高圣風(fēng)等

摘 要 香草蘭根（莖）腐病是香草蘭上重要病害之一，目前國內(nèi)外尚未有基于rDNA-ITS序列的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析的報(bào)道。本研究從海南省萬寧市的興隆、長豐和南林等地的病樣中分離獲得了9個(gè)菌株，經(jīng)過柯赫氏法則驗(yàn)證、形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定，病原菌被鑒定為尖孢鐮刀菌，表明海南省萬寧市地區(qū)的香草蘭根（莖）腐病病原菌是尖孢鐮刀菌（Fusarium. oxysporum）。然后，基于rDNA-ITS序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹并對菌株的致病性進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個(gè)菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中被聚類為遺傳距離明顯的2個(gè)分枝，而且分枝Ⅱ的致病性要高于分枝Ⅰ。本研究為香草蘭根（莖）腐病病原物快速鑒定提供依據(jù)，對香草蘭根（莖）腐病防治決策有一定的參考意義。

關(guān)鍵詞 香草蘭根（莖）腐病 ；Fusarium oxysporum ；病原鑒定 ；進(jìn)化樹 ；致病性

分類號 S435.73

Abstract Vanilla fusarium rot is adevastating disease. Few molecular identification and phylogenetic analysis based on rDNA-ITS sequences of the pathogen were reported. In this study， 9 isolates were obtained from 3 towns， Xinglong， Changfeng and Nanlin， of Wanning city in Hainan province. Koch's postulatestest， identifications of morphology and rDNA-ITS sequences blast were performed， results prove that the pathogen is Fusarium oxysporum. Then the phylogenetic tree was constructed based on the sequences of rDNA-ITS and the pathogenicity of the pathogens were determined， results show that strains were clustered into 2 clades with apparently genetic distance in the phylogenetic tree， and the pathogenicity of the cladeⅡwas stronger than that of the cladeⅠ. This study is useful for us to understand of vanilla fusarium rot disease from the perspective of molecular and might be conducive to the disease control.

Keywords vanilla fusarium rot ； Fusarium oxysporum ； pathogen identification ； phylogenetic tree ； pathogenicity 香草蘭[Vanilla fragrans （salisb.） Amess （V.planifolia）] 是一種蘭科香料作物，素有“食品香料之王”的稱譽(yù)，廣泛應(yīng)用于食品和化妝品行業(yè)[1]。香草蘭于20世紀(jì)60年代被引入我國海南和云南（西雙版納），因其經(jīng)濟(jì)價(jià)值高一度被大力推廣種植。但是由于生產(chǎn)前期投入高、病害發(fā)生嚴(yán)重等原因，香草蘭種植面積在近年來呈下降趨勢[2]。香草蘭根（莖）腐病是香草蘭上危害最嚴(yán)重的病害之一。該病害全年均可發(fā)生，在多雨季節(jié)（7～10月份）發(fā)生較重，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致減產(chǎn)50%以上。近年來，該病害的爆發(fā)流行已經(jīng)成為限制香草蘭產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要瓶頸之一。

對于香草蘭根（莖）腐病的病原物，國內(nèi)外僅有少量報(bào)道。1927 年Tucker 首先報(bào)道了該病害，并將病原物命名為尖孢鐮刀菌香草蘭致病變種（FusariumbatatatisWr. Var. Vanillae Tucker）[3]。1963年Gordon將其重命名為尖孢鐮刀菌香草蘭?；虵. oxysporum Schl. sp. Vanillae（Tuck） Gordon[4]。在1969年Alcornero和Santi認(rèn)為香草蘭根（莖）腐病是由尖孢鐮刀菌香草蘭?；秃颓迅ょ牭毒‵. solani）混合侵染而引起的[5]。2010年P(guān)inaria等人從印度香草蘭產(chǎn)區(qū)分離了542株鐮刀菌，涵蓋鐮刀菌屬的12個(gè)種，發(fā)現(xiàn)僅尖孢鐮刀菌對香草蘭具有致病性[6]。在國內(nèi)，1986年，黃伙平對福建香草蘭根腐病病原進(jìn)行了鑒定，認(rèn)為病原物是尖孢鐮刀菌香草蘭?；蚚7]。1998年，阮興業(yè)等人對云南省西雙版納和海南省的香草蘭病害進(jìn)行了綜合報(bào)道，認(rèn)為兩地的香草蘭根（莖）腐病屬2種鐮刀菌（尖孢鐮刀菌香草蘭?；秃颓迅ょ牭毒┗旌锨秩緦?dǎo)致，其中尖孢鐮刀菌香草蘭?；褪侵饕≡鶾8]。2011年，劉愛勤等人對海南的香草蘭病害進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)香草蘭根（莖）腐病危害重大，其病原物鑒定結(jié)果與阮興業(yè)等人相同[9]。但是，在以上報(bào)道中，病原物鑒定僅采用傳統(tǒng)鑒定方法，沒有涉及利用核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔序列（Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer，rDNA-ITS）對香草蘭根（莖）腐病菌進(jìn)行輔助鑒定。在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站的GenBank中能夠搜索到一些香草蘭根（莖）腐病菌rDNA-ITS序列，其來源菌株均被鑒定為尖孢鐮刀菌或者尖孢鐮刀菌香草蘭轉(zhuǎn)化型，但沒有找到相關(guān)的文章報(bào)道。

為了進(jìn)一步了解香草蘭根（莖）腐病病原物，本課題組在海南省萬寧市興隆、長豐和南林三個(gè)地方采集香草蘭根（莖）腐病樣本，進(jìn)行病原菌分離純化、形態(tài)學(xué)鑒定、分子鑒定、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、致病性分析等工作。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究微生物培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）[10]；病害樣本采集于海南萬寧的興隆、長豐和南林等地；所用的試劑盒包括天根生化科技（北京）有限公司的“快速DNA 提取擴(kuò)增套裝”、“DNA 純化回收”試劑盒和寶生物工程（大連）有限公司“pMD 18-T Vector Cloning Kit”；所用的儀器主要有：恒溫振蕩器（NBS，Inonova 44R）、光學(xué)顯微鏡（Olympus，BX51）、生物培養(yǎng)箱（Percival，E-30B）、水平電泳儀（Tanon，EPS2000）、凝膠成像儀（LongGene，LG2020D）和臺式離心機(jī)（Heal Force，Neofuge 18R）。

1.2 方法

1.2.1 病害樣本采集和病原菌分離、純化

2014年3～4月，分別于海南萬寧的興隆、長豐和南林等地采集香草蘭根（莖）腐病病害樣本。在發(fā)病嚴(yán)重的園塊中選擇處于發(fā)病初期且病害癥狀典型的莖蔓，用剪刀剪下收集，每園塊采集樣本1～2個(gè)。然后進(jìn)行病原物分離純化。將病樣沖洗干凈后，在超凈工作臺中用30%次氯酸鈉消毒5 min，70%酒精消毒30 s，無菌水清洗3次后將病健交界處切成小塊放在PDA培養(yǎng)基[10]上。將PDA平板置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。待平板中長出菌落后，從菌落邊緣挑取菌絲轉(zhuǎn)接于新的PDA平板中培養(yǎng)，重復(fù)轉(zhuǎn)接5次進(jìn)行純化。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

將分離得到的菌株接種到PAD平板上，在26℃恒溫條件下培養(yǎng)4 d后觀察菌落形態(tài)，并用單反相機(jī)（Canon EOS550D）拍照。培養(yǎng)14 d后用光學(xué)顯微鏡（Olympus BX51）在400倍視野下觀察菌絲、分生孢子和厚垣孢子形態(tài)，用Image-Pro Plus 6.1圖像分析軟件進(jìn)行圖像采集和分析。

1.2.3 柯赫氏法則驗(yàn)證

將分離得到的菌株接種到PDA平板上，在26℃恒溫條件下培養(yǎng)2周后將培養(yǎng)基打成直徑0.5 cm的菌塊備用。將土壤和椰糠在121℃條件下滅菌30 min，冷卻后裝入花盆中備用。將健康的香草蘭莖蔓（去除嫩梢）后剪成50 cm長度定植在花盆上，每盆2株。用消毒過的大頭針在香草蘭莖節(jié)氣生根基部刺3個(gè)深約0.3 cm的傷口。將準(zhǔn)備好的菌塊放置于傷口上，用無菌水脫脂棉保濕，用無菌PDA塊作為對照。在室溫條件下培養(yǎng)3周后觀察結(jié)果。從發(fā)病莖稈中再次分離病原物，將分離菌株與接種菌株進(jìn)行比較。

1.2.4 基因組DNA提取和rDNA-ITS序列擴(kuò)增

本研究所用引物為真菌rDNA-ITS區(qū)通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。該引物擴(kuò)增區(qū)間為：部分18SrDNA、ITSⅠ區(qū)-5.8SrDNA-ITSⅡ區(qū)和部分28SrDNA。引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成?；蚪MDNA提取和ITS序列擴(kuò)增使用天根生化科技（北京）有限公司的“快速DNA提取擴(kuò)增套裝”試劑盒進(jìn)行?；蚪M提取方法和PCR擴(kuò)增體系均參照說明書進(jìn)行。PCR程序?yàn)椋?4℃ 45 s，（94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s）×30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min，12℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后在紫外凝膠成像儀下觀測和拍照。

1.2.5 rDNA-ITS區(qū)序列的克隆、測序和BLAST比對

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，將大小約500 bp的目標(biāo)條帶用天根生化科技（北京）有限公司的“DNA純化回收試劑盒”進(jìn)行純化回收。回收產(chǎn)物通過寶生物工程（大連）有限公司“pMD 18-T Vector Cloning Kit”進(jìn)行TA克隆，然后轉(zhuǎn)入Escherichia coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞中。通過菌落PCR篩選出陽性克隆子后送到深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站的基本局部比對搜索工具（The Basic Local Alignment Search Tool， BLAST）進(jìn)行序列比對分析，根據(jù)ITS序列的同源性對分離菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.6 致病性測定

接種菌塊與香草蘭苗的準(zhǔn)備與本文1.2.3小節(jié)相同。用消毒過的手術(shù)刀片在香草蘭莖上橫切1個(gè)深約0.3 cm的傷口，將準(zhǔn)備好的菌塊放置于傷口上，用無菌水脫脂棉保濕，以無菌PDA塊作對照，每個(gè)處理10株。在室溫條件下培養(yǎng)3周后統(tǒng)計(jì)病斑長度。使用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單向比較（One-way ANOVA）分析。

1.2.7 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

除了本研究獲得的9個(gè)香草蘭根（莖）腐病菌株外，其它12個(gè)菌株的rDNA-ITS序列均從GenBank下載獲得。以2株大豆猝死病病原菌F. solani（登陸號分別為AF125027和AF124995）為外群，首先用Clustal X 2.1軟件進(jìn)行序列比對分析，然后使用MEGA6.06軟件采用Neighbor-joining計(jì)算方法和bootstrap檢驗(yàn)方法（1 000次重復(fù)）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害樣本采集和病原菌分離、純化

共從海南萬寧的興隆、長豐和南林等地采集香草蘭根（莖）腐病病害樣本12個(gè)。從病害樣本中分離純化出菌株9個(gè)，菌株編號及其來源詳見表l。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

9個(gè)菌株在PDA平板上培養(yǎng)4 d后，其菌落形態(tài)十分一致：菌落正面氣生菌絲呈白色棉絮狀（圖1A），菌落背面中心區(qū)域略帶紫紅色（圖1B）。培養(yǎng)14 d后，挑取少量菌絲于載玻片上，在顯微鏡400倍視野下觀察分生孢子形態(tài)，9個(gè)菌株的觀察結(jié)果一致：可以觀測到小型分生孢子（圖1C中虛線箭頭所示）、大型分生孢子（圖1C中實(shí)線箭頭所示）和厚垣孢子（圖1D中箭頭所示）。經(jīng)Image-Pro Plus 6.1圖像分析軟件測量得出小型分生孢子大小約為（2.3～4.5）μm×（5.0～15.5）μm，大型分生孢子（3.0～5.8）μm×（4.0～15.0）μm，厚垣孢子直徑約為5.5～13.0 μm。分生孢子和厚垣孢子的形態(tài)特征與劉愛勤等人[11]所述F. oxysporum的形態(tài)特征一致。因此，將這9個(gè)菌株鑒定為F. oxysporum。

2.3 柯赫氏法則驗(yàn)證

將從田間病害樣本中分離出的菌株回接到香草蘭上3周后，對照莖蔓（圖2A）沒有發(fā)病，接菌莖蔓出現(xiàn)褐色皺縮的病斑（圖2B），其癥狀與田間的香草蘭根（莖）腐?。▓D2C）一致。而且從發(fā)病莖蔓中能夠分離出與接種菌株形態(tài)一致的菌株（圖2D）。依照柯赫氏法則，認(rèn)為分離得到的9株真菌是香草蘭根（莖）腐病的病原菌。

2.4 rDNA-ITS序列鑒定

以9個(gè)菌株的DNA為模板，使用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，9個(gè)菌株均能夠擴(kuò)增出大小約500 bp的目的片段（圖3）。測序結(jié)果表明，擴(kuò)增片段大小均為544 bp。BLAST 比對結(jié)果表明，測序片段與GenBank中的許多尖孢鐮刀菌的ITS序列大小相同、相似度≥99%。這些相似度高的菌株有：尖孢鐮刀菌瓜類?；停ǖ卿浱枺篈Y188919），尖孢鐮刀菌古巴?；停ǖ卿浱枺篐Q694500）、尖孢鐮刀菌萎蔫?；停ǖ卿浱枺篈F322075），等等。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果認(rèn)為，該9株病原菌均是尖孢鐮刀菌。

2.5 致病性分析

將9個(gè)菌株接種到香草蘭莖蔓傷口上3周后，接菌處理的香草蘭莖蔓上有褐色皺縮病斑（圖4A），該癥狀與田間香草蘭根（莖）腐病癥狀一致。病斑長度測量后采用Fisher's LSD tests方法進(jìn)行顯著性分析（P<0.05）（圖4B）發(fā)現(xiàn)：所有9個(gè)菌株均對香草蘭有致病能力，致病性最強(qiáng)的是VFO02菌株（病斑平均長度為3.49 cm），致病性最弱的是VFO23菌株（病斑平均長度為2.06 cm）。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測序獲得的9個(gè)rDNA-ITS片段序列，與從Genbank中下載的12個(gè)序列進(jìn)行比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。其中所有尖孢鐮刀菌被聚類在同一分枝，與茄腐鐮刀菌外群有著明顯的進(jìn)化距離。其中尖孢鐮刀菌分枝再次分為2個(gè)分枝。分枝Ⅰ（CladeⅠ）由13個(gè)菌株組成，包括5個(gè)本研究獲得的菌株（VFO01、VFO 23、VFO39、VFO64和VFO65），3個(gè)以香草蘭為寄主的菌株（F. oxysporum f. sp. vanillae22ma140，哥倫比亞；F. oxysporum KKK 19，印度；F. oxysporumf. sp. VanillaeML-8-1，中國云南），以及5個(gè)其他?；途辏‵. oxysporum f. sp. Pisi Arg3；F. oxysporum f. sp. cubense E13；F. oxysporum f. sp. vasinfectum Ag149-I；F. oxysporum f. sp. ciceris FOC153；F. oxysporum f. sp. melonis MA3）。分枝Ⅱ（CladeⅡ）由5個(gè)菌株組成，包括4個(gè)本研究獲得的菌株（VFO02、VFO13、VFO51和VFO52）和1個(gè)以香草蘭為寄主的尖孢鐮刀菌（F. oxysporum Fo235）。比較9株病原菌的致病能力（見圖4），發(fā)現(xiàn)分枝Ⅱ中4 個(gè)菌株的病斑長度均大于分枝Ⅰ的5 個(gè)菌株，但是2 個(gè)分枝間只有部分菌株的差異達(dá)到了顯著水平。并且兩個(gè)分枝間有著明顯的進(jìn)化距離，說明香草蘭根（莖）腐病病原菌的變異度較廣。

3 討論

前人對香草蘭根（莖）腐病的病原物種類存在分歧，一種觀點(diǎn)認(rèn)為病原物是尖孢鐮刀菌香草蘭?；?；另一種觀點(diǎn)認(rèn)為尖孢鐮刀菌香草蘭專化型是主要病原物，茄腐鐮刀菌也是該病害的病原物。本研究對海南省萬寧市地區(qū)的香草蘭根（莖）腐病進(jìn)行采樣，分離得到了9株病原菌，綜合形態(tài)學(xué)和分子方法鑒定結(jié)果認(rèn)為，該9株病原菌均是尖孢鐮刀菌。該結(jié)果與第一種觀點(diǎn)一致。在本研究構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，9個(gè)病原菌菌株均與茄腐鐮刀菌有著相當(dāng)?shù)倪z傳距離，也支持這些菌株均是尖孢鐮刀菌的觀點(diǎn)。鑒于尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌均是很多種植物的病原物且往往病害癥狀相近，本研究不排除茄腐鐮刀菌也是香草蘭病原菌的可能性。無論如何，本研究對了解海南省萬寧地區(qū)的香草蘭根（莖）腐病病原菌，尤其是以分子的角度對尖孢鐮刀菌進(jìn)行輔助鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，有一定的參考價(jià)值。

本研究分離獲得的9個(gè)香草蘭根（莖）腐病病原菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹上被聚類為遺傳差異明顯的2個(gè)分枝，說明該病原菌的rDNA-ITS區(qū)序列的遺傳變異度很大。在進(jìn)化樹中，9株香草蘭根（莖）腐病病原菌被分散的分別聚類于F. oxysporum各轉(zhuǎn)化型之間，且遺傳距離跨度較大。其原因可能有2方面：（1）香草蘭是國外引進(jìn)物種，其病原物可能既存在國外群體又包含本土群體；（2）目前國內(nèi)外對該病害病原物的研究極少，缺乏可參考的ITS序列。此外，F(xiàn). oxysporum的rDNA-ITS區(qū)序列變異度非常大，即使在研究較為透徹的香蕉枯萎病菌上也難以通過rDNA-ITS序列對生理小種進(jìn)行分類[12-13]。

通過比較病原菌接種后香草蘭莖蔓上形成的病斑長度，可以看出系統(tǒng)發(fā)育樹中分枝Ⅱ的的致病能力要強(qiáng)于分枝Ⅰ，這說明該病害病原菌群體中有可能存在2個(gè)致病能力不同的分枝。本研究只是小樣本數(shù)量的盆栽試驗(yàn)，并且2個(gè)分枝間的致病性差異沒有全部達(dá)到顯著水平，這個(gè)觀點(diǎn)還需要更多數(shù)據(jù)支持。

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