胡向陽，林春淑，李安，楊璇

·藥理毒理·

崗梅根水煎液對束縛應(yīng)激條件下非酒精性脂肪肝大鼠脂肪酸代謝的作用

胡向陽，林春淑，李安，楊璇

目的：觀察崗梅根水煎液對束縛應(yīng)激條件下非酒精性脂肪肝大鼠脂肪酸代謝的影響。方法：將48只Wistar雄性大鼠隨機分為4組:正常對照組、模型對照組、辛伐他汀組、崗梅根水煎液組，建立高脂飲食性脂肪肝模型，并給予束縛應(yīng)激負荷。采用酶比色法測定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C；氣相色譜-質(zhì)譜法測定血清TFA、SFA、UFA、MUFA、PUFA；RT-PCR檢測肝臟L-FABPmRNA、CPT-1mRNA和ACC-1mRNA的表達。結(jié)果：與正常對照組比較，模型對照組TC、TG、LDL-C、肝臟指數(shù)、SFA、ACC-1mRNA表達量均顯著升高(P＜0.01），HDL-C、TFA、UFA、MUFA、PUFA、L-FABPα mRNA、CPT-1mRNA表達量均有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05）。與模型對照組比較, 崗梅根水煎液組和辛伐他汀組TC、TG、LDL-C、肝臟指數(shù)、SFA、ACC-1mRNA表達量均有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05），HDL-C、TFA、L-FABPαmRNA、CPT-1mRNA表達量均有不同程度的升高(P＜0.01或P＜0.05）。與辛伐他汀組比較，崗梅根水煎液組TC、MUFA含量CPT-1mRNA表達量升高(P＜0.05)，SFA含量、ACC-1mRNA表達量降低(P＜0.05)。結(jié)論：崗梅根水煎液對束縛應(yīng)激條件下非酒精性脂肪肝大鼠脂肪酸代謝有干預(yù)作用。

崗梅根；束縛應(yīng)激；脂肪肝；脂肪酸代謝

非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病，研究認為高脂飲食和情緒應(yīng)激在發(fā)病中起重要作用。當前，隨著我國經(jīng)濟社會的變革，人們生產(chǎn)活動趨向于自動化、信息化，導致體力勞動減少，生活節(jié)奏加快，心理應(yīng)激事件增加，加上熬夜、高脂飲食、久坐等不良習慣，NAFLD的患病率和檢出率逐漸升高，并趨向低齡化，已經(jīng)成為危害人類健康的常見慢性疾病之一[1～2]。尋求防治NAFLD的有效方法是當前研究的熱點。中醫(yī)學認為，多食膏脂之人易于肥胖，情志抑郁引起“肝郁”，脂肪肝的發(fā)病多因嗜食肥甘厚味，體豐痰盛，或情志失常，憂思郁怒傷肝，致使“痰濁瘀毒”郁結(jié)于肝臟?；谥嗅t(yī)對NAFLD的理論認識，清熱解毒類中藥是重要的探索方向。崗梅根是冬青科植物梅葉冬青[Ilex asprella (Hook.f. Et Arn. )Champ.ex Benth]的根，其味苦性寒，具有清熱解毒、生津活血之功效。崗梅根為嶺南地區(qū)的道地藥材，是王老吉涼茶、沙溪涼茶等廣式?jīng)霾璧闹饕稀，F(xiàn)代藥理研究表明，崗梅根具有抗炎、抗病毒、抗菌和抗應(yīng)激等作用[3～4]。本研究擬在脂肪肝中醫(yī)理論認識基礎(chǔ)上，遵行傳統(tǒng)的水煎液用藥方式，觀察崗梅根水煎液對束縛應(yīng)激條件下非酒精性脂肪肝大鼠脂肪酸代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，SPF 級，雄性，體重200±20g，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：粵檢證字2010B309，室溫適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于本實驗。

1.2 實驗藥物

辛伐他汀(商品名:舒降之)，杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)，批準文號H19990366，20 mg/片，產(chǎn)品批次：105664，臨用前以生理鹽水溶解濃度為1 mg．mL-1。崗梅根飲片由廣東省中醫(yī)院提供，水煎液制備：崗梅根5.0 kg，以每克生藥加水6 mL，冷水浸泡40 min后，開始武火煎煮，煮沸后用文火慢煎30 min，趁熱過濾。煎煮第二遍按每克生藥加水4 mL，煎法同上，合并濾液。60℃恒溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮為含生藥3.14 g．mL-1的水煎液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器

膽固醇、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶（廣州天馬精細化工廠）。膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)(南京建成生物試劑公司)。Trizol(鵬程生物

技術(shù)有限公司)，RT-PCR試劑盒{北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司）。DY89-I型電動玻璃勻漿機(寧波新芝)，722S可見分光光度計(上海精密科學儀器有限責任公司)，AU600型全自動生化分析儀(日本OLYMPUS)，HP6890N-5973安捷倫氣-質(zhì)聯(lián)用儀（美國惠普公司），SmartSpecTM Plus核酸蛋白檢測儀(BIO-RAD)。

1.4 動物分組

Wistar大鼠48只，數(shù)字隨機分組法分為4組，即正常對照組、模型對照組、辛伐他汀組、崗梅根水煎液組。

1.5 動物模型制備

各模型組分別給予高脂飲食(3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料)；正常對照組給予普通飲食。在此基礎(chǔ)上，崗梅根水煎液組灌服劑量為 9.15 g．kg-1d-1，辛伐他汀組灌服劑量為10 mg．kg-1d-1；對照組和模型組給予等體積的生理鹽水。參照文獻[5]方法，除正常對照組外，其余各組大鼠在給藥后2 h，放進大鼠束縛裝置，束縛應(yīng)激負荷8 h．d-1，束縛應(yīng)激期間大鼠禁食禁水。連續(xù)8周。

1.6 指標檢測

從造模開始算，第8周末當晚大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射麻醉，打開腹腔，采用真空采血管腹主動脈取血，血樣4℃靜置2 h后，3000 rmp離心10 min，分離血清，分裝EP管，-80℃保存。游離并提取肝臟，4℃生理鹽水沖洗，去除薄膜，稱肝濕重，用以計算肝指數(shù)，肝指數(shù)（%）=肝濕重/體重× 100%。冰盤上剪取一小塊肝葉，剪碎，移入玻璃勻漿器，加入預(yù)冷的生理鹽水，用玻璃勻漿器仔細研磨，制備10%肝組織勻漿，3500 r．min-1離心10 min，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用酶比色法在全自動生化分析儀測定TC、TG、HDL-C、LDL-C，操作步驟按照試劑盒說明書進行。氣相色譜-質(zhì)譜(Gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)法測定了血清總脂肪酸(Totalfatty acid,TFA）、飽和脂肪酸（Saturated fatty acid,SFA）、不飽和脂肪酸(Unsaturated fatty acid,UFA)、單不飽和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid,MUFA)和多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的含量。Primer premier5軟件進行肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(Liver fatty acid binding protein,LFABP)、肉堿棕擱酞轉(zhuǎn)移酶-l(Camitine palmitoy l transferasel,CPT-1)和乙酰輔酶A羧化酶-1(Acety l-CoA carboxylase,ACC-1)基因引物設(shè)計，序列L-FABP：F:5'-CTCATTGCCACCATGAACTTCTC-3'，R:5'-AGCC-TTGTCTAAATTCTCTTGCTGACT-3'；CPT-1:F:5'-TCCATGCATACC-AAAGTG-GA-3'，R:5'-TCATCAGTGGCCTCACAGAC-3'；ACC-1：F:5'-AGG ACT TCATGA- ATTTGC TG-3'，R:5'-GTCATCACCATCTTCATTACCTCA-3'。合成由上海生工生物工程技術(shù)公司完成，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測肝臟L-FABPmRNA、CPT-1mRNA和ACC-1mRNA的表達。

1.7 統(tǒng)計學處理

使用SPSS14.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行重復(fù)測量資料的方差分析，定量指標以 (±S)表示，方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清血脂及肝指數(shù)情況變化

與正常對照組比較，各組大鼠血清T C、TG、LDL-C含量均有不同程度的升高(P＜0.01或P＜0.05）；模型對照組HDL-C含量降低（P＜0.05），肝指數(shù)升高（P＜0.05）。與模型對照組比較, 辛伐他汀組、崗梅根水煎液組TC、TG、LDL-C含量均有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05)，HDL-C含量升高(P＜0.05)。與辛伐他汀組比較, 崗梅根水煎液組TC含量升高(P＜0.05)。（見表1）。

表1 各組大鼠血脂情況比較 (n =12，±S )

表1 各組大鼠血脂情況比較 (n =12，±S )

注：與正常對照組比較，1)P＜0.01,2)P＜0.05；與模型對照組比較，3)P＜0.01,4)P＜0.05；與辛伐他汀組比較，5)P＜0.05

TC (mmol．L-1)組別 TG (mmol．L-1) HDL-C (mmol．L-1) LDL-C (mmol．L-1)肝指數(shù)(%)正常對照組 0.54±0.11 2.41±0.13 1.34±0.10 0.42±0.01 2.53±0.11模型對照組 2.36±0.211)17.25±2.121)0.48±0.021)5.26±0.121)3.49±0.322)辛伐他汀組 0.62±0.023)6.33±0.521,3)0.71±0.012,4)1.35±0.111,3)2.70±0.13崗梅根水煎液組 0.73±0.103)8.17±1.121,3,5)1.02±0.113)1.13±0.131,3)2.62±0.22

2.2 各組大鼠血清各類脂肪酸含量的變化

與正常對照組比較，模型對照組TFA、UFA、MUFA和PUFA含量均有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05），SFA含量升高(P＜0.01）。與模型對照組比較，崗梅根水煎液組TFA含量升高(P＜0.05），SFA含量降低(P＜0.01）；辛伐他汀組TFA含量升高(P＜0.05）。與辛伐他汀組比較，崗梅根水煎液組SFA含量降低(P＜0.05），MUFA含量升高(P＜0.05）。（見表2）。

表2 各組大鼠血清血清各類脂肪酸含量比較 (n =12,±S, μg．mg-1)

表2 各組大鼠血清血清各類脂肪酸含量比較 (n =12,±S, μg．mg-1)

注：與正常對照組比較，1)P＜0.01,2)P＜0.05；與模型對照組比較，3)P＜0.01,4)P＜0.05；與辛伐他汀組比較，5)P＜0.05

組 別 TFA SFA UFA MUFA PUFA正常對照組 146.37±11.15 46.22±12.30 103.60±12.16 64.31±7.12 35.28±4.13模型對照組 72.33±9.261)78.40±5.321)70.32±6.211)40.71±5.131)21.22±3.152)辛伐他汀組 106.27±10.212,4)63.21±7.151)75.22±6.371)37.22±4.121)27.48±4.362)崗梅根水煎液組 115.20±10.532,4)51.04±4.913,5)83.46±7.222)57.30±5.262,5)25.31±4.502)

2.3 各組大鼠脂肪酸代謝相關(guān)基因檢測結(jié)果

與正常對照組比較，模型對照組L-FABPα mRNA、CPT-1mRNA表達量均顯著降低(P＜0.01），ACC-1mRNA表達量顯著升高(P＜0.01）。與模型對照組比較, 崗梅根水煎液組和辛伐他汀組L-FABPα mRNA、CPT-1mRNA表達量均有不同程度的升高(P＜0.01或P＜0.05），ACC-1mRNA均有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05）。與辛伐他汀組比較, 崗梅根水煎液組CPT-1mRNA表達量升高(P＜0.05)，ACC-1mRNA表達量降低(P＜0.05)（見表3）。

表3 各組L-FABPmRNA、CPT-1mRNA和ACC-1mRNA的表達量比較 (±S)

表3 各組L-FABPmRNA、CPT-1mRNA和ACC-1mRNA的表達量比較 (±S)

注：與正常對照組比較，1)P＜0．01，2)P＜0．05；與模型對照組比較，3)P＜0．01，4)P＜0．05；與辛伐他汀組比較，5)P＜0．05

組 別 n L-FABPmRNACPT-1mRNAACC-1mRNA正常對照組 12 0.71±0.03 1.37±0.12 0.43±0.01模型對照組 12 0.35±0.011)0.83±0.111)1.26±0.131)辛伐他汀組 12 0.52±0.022,4)0.90±0.131)0.72±0.111,4)崗梅根水煎液組 12 0.60±0.023)1.15±0.103,5)0.51±0.103,5)

3 討論

本實驗采用高脂飲食法建立大鼠NAFLD模型，在發(fā)病機制上與現(xiàn)階段人類NAFLD較為接近，簡便易行，重復(fù)性好，脂肪肝的復(fù)制率高。同時，為了觀察飲食、情緒、運動等復(fù)合因素對機體血脂代謝的影響，本實驗在高脂飲食基礎(chǔ)上，給予大鼠進行慢性束縛應(yīng)激刺激。以剝奪身體自由活動、束縛制動刺激為應(yīng)激原造成的應(yīng)激稱為束縛應(yīng)激，是目前實驗醫(yī)學領(lǐng)域最普遍應(yīng)用的應(yīng)激原。既往研究表明大鼠動物軀體活動受限后，短期產(chǎn)生憤怒、掙扎、焦慮不安、煩躁等心理以及行為變化，長期束縛大鼠出現(xiàn)抑郁、失眠等心理及行為學表現(xiàn)[6]。慢性束縛應(yīng)激與人類精神應(yīng)激下的心理行為學演變過程接近。肝臟是內(nèi)源性血脂和脂蛋白合成及代謝的主要器官，膳食中的脂質(zhì)主要是TG、TC，它們通過胰脂肪酶、膽固醇酯酶等水解為游離膽固醇和脂肪酸。采用高脂肪飲食誘導脂肪肝模型，進入肝臟的脂肪量超過肝臟的脂質(zhì)和氧化能力，導致肝臟脂質(zhì)代謝發(fā)生障礙，肝內(nèi)脂質(zhì)類物質(zhì)合成與分泌的動態(tài)平衡失調(diào)，合成的內(nèi)源性TG就不能以脂蛋白的形式進出肝臟，在肝細胞內(nèi)、外堆積形成脂肪肝，高脂飲食持續(xù)存在時可進展為脂肪性肝炎[7～8]。

NAFLD的發(fā)病率逐年升高，但其發(fā)病機制仍不十分清楚。Day提出的“二次打擊”學說逐漸被多數(shù)學者所接受，這兩個過程中脂肪酸代謝平衡的改變貫穿于始終[9]。L-FABP是脂肪酸結(jié)合蛋白家族中的一種，L-FABP主要參與長鏈脂肪酸的彌散、吸收、代謝和轉(zhuǎn)運，將脂肪酸從脂膜運輸?shù)街舅嵫趸恢茫筛视腿ゲ⑦M入細胞核發(fā)揮調(diào)控功能。在肝細胞、脂肪細胞中，脂肪酸是脂質(zhì)生物合成、儲存或降解過程的主要底物[10]。CPT-l是脂肪酸氧化過程的關(guān)鍵限速酶，位于線粒體外膜上，催化長鏈脂酞CoA與肉堿形成脂酞肉堿，CPT-l的表達水平升高有助于增加脂肪酸分解，降低體脂肪沉積量[11]。ACC1可催化乙酰輔酶A形成丙二酸單酰輔酶A，該羧化作用是長鏈脂肪酸的生物合成中的限速反應(yīng)。ACC1催化的反應(yīng)產(chǎn)物丙二酸單酰輔酶A，是脂肪酸合成和代謝過程中重要的中間代謝物，能夠降低脂肪酸的氧化水平，促進脂質(zhì)生成[12]。

本實驗選用辛伐他汀作為對照藥物，辛伐他汀是臨床上應(yīng)用廣泛的調(diào)脂藥，研究發(fā)現(xiàn)其還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用、改善血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)定和逆轉(zhuǎn)粥樣硬化斑塊等作用[13]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激+

高脂飲食促進大鼠脂肪肝的形成，崗梅根水煎液通過L-FABPα mRNA、CPT-1mRNA和ACC-1mRNA等脂肪酸代謝基因途徑對模型大鼠脂肪酸代謝發(fā)揮調(diào)控作用。崗梅根水煎液的上述藥理效應(yīng)與其“清熱解毒、生津活血”功效相關(guān)，契合中醫(yī)對脂肪肝的嗜食肥甘厚味，憂思郁怒傷肝，“痰、濁、瘀、毒”郁結(jié)于肝臟的病因病機認識，但其作用或調(diào)控機制需要進一步理論挖掘及實驗研究。

[1] 范建高.中國非酒精性脂肪性肝病的流行病學[J].中國醫(yī)師進修雜志,2010,33(1):4.

[2] Giovanni M,Roberto G,Maurizio C.Recent insights into hepatic lipid metabolism in non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)[J].Progress in Lipid Research,2009,48:19.

[3] 祁銀德,任玉鳳.嶺南地區(qū)習用中藥崗梅研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2009,5(3):29.

[4] 蔡艷,張慶文,李旨君,等.崗梅根化學成分的研究[J].中草藥,2010,41(9):1426.

[5] 何蓉蓉,栗原博,寶麗,等.王老吉涼茶對氧化應(yīng)激負荷小鼠脂代謝的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2008,14(10):31.

[6] Angela JG,Alan KJ.Stress,depression,and cardiovascular dysregulation:areview of neurobiolo-gical mechanisms and the integration of research frompreelinical disease models[J]. Stress,2009,12(l):l1.

[7] ElizabethLYu,Jemey B,Schwimmer,etal.Non-aleoholic fatty liver disease: epidemiology,patho-physiology,diagnosis and treatment[J].Paediatrics and childhealth,2010,20(1):26.

[8] Nimantha M,Wilfred DA,Christopher PD.Non-alcoholic fatty liver disease:The mist gradually clears.Journal of Hepatology,2008,(48):5104.

[9] Erickson S K.Nonalcoholic fatty liver disease[J].Journal of Lipid Research,2009,50:412.

[10] Binas B, Erol E. L-FABPs as determinants of myocellular and hepatic fuelmetabolism[J].Mol Cell Biochem,2007, 299 (122):75.

[11] 王文正,趙素梅,高士爭.Leptin介導的JAK/STAT信號通路對脂類代謝調(diào)節(jié)的研究進展[J].中國細胞生物學學報,2011, 33(5):584.

[12] Naomto H,Zenjun O,Yashikazu H,et al.Hepatic denovo lipogenesis is present in liver-specific ACC1-deficient mice[J].Mol Cell Biochem,2007,27(5):1881.

[13] Li H,Forstermann U.Prevention of atherosclerosis by interference with the vascular nitric oxide system[J].Curr Pharm Des,2009,15(27):3133.

（責任編輯：陳思敏）

R 285.5

A

1674-926X(2015)02-019-04

中山大學附屬第五醫(yī)院青年醫(yī)師科研基金（編號：201208 ）

中山大學附屬第五醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，廣東 珠海519000

胡向陽（1975-），男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事代謝性疾病研究

Tel:13928005055 Email:aikongzhi@163.com

2014-06-29