徐敏，黃玨瑋，付瑤陽，張浩，方思維，郭雷，王方巖(溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江溫州505;溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院; 溫州醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院)

酪酸桿菌對水浸小鼠應(yīng)激性胃潰瘍的防治效果觀察

徐敏1，黃玨瑋2，付瑤陽1，張浩1，方思維3，郭雷2，王方巖1
(1溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江溫州325035;2溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院; 3溫州醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院)

摘要:目的探討酪酸桿菌對水浸應(yīng)激性胃潰瘍的預(yù)防治療作用及機(jī)制。方法將30只ICR小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、酪酸桿菌組各10只。酪酸桿菌組予酪酸桿菌菌液0.4mL(5×108cfu)灌胃，1次/d，連續(xù)5天。末次灌胃后饑餓24 h，模型組與酪酸桿菌組采用束縛水浸應(yīng)激法制作小鼠胃潰瘍模型。造模結(jié)束后頸椎脫臼處死小鼠，測定潰瘍面積并計(jì)算潰瘍面積百分率;采用HE染色法觀察各組胃黏膜組織損傷程度;免疫組化法檢測各組增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá);硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法分別檢測胃組織丙二醛(MDA)和超氧物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)。結(jié)果與模型組比較，酪酸桿菌組潰瘍面積明顯下降(P＜0.01);胃黏膜組織病理變化較輕;胃黏膜層細(xì)胞PCNA表達(dá)量顯著增加;胃組織MDA含量下降，SOD、CAT活性明顯提高(P均＜0.01)。結(jié)論酪酸桿菌可能通過減輕機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞增殖，減小潰瘍面積，減輕胃部病理變化，對水浸應(yīng)激性胃潰瘍發(fā)揮明顯的防治作用。

關(guān)鍵詞:胃潰瘍;抗?jié)兯?酪酸桿菌;防治作用;氧化應(yīng)激;水浸

應(yīng)激性胃潰瘍指當(dāng)機(jī)體遭遇各種強(qiáng)烈的有害刺激時(shí)引起的胃黏膜急性潰瘍及糜爛;其并發(fā)癥有出血、穿孔、幽門梗阻甚至癌變，若不及時(shí)治療，可導(dǎo)致死亡［1］。酪酸桿菌在治療腸道疾病方面已有幾十年的臨床應(yīng)用歷史，療效頗佳，但其在胃潰瘍方面的研究少有涉及［2］。酪酸桿菌主要代謝產(chǎn)物為丁酸和氫氣，丁酸是腸黏膜再生和修復(fù)的重要營養(yǎng)物質(zhì)，而氫氣具有廣譜的抗炎作用，同時(shí)對應(yīng)激性胃潰瘍也具有治療作用［3～5］。2012年4月～2013年5月，我們觀察了酪酸桿菌對小鼠水浸應(yīng)激性胃潰瘍的預(yù)防治療效果，現(xiàn)分析結(jié)果，探討其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料本實(shí)驗(yàn)室保藏酪酸桿菌株(CGMCC NO.8808); SPF級雄性ICR小鼠30只，體質(zhì)量(25 ±2)g，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心; BCA蛋白定量試劑盒，丙二醛(MDA)測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);超氧物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所); TPY液體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司);增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體(北京博澳森生物技術(shù)有限公司)。

1.2酪酸桿菌活化與傳代取適量酪酸桿菌活菌充分溶于5mL TPY培養(yǎng)基中，活化后將培養(yǎng)基置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。按4%的接種量接種傳代，至第三代活性最高，可用以灌胃治療。

1.3胃潰瘍模型制作與干預(yù)將30只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和酪酸桿菌組各10只。酪酸桿菌組予酪酸桿菌菌液0.4mL(5×108cfu)灌胃，1次/d，連續(xù)5天。正常組給予TPY培養(yǎng)基0.4mL灌胃，1 次/d，連續(xù)5天。末次灌胃后饑餓24 h，模型組和酪酸桿菌組制作應(yīng)激性胃潰瘍模型:戊巴比妥鈉0.15mL/10 g腹腔麻醉。將小鼠固定牢固，待其清醒后將其浸入(23±0.5)℃的水中8 h，水浸至劍突部。

1.4相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1潰瘍面積造模結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔，4只胃結(jié)扎幽門和賁門，向胃內(nèi)注入20%甲醛溶液后取下，并放入盛有10%甲醛溶液的燒杯中，靜置10min后取出沿胃大彎剖開，展開胃，用濾紙緩緩吸干水分，觀察胃潰瘍狀況，進(jìn)行掃描后再利用軟件Image-Pro Plus 6.0測量的數(shù)據(jù)計(jì)算出潰瘍面積百分率。潰瘍面積百分率=(潰瘍面積/胃總面

積)×100%。其他胃組織取下并在冰生理鹽水中輕輕涮洗，儲存于液氮中，用于生化指標(biāo)檢測。

1.4.2胃黏膜組織病理學(xué)變化采用HE染色法。將甲醛固定的胃進(jìn)行石蠟包埋，切片機(jī)切片，HE染色。將切片脫蠟水化后，放入蘇木素染色45 s，再用流水稍洗數(shù)秒。隨后用1%鹽酸乙醇分化切片，PBS緩沖液返藍(lán)，再將切片用伊紅染色，流水稍洗較長時(shí)間后進(jìn)行乙醇脫水，二甲苯透明，最后滴上中性樹膠進(jìn)行封片。HE染色后的病理切片制作完成后，鏡檢觀察胃黏膜病理學(xué)變化。

1.4.3胃黏膜組織PCNA表達(dá)采用免疫組化法。將甲醛固定的胃進(jìn)行石蠟包埋，切片機(jī)切片。將切片用進(jìn)行常規(guī)免疫組化反應(yīng)。免疫組化后的切片鏡檢觀察胃組織細(xì)胞PCNA抗體表達(dá)情況。根據(jù)參考文獻(xiàn)［6］確定PCNA表達(dá)及陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.4胃黏膜組織MDA含量及SOD、CAT活性測定采用硫代巴比妥酸法。取胃組織勻漿液，加樣、比色，各種試劑按試劑盒要求配制，按順序依次加入試劑及樣品，充分混勻，試管口用保鮮膜扎緊，用針頭刺一小孔，100℃水浴15min，取出后流水冷卻，1 000 r/min離心10min，取上清液于532 nm處測各管吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得MDA的摩爾濃度(μmol/gprot)。SOD活力測定采用黃嘌呤氧化酶法。取胃組織勻漿液，加樣、比色，試劑按試劑盒要求配制，按順序依次加入試劑及樣品，充分混勻，置37℃恒溫水浴40min后加顯色劑，混勻，室溫放置10min，于波長550 nm處，蒸餾水調(diào)零，比色，測各管吸光度(OD)值。SOD活力(U/mL)=(對照管OD值－測定管OD值)/對照管OD值/ 50%×(反應(yīng)液總體積/取樣量)。CAT活性測定原理: CAT分解H2O2的反應(yīng)可通過鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生淡黃色的絡(luò)合物，在405 nm處測定生成量，利用對照管和測定管的吸光度差異即可求出每毫克蛋白CAT活力(U/mg prot)。步驟:取胃組織勻漿液進(jìn)行測定，加樣、比色;各種試劑按試劑盒要求配制，按順序和分組依次加入試劑及樣品，混勻后于波長405 nm處，蒸餾水調(diào)零，測各管OD值。CAT活力(U/mgprot)=(對照管OD值－測定管OD值)×271/(60×取樣量)/待測樣本蛋白濃度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1潰瘍面積及百分率正常胃黏膜標(biāo)本無出血斑點(diǎn)。模型組胃黏膜可見片狀出血灶，部分黏膜脫落，上附有深黑色血痂。酪酸桿菌組胃黏膜局部皺縮，分布有少量點(diǎn)狀出血灶，上附有淺棕色血痂。見插頁Ⅰ圖3。酪酸桿菌組及模型組潰瘍面積百分率分別為21.75%±6.47%和84.63%±18.75%，兩組比較P＜0.01。

2.2胃黏膜組織病理學(xué)變化正常組胃黏膜結(jié)構(gòu)正常，清晰完整。模型組胃壁四層結(jié)構(gòu)層次清楚，上皮不完整，局部腺體結(jié)構(gòu)紊亂，腺腔內(nèi)較多脫落的上皮細(xì)胞碎片，胞質(zhì)染色淺，可見透明環(huán)狀空暈;黏膜表層可見多處帶狀缺損。酪酸桿菌組胃上皮缺損范圍小，腺體排列較整齊，其中酪酸桿菌組上皮深層結(jié)構(gòu)完整、連續(xù)。見插頁Ⅰ圖4。

2.3胃黏膜組織PCNA表達(dá)光鏡下觀察，正常組胃組織黏膜層細(xì)胞可見PCNA表達(dá)，呈強(qiáng)陽性。模型組胃組織黏膜層細(xì)胞PCNA幾乎無表達(dá)，酪酸桿菌組胃組織黏膜層細(xì)胞PCNA的表達(dá)與模型組比較則顯著增加，呈現(xiàn)強(qiáng)陽性。見插頁Ⅰ圖5。

2.4mDA含量及SOD、CAT活力各組MDA含量及SOD、CAT活性比較見表1。

表1　各組MDA含量及SOD、CAT活性比較()

表1　各組MDA含量及SOD、CAT活性比較()

注:與模型組比較，*P＜0.01。

組別　nmDA(μmol/g)SOD(U/mgprot)CAT(U/mgprot)正常組6　0.64±0.05　88.26±6.85　3.52±0.21模型組　6　2.90±0.48　34.07±5.50　1.44±0.14酪酸桿菌組　6　1.60±0.12*　51.67±2.55*　2.30±0.72*

3　討論

水浸應(yīng)激性胃潰瘍是由于受到應(yīng)激性刺激，交感神經(jīng)興奮，血管收縮，引起黏膜缺血、缺氧、抵抗力下降;同時(shí)副交感神經(jīng)-垂體-腎上腺系統(tǒng)興奮性增高，引起胃酸、胃蛋白酶和胃泌素分泌增加所致［1，5，6］。在應(yīng)激狀態(tài)下，由于損傷因素的刺激和保護(hù)機(jī)制的減弱，可出現(xiàn)下丘腦調(diào)控垂體等內(nèi)分泌腺體功能障礙、胃黏膜微循環(huán)障礙、壁細(xì)胞激活、胃黏膜屏障受損、迷走神經(jīng)興奮性異常增高、胃黏膜內(nèi)脂質(zhì)過氧化物含量升高和氧自由基產(chǎn)生增加等多方面的變化，最終導(dǎo)致潰瘍的發(fā)生和發(fā)展［6］。本研究中采用的束縛水浸應(yīng)激法能在較短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)胃潰瘍，這一模型已被廣泛用以研究應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)生機(jī)制以及治療藥物的篩選等方面。

本研究結(jié)果表明，與模型組比較，酪酸桿菌組潰瘍面積明顯減小，證實(shí)酪酸桿菌可減小潰瘍面積，提高潰瘍抑制率。酪酸桿菌組胃潰瘍黏膜組織病理變化明顯輕于模型組，證實(shí)酪酸桿菌對胃黏膜有保護(hù)作用。PCNA為反映細(xì)胞增殖情況的指標(biāo)，能夠判斷胃黏膜的損傷與修復(fù)情況。本研究通過免疫組化

發(fā)現(xiàn)，正常組胃組織黏膜層細(xì)胞可見PCNA表達(dá)，呈強(qiáng)陽性;模型組胃組織黏膜層細(xì)胞幾乎無PCNA表達(dá)，酪酸桿菌組胃組織黏膜層細(xì)胞PCNA的表達(dá)與模型組比較則顯著增加，呈現(xiàn)強(qiáng)陽性。提示酪酸桿菌對小鼠胃組織的修復(fù)再生有促進(jìn)作用。MDA是機(jī)體脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，其含量可間接反映機(jī)體受損傷程度。SOD、CAT是機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶體系，在正常情況下，由于機(jī)體內(nèi)含有SOD、CAT等自由基清除劑，使自由基得以及時(shí)清除，機(jī)體僅有少量自由基存在，這種氧化與抗氧化系統(tǒng)保持著動(dòng)態(tài)平衡，使機(jī)體免受危害，SOD、CAT活性可反映機(jī)體清除自由基的能力［7］。本研究結(jié)果顯示，酪酸桿菌組MDA明顯低于模型組，SOD和CAT活性明顯高于模型組，證實(shí)酪酸桿菌可減少M(fèi)DA的生成，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，以上結(jié)果進(jìn)一步證明了酪酸桿菌對水浸應(yīng)激性胃潰瘍具有良好的防治作用。

綜上所述，酪酸桿菌對水浸應(yīng)激性胃潰瘍有一定的防治作用;其機(jī)制可能與減輕機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。本研究為應(yīng)激性胃潰瘍的臨床治療及用藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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收稿日期:( 2014-09-14)

通信作者:王方巖，E-mail: wzyxywfy@126.com

基金項(xiàng)目:溫州市科技局項(xiàng)目(Y20130215);浙江省新苗計(jì)劃項(xiàng)目(2014R413032)。

文章編號:1002-266X(2015)36-0024-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R573.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.008