張斌姚家忠賈昌平陳麗波錢葉飛魯輝

（1蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 蘇州215104；2淮南東方醫(yī)院集團(tuán)新庒孜醫(yī)院，安徽 淮南232072）

減肥類保健食品中非法添加的8種化學(xué)藥物的篩查與測(cè)定

張斌1姚家忠2賈昌平1陳麗波1錢葉飛1魯輝1

（1蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 蘇州215104；2淮南東方醫(yī)院集團(tuán)新庒孜醫(yī)院，安徽 淮南232072）

目的：建立高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器法（HPLC-DAD）結(jié)合電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜法（ESI-Q-TOF/MS）篩查、測(cè)定減肥類保健食品中非法添加的酚酞、芬氟拉明、麻黃堿、咖啡因、呋塞米、西布曲明及其兩種衍生物。方法：采用C18色譜柱，以0.02mol/L乙酸銨溶液（0.1%乙酸）-甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫。對(duì)HPLC-DAD檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的樣品進(jìn)行ESI-Q-TOF一級(jí)掃描及二級(jí)碎片離子比對(duì)進(jìn)行確證。結(jié)果：方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示HPLC-DAD法8種待測(cè)物在0.01～1.0 mg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率為90.41%～105.97%，RSD小于7.0%。檢出限為0.10～1.68μg/m L，定量限為0.34～5.59μg/m L。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立的方法靈敏、可靠，可用于減肥類保健食品中這8種非法添加成分的定性、定量分析。

高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器法；電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜法；減肥類保健食品；非法添加成分

近年來，一些不法商家為謀取利益，擅自向減肥類保健食品中添加化學(xué)藥品，以增加療效，這種行為可能會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康造成嚴(yán)重危害[1-2]。為此，國(guó)家制定了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)來檢驗(yàn)保健食品中非法添加的酚酞、芬氟拉明、麻黃堿、咖啡因、呋塞米、西布曲明及其兩種衍生物[3-5]。但是，目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)這8種成分的檢測(cè)分為幾種色譜方法，增加了工作量[6-7]。為此，本文嘗試對(duì)上述 8種違禁添加成分進(jìn)行系統(tǒng)合并，實(shí)現(xiàn)在一次分析中同時(shí)檢測(cè)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀（配2695型分離系統(tǒng)、2998型二極管陣列檢測(cè)器、Empower軟件系統(tǒng)），Agilent 6538 HPLC-DAD-ESI-Q-TOF/MS液質(zhì)聯(lián)用儀，Thermo高速離心機(jī)，KQ-300DA數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 試藥

麻黃堿（批號(hào)：171241-201007）、芬氟拉明（批號(hào)：100073-200002）、酚酞（批號(hào)：100091-199601）、咖啡因（批號(hào)：171215-201211）、呋塞米（批號(hào)：100544-201102）、西布曲明（批號(hào)：100624-200401）、N-單去甲基西布曲明（批號(hào)：520002-201301）、N，N-雙去甲基西布曲明（批號(hào)：520001-201301）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱取上述8種對(duì)照品適量，置25 m L量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制得濃度分別約為 0.5，1.0 mg/m L的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的配制

分別稱取1次服用劑量的片劑、膠囊，研細(xì)，置10 m L容量瓶中，加甲醇8 m L，超聲處理 15 m in，放冷并定容至刻度，取適量上述溶液于13 000 r/m in離心5 m in，上清液用甲醇稀釋10倍，進(jìn)樣分析。

2.3 色譜條件

色譜柱 Diamonsil C18柱 （4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相 0.02 mol/L乙酸銨溶液（0.1%乙酸）-甲醇；檢測(cè)器 DAD；檢測(cè)波長(zhǎng)范圍 210～400 nm；流速 1.0 m L/m in；柱溫 30℃；進(jìn)樣量10μL。在上述色譜條件下，取混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（見圖 1），可見8種成分分離完全。

梯度洗脫程序見表1。

表1 對(duì)照品溶液梯度洗脫程序

2.4 質(zhì)譜條件

采用 ESI源，正、負(fù)離子模式，霧化氣為氮?dú)?。具體質(zhì)譜參數(shù)：毛細(xì)管電壓3 500 V（＋），4 000 V（－）；干燥氣溫度 350℃，干燥氣流速10 L/m in，霧化氣壓力 40 psi，碎片電壓135 eV；掃描范圍（質(zhì)荷比）：100～ 1 000。

表2 8種違禁添加成分的監(jiān)測(cè)離子及相關(guān)參數(shù)

3 結(jié)果

3.1 專屬性

如圖1可見空白溶劑、混合對(duì)照品、陰性樣品的色譜圖，從圖中可以看出，專屬性良好。各個(gè)成分的紫外光譜、二級(jí)質(zhì)譜圖見圖2～ 3。

圖1 空白溶劑（A）、對(duì)照品（B）及陰性樣品（C）的HPLC色譜圖

圖2 減肥類保健食品中8種非法添加化學(xué)成分的紫外吸收光譜

圖2 減肥類保健食品中8種非法添加化學(xué)成分的紫外吸收光譜（續(xù)）

圖3 減肥類保健食品中8種非法添加化學(xué)成分的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖3 減肥類保健食品中8種非法添加化學(xué)成分的二級(jí)質(zhì)譜圖（續(xù)）

3.2 線性、檢測(cè)限、定量限

分別精密量取8種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇制成麻黃堿、芬氟拉明濃度為 0.02，0.04，0.1，0.2，0.4，1.0 mg/m L，咖啡因、呋塞米、酚酞、西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明濃度為 0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5 mg/m L的系列濃度混合對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積 A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，結(jié)果表明這8種成分在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（見表3）。

3.3 精密度、準(zhǔn)確度

取某一濃度的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，重復(fù)3天，計(jì)算其保留時(shí)間與峰面積的日內(nèi)精密度與日間精密度，結(jié)果顯示精密度良好（見表4）。

表3 8種化學(xué)藥物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

準(zhǔn)確度采用回收率試驗(yàn)。分別精密稱取陰性樣品0.15 g，共5份，各置10 m L量瓶中，加入混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇8m L，超聲處理10m in，放冷，用甲醇定容至刻度，13 000 r/m in離心5 m in，取上清液進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得8種物質(zhì)的平均回收率為 90.41%～ 105.97%，RSD均低于7.0%（見表5）。

表4 日內(nèi)與日間精密度試驗(yàn)結(jié)果

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

3.4 穩(wěn)定性

取某一濃度的混合對(duì)照品溶液及模擬樣品，分別考察其室溫放置自動(dòng)進(jìn)樣器24 h穩(wěn)定性，結(jié)果顯示穩(wěn)定性良好。

3.5 耐用性

取對(duì)照品溶液，分別用 Thermo BDS hypersil C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），WondaSil C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）檢測(cè)，結(jié)果顯示 8種成分能有效分離，表明本法耐用性良好。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取檢出呋塞米的陽(yáng)性樣品，共6份，按2.2項(xiàng)下供試品的制備方法平行操作，計(jì)算得呋塞米含量的RSD為1.9%。

3.7 樣品測(cè)定

取20批待檢樣品，按2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法處理，進(jìn)樣、分析。結(jié)果檢測(cè)到2批陽(yáng)性，見表6。

表6 陽(yáng)性樣品非法添加檢測(cè)結(jié)果（n=3）

4 結(jié)果與討論

4.1 萃取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)參考國(guó)家現(xiàn)有檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)研究的8種化學(xué)物質(zhì)在甲醇中的溶解度良好，使用甲醇超聲可以充分提取保健食品中非法添加的這幾種成分。所以，本實(shí)驗(yàn)最終確定采用甲醇超聲1次提取。

4.2 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)曾考察了甲酸、乙酸的分離效果，發(fā)現(xiàn)色譜峰拖尾嚴(yán)重，在流動(dòng)相中分別加入三乙胺、乙酸銨，發(fā)現(xiàn)1%三乙胺抑制色譜響應(yīng)，最終確定采用0.2 mol/L乙酸銨溶液（0.1%乙酸）為流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、乙腈的分離效果，發(fā)現(xiàn)其分離相近，考慮到實(shí)驗(yàn)成本，采用甲醇作為色譜分離的有機(jī)相。

4.3 結(jié)果的確證

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定8種成分的紫外吸收光譜差異，所以采用DAD記錄色譜峰的光譜圖，利用保留時(shí)間與光譜特征進(jìn)行定性分析，選取吸收均明顯的2個(gè)波長(zhǎng)做含量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC對(duì)樣品進(jìn)行分離，DAD掃描光譜，對(duì)疑似峰進(jìn)行ESI-QTOF/MS進(jìn)一步確證，保證了結(jié)果的科學(xué)、可信。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次將8種非法添加化學(xué)成分同時(shí)檢測(cè)，與現(xiàn)有國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)相比，提高了效率。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)方法專屬、靈敏、快速，可用于減肥類保健食品的日常檢驗(yàn)。

[1] 張曉丹，傅小英，陳靜，等.HPLC-DAD數(shù)據(jù)庫(kù)快速篩查減肥類中藥制劑及保健食品中的 10種非法添加化學(xué)藥物[J].中國(guó)新藥雜志，2012，21（2）：195-201.

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Screening and Determ ination of Eight Chem icals Illegally Added in Slimm ing Health Foods

Zhang Bin1，Yao Jiazhong2，Jia Changping1，Chen Libo1，Qian Yefei1，Lu Hui1（1 Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215104，China；2 Xinzhuangzi Hospital of Huainan Dongfang Hospital Group，Anhui Huainan 232072）

Objective:A HPLC-DAD and ESI-Q-TOF/MSmethod was established for screening and determination of phenolphthalein and other chemicals illegally added in slimm ing health foods including fenfluram ine，ephedrine，caffeine，furosemide，sibutramine and its two derivatives.Methods:C18column was used w ith themobile phase of 0.02 mol/L ammonium acetate solution （0.1%acetic acid）-methanol and gradient elution was conducted.The positive samples from HPLC-DAD test resultswere scanned by ESI-Q-TOF and confirmed by two grade of fragmention comparison.Results:Themethod validation showed that there was a good linear relationship of eight determ inands w ithin the range of 0.01～1.0 mg/m L by HPLC-DAD，the recovery rate was 90.41%～105.97%，and RSD was less than 7.0%.The detection limit was 0.10～ 1.68μg/m L and the lim it of quantification was 0.34～ 5.59μg/m L.Conclusion:This method is sensitive and reliable，it can be used for the qualitative and quantitative analysis of the eight components illegally added in slimming health foods.

HPLC-DAD；ESI-Q-TOF/MS；Slimming Health Food；Illegally Added Compound

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.03.006

2014-12-15）

張斌，男，碩士，藥師。研究方向：藥物質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。通訊作者E-mail：kimmynepia@vip.qq.com