趙嘉詠,蘇 佳,張白帆,夏勝利,穆玉姣,呂家銳,黃學(xué)勇

河南省20株布魯氏菌鑒定與PFGE分子分型研究

趙嘉詠,蘇 佳,張白帆,夏勝利,穆玉姣,呂家銳,黃學(xué)勇

目的 檢測(cè)與分析河南省2010-2012年20株布氏菌型別及PFGE脈沖場(chǎng)凝膠電泳指紋圖譜特征。方法 采集病人靜脈血，分別以試管凝集試驗(yàn)(SAT)、雙相血培養(yǎng)瓶分離培養(yǎng)、熱裂解法制備DNA模板和AMOS-PCR鑒定4種布氏菌型別。采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)(PFGE)對(duì)檢出的布魯氏菌進(jìn)行分子分型鑒定。結(jié)果 分離培養(yǎng)的20株布魯氏菌經(jīng)鑒定，19株為羊種，1株為牛種；羊種布魯氏菌經(jīng)XbaI酶切與脈沖場(chǎng)凝膠電泳后，共獲得了8種不同帶型，帶型相似度在80%～100%之間，牛種與羊種菌株在帶型相似度上差異較大，具有較好的分辨能力。結(jié)論 河南省病人感染的布魯氏菌以羊種為主要型別，AMOS-PCR與PFGE作為布魯氏菌菌型鑒定與分子分型的技術(shù)手段，為布魯氏菌病的病原學(xué)監(jiān)測(cè)與應(yīng)急檢測(cè)提供依據(jù)。

布氏菌；AMOS多重PCR；PFGE

布魯氏菌病(brucellosis，簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌屬的細(xì)菌侵入機(jī)體，引起的人獸共患變態(tài)反應(yīng)性疾病，是中華人民共和國(guó)傳染病防治法規(guī)定報(bào)告的乙類傳染病。近年來我國(guó)動(dòng)物間和人間布病疫情有回升勢(shì)頭。本研究對(duì)2010-2012年內(nèi)分離自河南省監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院的20株布魯氏菌進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)、分型，為深入了解和掌握布魯氏菌的病原構(gòu)成、分子流行病學(xué)特征和相關(guān)疾病的監(jiān)測(cè)、暴發(fā)預(yù)警、調(diào)查、溯源提供基線與參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 自2010-2012年河南省監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院與河南省疾控中心發(fā)熱門診采集的布魯氏菌試管凝集法(SAT)陽性病人血液樣本。標(biāo)準(zhǔn)菌株16M 、544A、1330S 由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所布病室贈(zèng)送。

1.1.2 主要試劑 雙相血培養(yǎng)瓶購自法國(guó)bioMerieux公司；裂解綿羊血平板購自安圖生物公司；TaqDNA聚合酶購自美國(guó)Promega公司；引物(HPLC純化)由Invitrogen合成；Seakem Glod瓊脂糖購自美國(guó)LONZA公司；蛋白酶K購自英國(guó)Roche公司；限制性內(nèi)切酶XbaI購自大連寶生物公司；Tris-Hcl/EDTA/5XTBE購自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離培養(yǎng) 病人新鮮血液5～8 mL，無菌注射接種于雙相血培養(yǎng)瓶，混勻后置37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d觀察1次，有菌生長(zhǎng)時(shí)挑出菌落轉(zhuǎn)種綿羊血瓊脂中培養(yǎng)。

1.2.2 形態(tài)學(xué)與生化鑒定 挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢與H2S試驗(yàn)。G-為短小桿菌，H2S+為疑似布魯氏菌。

1.2.3 DNA模板制備 刮取布魯氏菌培養(yǎng)物，0.85%滅菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌濃至1麥?zhǔn)蠞岫龋浞终袷帒腋　? ℃～8 ℃，12 000 r/min離心5 min，棄去上清。沉淀加入100 μL滅菌去離子水，再次充分振蕩懸浮混勻。100 ℃煮沸15～20 min，12 000 r/min離心5 min，上清作為PCR擴(kuò)增模板[1]。

1.2.4 AMOS-PCR檢測(cè) 反應(yīng)體系為50 μL：其中PCR反應(yīng)液(含有Taq酶、特異性引物、 dNTP及反應(yīng)緩沖液)46 μL，模板DNA 4 μL。檢測(cè)引物針對(duì)布魯氏菌不同亞種設(shè)計(jì)，引物濃度IS711-specific primer 1 μmol/L，其余鑒定引物0.2 μmol/L。AMOS-PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：預(yù)變性95 ℃/5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃/1.5 min，56 ℃/2 min，72 ℃/2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃/5min，1個(gè)循環(huán)；4 ℃保存。取8～10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(140 V,30 min)[2，4]。

1.2.5 PFGE分型 H9812標(biāo)準(zhǔn)菌株作為分子量標(biāo)記。限制性內(nèi)切酶XbaI(75U)，37 ℃酶切2 h。電泳參數(shù)：電壓6 V/cm，分子量50 kb～400 kb，脈沖時(shí)間2～25 s，線性轉(zhuǎn)換，電場(chǎng)角度120°，電泳時(shí)間19 h，電泳液1×TBE，電泳液溫度14 ℃。電泳結(jié)束后膠塊用GelRed染料染色20 min后純水清洗40 min后凝膠成像儀拍照(曝光時(shí)間3.0 s，去過飽和成像)。BioNumerics6.0軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，繪制聚類分析樹狀圖。聚類算法為非加權(quán)配對(duì)平均法(UPGMA)，電泳條帶位置優(yōu)化度(Position tolerance)1.5%，相似度100%認(rèn)定為同一PFGE帶型[5]。

2 結(jié) 果

2.1 疑似布魯氏菌感染病人血液經(jīng)雙相血培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)與生化鑒定，AMOS-PCR檢測(cè)最終確認(rèn)布魯氏菌20株，其中羊種布魯氏菌19株，牛種布魯氏菌1株。特別值得注意的是我們從同一患者體內(nèi)分離出牛種和羊種兩株布魯氏菌。(圖1)。

M：DNA marker 100 ladder；1：牛種布魯氏菌；2-16：羊種布魯氏菌

M：DNA marker 100 ladder；1：B.melitensis；2-16：B.bovis.

圖1 布魯氏菌AMOS-PCR電泳圖譜

Fig.1 AMOS-PCR products ofBrucellaspp.

2.2 PFGE分子分型結(jié)果 20株布魯氏菌經(jīng)XbaI酶切后進(jìn)行PFGE分型，20株菌分為羊種、牛種兩大族群共9種不同帶型(Dice, position tolence1.5%) ，各帶型包含菌株數(shù)為1～7株不等。其中5種帶型包含菌株數(shù)>2株，其余4種帶型只包含一株菌。羊種族群19株菌又被分為兩大帶型(相似度>85%);牛種族群1株菌被單獨(dú)劃歸為一種帶型，與羊種菌株存在顯著差異(相似度<40%)。(圖2)。

3 討 論

河南省在歷史上一直是以羊種布氏菌為主的農(nóng)區(qū)型布魯氏菌病重點(diǎn)疫區(qū)，全省布病疫區(qū)縣多達(dá)76個(gè)。雖然上世紀(jì)80年代布病疫情得到了有效控制，但自2000年以后，河南省同我國(guó)其他傳統(tǒng)疫區(qū)一樣，布病疫情出現(xiàn)了快速回升和強(qiáng)勢(shì)反彈的勢(shì)頭，防控形勢(shì)嚴(yán)峻。長(zhǎng)期以來，受制于歷史原因和現(xiàn)實(shí)客觀條件的限制，疾控部門對(duì)于布病的診斷與監(jiān)測(cè)一直停留在以試管凝集試驗(yàn)(SAT)為代表的免疫學(xué)檢測(cè)和以流行病學(xué)調(diào)查為主的層面上，缺乏對(duì)布魯氏菌病原學(xué)研究的本底資料。因此，開展布魯氏菌的分離、鑒定及分子分型，掌握其種屬構(gòu)成、變異變遷和分子流行病學(xué)特征，為布魯氏菌病的監(jiān)測(cè)、暴發(fā)預(yù)警、調(diào)查、溯源提供基線與參考數(shù)據(jù)就顯得尤為重要。從本研究的20株布魯氏菌鑒定結(jié)果來看，河南省布病病人感染仍然以羊種布魯氏菌為主，這和歷史研究文獻(xiàn)結(jié)論是相吻合的。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，在個(gè)體病人中也存在牛種布魯氏菌感染及牛種、羊種并行感染的情況，值得我們認(rèn)真和深入研究。

圖2 羊種與牛種布魯氏菌PFGE電泳及聚類分析圖譜Fig.2 PFGE cluster analysis of B. melitensis and B. bovis

脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)作為近年來細(xì)菌性傳染病分子流行病學(xué)研究的工具，越來越受到重視并得以推廣應(yīng)用[3]。它和MLVA、MLST等分子分型技術(shù)一起在布魯氏菌病的監(jiān)測(cè)、早期預(yù)測(cè)預(yù)警，暴發(fā)疫情與突發(fā)公共衛(wèi)生事件調(diào)查處置等方面發(fā)揮著重要的作用[6-7]。本研究利用該技術(shù)分析了我省病人中20株羊種與牛種布魯氏菌PFGE“指紋圖譜”特征，從染色體DNA限制性位點(diǎn)多態(tài)性角度驗(yàn)證了羊種與牛種兩種生物型別間的巨大差異，為布魯氏菌病原學(xué)研究積累了分子基線數(shù)據(jù)。從帶型分布看，19株羊種布魯氏菌最顯著的特點(diǎn)就是分為兩種帶型，帶型內(nèi)呈現(xiàn)出相當(dāng)高的相似度(大多數(shù)帶型間的相似度>95%)，從溯源和多態(tài)性角度看需做進(jìn)一步分析和驗(yàn)證，掌握布魯氏菌種與亞種在不同酶切和電泳條件下的帶型特征，如優(yōu)勢(shì)帶型與暴發(fā)帶型間的差異等，同時(shí)結(jié)合病人臨床信息，綜合應(yīng)用病原學(xué)和流行病學(xué)研究方法對(duì)聚類分析圖譜進(jìn)行合理的解讀和判定。

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Identification and PFGE molecular typing ofBrucellastrains in Henan Province, China

ZHAO Jia-yong,SU Jia,ZHANG Bai-fan,XIA Sheng-li,MU Yu-jiao,LU Jia-rui,HUANG Xue-yong

(InstituteforInfectiousDiseaseControlandPrevention,HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016,China)

The aim was to detect and analyzeBrucellastrains isolated from patients in Henan Province from 2010 to 2012 with AMOS-PCR amplification and pulsed field gel electrophoresis technology, provide baseline for the monitoring, early warning, outbreak investigation, and tracing of brucellosis. We collected SAT tested positive patients blood and cultured with double phase blood bottle for at least 20 days. AMOS-PCR identification of 4 species ofBrucellatype was conducted using DNA template with thermal decomposition method after morphological and biochemical identification. The pulsed field gel electrophoresis (PFGE) was made for getting the molecular type characters ofBrucellastains. Results showed that 20 strains ofBrucellawere identified by morphological, biochemical and AMOS-PCR technology, in which 19 strains were sheep species, 1 strain was cattle species.Brucellastrains were digested with XbaI and made pulsed field gel electrophoresis. The result indicated that the similarity coefficient among the 19 sheep species isolates was from 80% to 100% with 9 belt types, which had a great difference from cattle species. The sheep speciesBrucellais the main type in patients in Henan Province. AMOS-PCR and PFGE technology provide a strong tool for the brucellosis monitoring and emergency detection.

Brucella; AMOS- PCR; PFGE

Xia Sheng-li, Email: xiasl@hncdc.com.cn

“十二五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)(No.2012ZX10004201和No.2012ZX10004203)聯(lián)合資助

夏勝利，Email：xiasl@hncdc.com.cn

河南省疾病預(yù)防控制中心，鄭州 450016

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.015

R378

A

1002-2694(2015)11-1058-03

2015-04-17；

2015-08-16

Supported by the National Science and Technology Major Project (Nos. 2012ZX10004201& 2012ZX10004203)