★　李勝　(鷹潭市人民醫(yī)院藥劑科　江西 鷹潭335000)

當(dāng)藥苦苷體內(nèi)向香豆素類化合物轉(zhuǎn)化過程的研究

★李勝(鷹潭市人民醫(yī)院藥劑科江西 鷹潭335000)

摘要：目的：探究當(dāng)藥苦苷體內(nèi)向香豆素類化合物轉(zhuǎn)化的過程。方法：通過設(shè)計(jì)化學(xué)衍生化-LC/MS的方法對可能代謝物進(jìn)行檢測，當(dāng)藥苦苷的體外主要的代謝產(chǎn)物為紅百金花內(nèi)酯，于是采用衍生化的方法提高其檢測靈敏度。再經(jīng)過動物實(shí)驗(yàn)和肝微粒孵育進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：樣品處理后經(jīng)LC/MS經(jīng)色譜測定后，專屬性、精密度和準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等均滿足生物樣品分析，大鼠血漿中ECR定量分析，平均最高血藥濃度、最長吸收時間、最大藥時曲線面積分別為425.8±127.6ng/mL,128.6min,38.8μg/mL·min。結(jié)論：大鼠灌胃當(dāng)藥苦苷后血漿經(jīng)衍生化，成功在血漿中檢測到了紅百金花內(nèi)酯，當(dāng)藥苦苷首先在體內(nèi)被水解變成苷元，大部分苷元經(jīng)重排變成紅百金花內(nèi)酯，一個二氫香豆素，首次闡明了當(dāng)藥苦苷的大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其可以由單萜類化合物轉(zhuǎn)化為生物堿類和香豆素類化合物，并以代謝物的形式發(fā)揮藥效。豐富了環(huán)烯醚萜類化合物的體內(nèi)代謝研究方法。

關(guān)鍵詞：當(dāng)藥苦苷；香豆素；化學(xué)衍生化

當(dāng)藥苦苷是獐芽菜屬植物中分布最廣、含量最高的裂環(huán)烯醚萜氧糖苷類成分之一。相關(guān)研究[1-2]表明當(dāng)藥苦苷具有清肝利膽、解痙鎮(zhèn)痛、降低血脂和消炎抑菌等藥理作用，由于其具有較強(qiáng)的生物活性且擁有豐富的資源，具備深入研究開發(fā)的潛力，主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是紅百金花內(nèi)酯，為探索該代謝物的存在，本文采用衍生化-LC/MS的方法進(jìn)行觀察，并通過動物實(shí)驗(yàn)和肝微粒孵育進(jìn)行驗(yàn)證。

1材料

1.1試藥當(dāng)藥苦苷(純度>98%)、紅百金花內(nèi)酯(純度>98%)。DNPH(2,4-二硝基苯肼)，內(nèi)標(biāo)MFB(4-甲酰苯甲酸甲酯)購于sigma 公司。色譜級乙腈購于德國Merck公司。色譜甲醇購自美國Fisher公司。去離子水購自廣州屈臣氏。Wistar 大鼠(250±10)g(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心)。

1.2儀器Agilent 1200超高效液相色譜(美國Agilent公司);色譜柱采用Hypersil GOLD C18 色譜柱(50mm×2.1mm 粒徑1.9μm)(Thermo Fisher Scientific,Waltham ,MA);柱溫30℃;進(jìn)樣量為5ΜL;流動相A為1%甲酸和水，流動相B為1%甲酸和乙腈，流速0.4mL/min 。洗脫程序如下：0min 20%B, 2.5 min, 40% B; 4 min, 99% B；5 min 20% B,最后平衡1min，總時間為6min.質(zhì)譜檢測條件：Agilent 6520質(zhì)譜(美國安捷倫公司),毛細(xì)管電壓4000V，裂解電壓100V， 噴霧壓力 45 psi，干燥氣體(N2)流速9L/min， 干燥氣體溫度330℃，檢測范圍100-1000Da.檢測離子:伯醇衍生物m/z 355.0684[M+H]+,內(nèi)標(biāo)物衍生物m/z 343.0684[M+H]+。

2方法和結(jié)果

2.1樣品處理在進(jìn)行大鼠血漿中紅百金花內(nèi)酯衍生化-LC/MS方法的建立與大鼠灌胃給藥后，(1)紅百金花內(nèi)酯體外衍生化過程，分別向500μL 2.273mmol/L ECR 乙腈溶液，和500μL 1.22 mmol/L MFBC 乙腈溶液。混合后的溶液37℃放置1h。3mL乙酸乙酯：正己烷(1:5)加入到混合溶液中，渦旋，室溫靜置分層。上層溶液25℃ N2吹干，殘?jiān)?00μL甲醇復(fù)溶，LC-ESI-MS分析。(2)給藥后的大鼠血漿樣品衍生化200mg/kg當(dāng)藥苦苷水溶液灌胃給大鼠,0.17,0.33,0.5,1,2,4,6,8,10,12,24,36 和48h采血。200μL血漿中加入600μL乙腈，渦旋30s，4℃ 12000rpm離心10min，留上層溶液。取500μL上清液加入到EP管中，進(jìn)行衍生化。方法同紅百金花內(nèi)酯體外衍生化。(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置精密稱取一定量的ECR,MFBC(IS)用乙腈溶解，并各自稀釋成1mg/mL和10mg/mL的工作液。4℃環(huán)境保存。(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備內(nèi)標(biāo)液1μg/mL由稀釋原始工作液得來。取空白大鼠血漿90μL于1.5mL塑料離心管中，依次加入不同濃度的ECR標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液10μL,配置成藥物濃度范圍在0.5-500ng/mL(1, 25, 250ng/mL)的標(biāo)準(zhǔn)溶液。記為高濃度、中濃度、低濃度QC。

2.2法學(xué)考察

2.2.1精密度試驗(yàn)取空白物質(zhì)基質(zhì)，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法，分別在同一批內(nèi)和不同批間制備含紅百金花內(nèi)酯濃度為(1,25,250ng/mL)的質(zhì)控樣品，并分析測定。

日內(nèi)精密度：在一個工作日內(nèi)完成，要求隨行制備一條標(biāo)準(zhǔn)曲線和每一濃度制備5個樣品，每個樣品測定1次，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算3個濃度的變異系數(shù)。

2.2.2日間精密度在3個共日內(nèi)完成，每個工作日完成一個分析批的樣品測定，要求每一分析批內(nèi)制備一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個濃度一個樣品，每個樣品測定一次。用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算3個濃度的變異系數(shù)。

2.2.3回收率試驗(yàn)取空白物質(zhì)基質(zhì)，分別制備含紅百金花內(nèi)酯濃度為1，25,250ng/mL的質(zhì)控樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法處理并分析測定，與用流動相所制備的相同濃度樣品衍生化處理比較所得。

2.2.4衍生化過程大鼠灌胃當(dāng)藥苦苷后血漿經(jīng)衍生化，成功在血漿中檢測到了紅百金花內(nèi)酯,見圖1，對大鼠灌胃后的體內(nèi)紅百金花內(nèi)酯進(jìn)行檢測，色譜圖見圖2.

圖1　當(dāng)藥苦苷體內(nèi)代謝成紅百金花內(nèi)酯及其衍生化過程

圖2　血漿中紅白金花內(nèi)酯色譜檢測

-one 。

2.2.5專屬性樣品處理后經(jīng)LC/MS經(jīng)測定在上述色譜系統(tǒng)中，血漿中的內(nèi)源物質(zhì)及其他雜質(zhì)不干擾樣品的測定。各檢測物色譜行為較佳，紅百金花內(nèi)酯和4-甲氧基苯甲酸甲酯衍生物的保留時間分別為4.6min和5.1min。

2.2.6精密度和準(zhǔn)確度本方法中高、中、低三個濃度日內(nèi)和日間精密度分別<8.13,<6.19,準(zhǔn)確度在0.86%-5.13%之內(nèi)?；厥章?2.2%-70.8%。滿足生物樣品分析的要求,見表1 。

2.2.7穩(wěn)定性考察不同實(shí)驗(yàn)條件下，測定室溫放置一段時間后的大鼠血漿中紅百金花內(nèi)酯的濃度，以及-20℃放置3天后伯醇衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性，結(jié)果如表2。在進(jìn)樣瓶中放置16h，-20℃放置3天，溶液濃度無明顯變化,說明穩(wěn)定性良好。

表1紅百金花內(nèi)酯衍生物在大鼠血漿中的日內(nèi)精密度和日間精密度

樣品濃度/ng·mL-1日內(nèi)(n=5)CV/%RE/%日間(n=15)CV/%RE/%11.06±0.074.514.581.09±0.105.964.662525.59±0.773.362.6126.21±0.734.522.55250261.28±71.237.534.20261.52±56.245.303.54

表2　紅百金花內(nèi)酯和其衍生物的穩(wěn)定性

2.2.8大血漿中ECR定量分析二硝基苯肼衍生化成功用于紅百金花內(nèi)酯血藥濃度的測定。大鼠灌胃給藥當(dāng)藥苦苷水溶液200mg/kg后，根據(jù)藥時曲線平均最高血藥濃度，最長吸收時間，最大藥時曲線面積分別為425.8±127.6ng/mL,128.6min ,38.8μg/mL·min。

3討論

當(dāng)藥苦苷大鼠灌胃后，血漿用羰基試劑處理，得到了與羰基試劑結(jié)合的紅白金花內(nèi)酯衍生物。推斷可能是紅白金花內(nèi)酯與血中白蛋白發(fā)生共價結(jié)合[3]，羰基試劑把其置換，產(chǎn)生的衍生化產(chǎn)物具有很高的質(zhì)譜檢測靈敏度，于是被檢測到。以上對新代謝物的合成，從化學(xué)角度對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了準(zhǔn)確無誤的確認(rèn)，也為其活性測試做好了物質(zhì)準(zhǔn)備，當(dāng)藥苦苷首先在體內(nèi)被水解變成苷元，大部分苷元經(jīng)重排變成紅百金花內(nèi)酯，一個二氫香豆素，紅百金花內(nèi)酯在肝臟中被進(jìn)一步代謝成終產(chǎn)物3,4-dihydro-5-(hydroxymethyl) isochroman-1-one的硫酸結(jié)合物，并被排出體外。即環(huán)烯醚萜化合物當(dāng)藥苦苷在體內(nèi)最終被代謝成含氮化合物及香豆素。本研究對當(dāng)藥苦苷的體內(nèi)代謝過程進(jìn)行了研究,闡明了當(dāng)藥苦苷的大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其可以由單萜類化合物轉(zhuǎn)化為生物堿類和香豆素類化合物，并以代謝物的形式發(fā)揮藥效。

參考文獻(xiàn)

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Study on the Transformation Process of Swertiamain in Medicine to Coumarins

LI Sheng

People'sHospitalofYingtan,PharmacyDepartment，Yingtan335000,China.

Abstract:Objective: To explore the process of medicine of swertiamarin in vivo transformation to coumarins. Methods: Through the design of chemical derivative method -LC/MS of metabolites were detected, Swertia bitter glycosides in vitro primary metabolites as erythrocentaurin, so the use of derivative of the methods to improve the detection sensitivity. The animal experiment and the liver microsomal incubation were carried out to verify the. Results: The specificity, precision, accuracy and stability of the samples were analyzed by LC/MS, and the average blood concentration, the maximum absorption time and the maximum drug curve were 425.8±127.6ng/mL,128.6min,38.8μg/mL·min respectively. Conclusion: Rat irrigation stomach Swertia bitter glycosides by plasma via deriving biochemical, success in the plasma detected erythrocentaurin, Swertia bitter glycoside first in vivo was hydrolyzed into aglycones. Most of the aglycone by rearrangement into erythrocentaurin, a Dihydrocoumarin first clarify Swertia bitter glycosides of rats in vivo metabolites, found that it can into the monoterpene compounds of alkaloids, coumarins, and its metabolites in the form of play a pharmacodynamics. Study on the metabolism of the compounds in the body of the cyclic ethers.

Key words:Swertia Gentiopicroside;Coumarin;Chemical Derivatization

收稿日期：(2015-05-14)編輯：曾文雪

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A