01 0.96±0.07 1.10±0.21序列 1 組 3 0.21±0.01 1.62±0.09 1.85±0.18 F 1693.250 32.690 8.190 P ＜0.001 0.010 0.019組別 n E-cadherin vimentin Slug HeLa 0 組 3 1.00±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01 NC 組 3 1.09±0.13 1.16±0.11 1.14±0.05序列 1 組 3 0.32±0.07 2.05±0.12 1.77±0.06 F 21.700 37.530 76.480 P 0.002 ＜0.001 ＜0.001

圖3 下調(diào)Hes1誘導(dǎo)SiHa、HeLa細(xì)胞發(fā)生EMT

3 討論

宮頸癌轉(zhuǎn)移是制約治療，影響患者預(yù)后及生存的重要因素。為此，研究宮頸癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，對宮頸癌治療、減少復(fù)發(fā)、改善生存有重要意義。

Hes1為宮頸癌組織中高表達(dá)的一種分子[7]，為Notch通路下游轉(zhuǎn)錄因子，通路激活后通過一系列分子間相互作用，激活Hes1，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移、侵襲過程[6,8]。有研究表明Hes1對宮頸癌SiHa細(xì)胞有促進增殖、抑制分化的作用[6]，但其與宮頸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚少見文獻報道。

3.1 Hes1的表達(dá)可能與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān) 本實驗中各細(xì)胞系Hes1表達(dá)量比較，宮頸癌的非轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞系SiHa、HeLa、C33A中Hes1表達(dá)均高于轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞系CaSki，與文獻結(jié)果一致[9]，推測宮頸癌中Hes1下調(diào)后可能促進轉(zhuǎn)移。文獻報道：在胰腺癌細(xì)胞中，下調(diào)前列腺腫瘤高表達(dá)蛋白1（PTOV-1）會引起Hes1的表達(dá)增高，進而延遲體外實驗中轉(zhuǎn)移瘤的形成[3]。

Hes1在結(jié)腸癌、口腔鱗癌[9-10]等腫瘤中均為高表達(dá)，且表現(xiàn)為在結(jié)腸癌中原發(fā)灶細(xì)胞表達(dá)量高于轉(zhuǎn)移灶[9]，這和本研究結(jié)果一致。提示宮頸癌細(xì)胞中，Hes1的表達(dá)抑制可能與腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)。

3.2 下調(diào)Hes1增強了細(xì)胞的遷移、侵襲 進一步的Transwell實驗結(jié)果顯示，瞬轉(zhuǎn)下調(diào)Hes1后，宮頸癌SiHa、HeLa細(xì)胞的遷移、侵襲能力增強，即Hes1可能有抑制宮頸癌SiHa、HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。在胰腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中，Hes1和核心結(jié)合因子Runx2協(xié)同激活成骨特異性基因，從而導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[11]。在T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病γ-分泌酶敏感的細(xì)胞系中，Hes1負(fù)性調(diào)控第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因/磷脂酰肌醇 3 激酶/蛋白激酶 B（PTEN/PI3K/Akt）通路，參與腫瘤細(xì)胞的浸潤侵襲[12]。Hes1可能通過何種機制調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲，目前尚不清楚。

3.3 Hes1與EMT 腫瘤的轉(zhuǎn)移表現(xiàn)為黏附、遷移、侵襲的過程，在此過程中一些上皮源性腫瘤細(xì)胞喪失細(xì)胞極性，細(xì)胞之間連接變得松散，即發(fā)生了EMT，使得腫瘤利于轉(zhuǎn)移。有文獻報道Hes1表達(dá)水平的改變會引起EMT相關(guān)分子表達(dá)的改變，從而影響腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力。

本實驗驗證了宮頸癌中Hes1對EMT相關(guān)分子的影響。下調(diào)Hes1分子后，SiHa細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)量減少，ZEB1、Slug表達(dá)量增加；HeLa細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)量減少，Slug、vimentin表達(dá)量增加，均發(fā)生了EMT。有文獻指出，在原發(fā)性肝癌中發(fā)生了EMT，并通過上調(diào)Snail、SIP1，增加基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1/2/7表達(dá)，降解胞外基質(zhì)蛋白，促進細(xì)胞遷移、侵襲[13]。在胃癌中，γ-分泌酶抑制劑抑制了Hes1的表達(dá)，E-cadherin 表達(dá)量增加，N-cadherin、Snail、vimentin表達(dá)量減少[4]。鑒于Hes1受Notch通路、Shh通路[14]、微小 RNA（miRNA）[15]等多種方式調(diào)控，又可對上游分子產(chǎn)生負(fù)反饋作用[16]，在不同腫瘤中占主導(dǎo)地位的調(diào)控方式不同，可能導(dǎo)致了Hes1調(diào)控EMT相關(guān)分子方向的不同。因此推測宮頸癌細(xì)胞中Hes1的表達(dá)抑制介導(dǎo)了EMT，可能為導(dǎo)致遷移、侵襲能力增強的原因。

本實驗中Hes1的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力呈負(fù)相關(guān)，其在組織中表達(dá)與患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移情況的研究尚少有文獻報道，相關(guān)隨訪結(jié)果可以為評估轉(zhuǎn)移發(fā)生的可能性提供依據(jù)，進而為后續(xù)治療方案的確定提供參考。此外，Hes1在細(xì)胞水平上抑制轉(zhuǎn)移作用，為晚期患者的治療提供了一個靶點。有文獻報道找到了調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞Hes1的藥物[17]，其相應(yīng)動物實驗值得進一步深入研究。

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