陳亞冰，蘭道亮，黃 勇，林寶山，黃 偲，李 鍵

(西南民族大學(xué) a 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，b 青藏高原研究院，四川 成都 610041)

麥洼牦牛TLR1基因組織表達(dá)分析

陳亞冰a，蘭道亮b，黃 勇a，林寶山a，黃 偲a，李 鍵b

(西南民族大學(xué) a 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，b 青藏高原研究院，四川 成都 610041)

【目的】 建立一種牦牛TLR1基因表達(dá)量的熒光定量PCR檢測(cè)方法，并分析TLR1基因在牦牛不同組織中的表達(dá)差異?！痉椒ā?參考牦牛TLR1基因序列，在其保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，并以牦牛β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因建立熒光定量方法；基于該熒光定量方法分析TLR1基因在牦牛心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃、乳腺、肌肉、卵巢11種組織中的表達(dá)水平?！窘Y(jié)果】TLR1基因和β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果呈現(xiàn)單一條帶，其產(chǎn)物熔解曲線均為特異的單峰，表明引物具有較高的特異性。組織表達(dá)結(jié)果顯示，TLR1基因在所檢測(cè)的牦牛11個(gè)組織樣本中均有表達(dá)，其中在腎、肝、脾、肺、卵巢、小腸中表達(dá)量較高，在胃、乳腺、心、大腸、肌肉組織中表達(dá)量較低?！窘Y(jié)論】TLR1基因在牦牛各組織中轉(zhuǎn)錄水平差異較大，這可能與各組織對(duì)病原體的識(shí)別和抵抗能力有關(guān)。

麥洼牦牛；TLR1；熒光定量PCR；組織表達(dá)譜

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)作為一種重要的模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors,PRRs)，能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)，在天然免疫系統(tǒng)、感染和炎癥期間可作為“哨兵”在檢測(cè)微生物配基中發(fā)揮重要的作用，另外TLRs能夠向抗原遞呈細(xì)胞發(fā)出警報(bào)，從而啟動(dòng)獲得性免疫系統(tǒng)，是連接天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)的橋梁[1-6]。迄今共發(fā)現(xiàn)11種人的TLR和13種小鼠TLR，每種TLR成員都能夠識(shí)別特異的微生物病原體PAMP。作為TLRs家族的成員，TLR1能夠與TLR2形成異源二聚體，從而協(xié)助識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性及陰性細(xì)菌細(xì)胞壁，并增強(qiáng)對(duì)PAMPs的特異性識(shí)別， 因此TLR1基因也被認(rèn)為是奶牛乳房炎易感性候選基因[7-9]。

TLRs在不同組織中的表達(dá)水平直接影響其對(duì)入侵該組織病原體的識(shí)別作用。目前，熒光定量技術(shù)已被用于檢測(cè)TLRs在人、小鼠、豬、羊等多個(gè)物種組織中的表達(dá)[10-13]，但利用熒光定量PCR方法分析TLRs 在牦牛不同組織中表達(dá)量的研究尚未見報(bào)道。牦牛是世代生活在高原環(huán)境下的特殊物種，其機(jī)體早已適應(yīng)了高原的低氧、嚴(yán)寒等惡劣環(huán)境。對(duì)牦牛的抗病分子機(jī)制進(jìn)行研究，一方面可以深入理解高原動(dòng)物特有的免疫機(jī)制，另一方面也可為牦牛的抗病育種提供理論依據(jù)。本研究利用熒光定量PCR方法檢測(cè)了牦牛體內(nèi)TLR1基因在不同組織中的表達(dá)水平，以期為牦牛的免疫機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 本試驗(yàn)所用麥洼牦牛母牛來(lái)自甘南藏族自治州夏河縣，共5頭。采集5頭母牛心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、肌肉、胃、卵巢、乳腺11種組織樣本，放入液氮中送回實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要儀器與試劑 熒光定量PCR儀及普通PCR儀，均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄酶及SYBR Premix ExTaqTMⅡ試劑盒，均購(gòu)自Takara公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)本課題組前期研究獲得的牦牛TLR1基因全長(zhǎng)序列(GenBank:KJ101605.1)及定量引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)熒光定量引物，引物序列見表1，引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2 組織RNA的提取及cDNA的合成

稱取約200 mg牦牛組織樣品置于研缽中，加入液氮進(jìn)行研磨，當(dāng)組織樣品被研磨成粉末狀后，加入1 mL的Trizol，室溫靜置直至樣品完全融化。吸取1 mL樣品至無(wú)RNA酶的離心管中，加入200 μL的氯仿，劇烈振蕩，室溫靜置5 min，4 ℃下13 000g離心15 min；小心吸取500 μL上清液，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min，4 ℃下13 000g離心10 min；棄上清，沉淀加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇洗滌，4 ℃下13 000g離心5 min；棄上清，室溫干燥沉淀，加入30 μL DEPC水溶解RNA。RNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),根據(jù)電泳結(jié)果是否具有3條清晰帶(28S、18S及5.5S 3條帶)判定RNA完整性。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA溶液的濃度及純度，分別在230,260和280 nm下測(cè)定吸光度(OD230、OD260、OD280)，計(jì)算OD260/OD280和OD260/OD230值。若RNA樣品的OD260/OD280值為1.8～2.0，且OD260/OD230值為2.0左右，說(shuō)明提取的RNA純度較高，適宜進(jìn)行下一步試驗(yàn)。RNA濃度測(cè)定后，取2 μg RNA合成cDNA。RNA需要首先進(jìn)行DNA去除處理，反應(yīng)體系為10 μL，其中5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL,gDNA Eraser 1 μL,RNA 2 μg,RNase Free dH2O補(bǔ)足到10 μL。該混合液42 ℃處理 2 min即去除了RNA溶液內(nèi)的DNA并得到反應(yīng)液1。將去除DNA的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL：反應(yīng)液1 10 μL ,PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL,Primer Mix 1.0 μL,5× PrimeScript Buffer2 4.0 μL,RNase Free dH2O 4.0 μL。按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s，生成的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物特異性的鑒定

以牦牛脾臟組織cDNA為模板，首先進(jìn)行普通PCR反應(yīng)，根據(jù)條帶是否單一來(lái)初步判斷引物的特異性。擴(kuò)增體系為25 μL，其中2×TaqMaster Mix 12.5 μL，dH2O 9.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用Axygen凝膠回收試劑盒回收純化目的產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有100 μg/mL氨芐青霉素的瓊脂平板上涂板，37 ℃培養(yǎng)后挑選單菌落，通過(guò)菌液PCR鑒定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析并提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒。將測(cè)序結(jié)果與目的基因進(jìn)行同源性比對(duì)，判斷擴(kuò)增片段的正確性。以牦牛組織樣本cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線是否單一來(lái)檢測(cè)引物的特異性。熒光定量PCR反應(yīng)體系為15 μL：SYBR Premix ExTaqTMⅡ 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL，dH2O 5.5 μL。PCR擴(kuò)增程序如下： 95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，39個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：95 ℃ 10 s,60 ℃ 1 min,然后以每10 s 0.5 ℃的速率從60 ℃緩慢升溫到95 ℃。

1.4 TLR1和β-actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

提取TLR1和β-actin基因的陽(yáng)性菌液質(zhì)粒，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各質(zhì)粒質(zhì)量濃度，并計(jì)算其含量(拷貝/μL)。將質(zhì)粒進(jìn)行稀釋，使質(zhì)粒含量為 1×101～1×1010拷貝/μL。以不同含量質(zhì)粒為模板進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，最后以質(zhì)粒含量的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的循環(huán)閾值(Ct)為縱坐標(biāo)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 TLR1基因在牦牛各組織中的表達(dá)

分別以5頭母牦牛11種組織cDNA為模板進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，采用Pfaffl method，以小腸基因表達(dá)量為對(duì)照，計(jì)算TLR1基因在其他各組織的相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)應(yīng)用SPSS 18.0軟件計(jì)算重復(fù)樣品之間Ct均值以及標(biāo)準(zhǔn)偏差，最后使用Excel制圖功能繪制出基因在牦牛各組織中的相對(duì)表達(dá)柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛RNA質(zhì)量的檢測(cè)

提取的牦牛總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可明顯看到28S、18S及5.5S rRNA 3條帶(圖1)，說(shuō)明提取的 RNA具有較高的完整性，無(wú)降解。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果表明，OD260/OD280為1.8～2.0，說(shuō)明提取的RNA純度較高，可用于反轉(zhuǎn)錄及后續(xù)定量試驗(yàn)。

2.2 TLR1和β-actin基因引物特異性檢驗(yàn)

普通PCR反應(yīng)被用于初步判定引物的特異性，結(jié)果顯示基因擴(kuò)增片段大小和預(yù)測(cè)結(jié)果一致(圖2)。TLR1基因擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果與牦牛TLR1基因(GenBank:KJ101605.1)同源性為100%，β-actin基因擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果與牦牛β-actin基因(GenBank:NM_173979.3)同源性為100%，表明引物擴(kuò)增片段正確。

TLR1及β-actin基因的熔解曲線見圖3和圖4。由圖3和圖4可以看出，β-actin基因在熔解溫度為(82±0.5) ℃、TLR1基因在熔解溫度為(82.5±0.5) ℃時(shí)出現(xiàn)特異性單峰，表明該引物特異性良好。

2.3 TLR1和β-actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

當(dāng)質(zhì)粒含量為102～107拷貝/μL時(shí)，β-actin基因擴(kuò)增效率達(dá)到了95.4%，相關(guān)系數(shù)為0.999(圖5)；質(zhì)粒含量為101～108拷貝/μL時(shí)，TLR1基因擴(kuò)增效率達(dá)到了100.4%，相關(guān)系數(shù)為0.999(圖6)。

2.4 TLR1基因在牦牛組織中的表達(dá)分布

以β-actin基因作為內(nèi)參基因，以小腸基因表達(dá)量為對(duì)照，分析TLR1基因在牦牛其他10種組織中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見圖7。

圖7 牦牛TLR1基因組織表達(dá)譜
Fig.7 Expression ofTLR1 gene in yak

圖7結(jié)果顯示，TLR1基因在所檢測(cè)的牦牛11個(gè)組織樣本中均有表達(dá)，其中在腎、肝、脾、肺、卵巢的相對(duì)表達(dá)量較高，在胃、乳腺、心、大腸、肌肉組織中的相對(duì)表達(dá)量較低。

3 討 論

TLRs作為一種模式識(shí)別受體，不僅在天然免疫中起重要作用，同時(shí)也是天然免疫和獲得性免疫的連接點(diǎn)，可以介導(dǎo)獲得性免疫應(yīng)答[14]。對(duì)TLRs的研究可以幫助理解動(dòng)物病原體被識(shí)別的本質(zhì)，為闡明天然免疫機(jī)制及尋找由于免疫失調(diào)所致疾病的治療提供新的思路。牦牛是青藏高原上的一個(gè)特有物種，其機(jī)體可能存在特殊的抗病免疫機(jī)制。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)，牦牛TLR1基因與其他平原哺乳動(dòng)物相應(yīng)基因具有較高的同源性，因此比較牦牛組織表達(dá)模式差異將是下一步重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。本試驗(yàn)采用SYBR Green I熒光嵌合染料方法檢測(cè)了牦牛體內(nèi)TLR1基因轉(zhuǎn)錄水平，SYBR Green I能夠與任何一種雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)出熒光，其PCR反應(yīng)特異性取決于擴(kuò)增引物的特異性。熔解曲線結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物呈特異性良好的單峰，沒(méi)有其他雜峰，測(cè)序結(jié)果證明擴(kuò)增產(chǎn)物為TLR1基因,證明引物的特異性良好。另外，本試驗(yàn)采用相對(duì)定量方法，通過(guò)內(nèi)參β-actin基因來(lái)校準(zhǔn)TLR1基因mRNA表達(dá)量，這既保證了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性又提高了試驗(yàn)效率。研究發(fā)現(xiàn)TLR1基因組織分布比較廣泛[12-15]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相符合。TLR1的主要功能是協(xié)助TLR2增強(qiáng)對(duì)PAMPs的識(shí)別能力，TLR2與TLR1形成的異源二聚體可識(shí)別分枝桿菌三酰脂蛋白，并能夠增強(qiáng)對(duì)PAMPs的特異性識(shí)別，因此TLR1也被認(rèn)為是乳房炎易感性候選基因。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR1基因在乳腺組織中的相對(duì)表達(dá)量較低，這可能與試驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體未患乳房炎有關(guān)。Vahanan等[15]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TLR1基因在水牛肝臟、肺臟、脾臟、心臟中表達(dá)量較高，而在腎臟、卵巢中的表達(dá)量較低或者不表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，TLR1基因在牦牛肝、肺、脾表達(dá)量較大，這與Vahanan等[15]的研究結(jié)果相符合；而TLR1基因在牦牛腎臟和卵巢中的表達(dá)量也較高，這可能與牦牛局部組織免疫相關(guān)。趙一萍等[16]對(duì)TLR1基因在蒙古馬不同組織內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)TLR1基因在蒙古馬肺臟組織中表達(dá)量最高，同時(shí)在心臟、肝臟、脾臟、腎臟等也有表達(dá)，這與本研究結(jié)果基本符合，并進(jìn)一步證明了TLR1在不同哺乳動(dòng)物體內(nèi)扮演著重要的免疫角色。

關(guān)于人和小鼠Toll樣受體組織定量的研究較多，并且許多物種的TLRs檢測(cè)方法已經(jīng)建立[17-20]，而對(duì)牦牛Toll樣受體的研究報(bào)道相對(duì)較少。本試驗(yàn)利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)牦牛器官及組織TLRs mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究，為下一步研究牦牛機(jī)體內(nèi)TLRs免疫機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。當(dāng)然，僅檢測(cè)TLRs mRNA轉(zhuǎn)錄水平不能完全代表Toll樣受體蛋白的表達(dá)水平，TLRs在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平差異是否影響到蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，從而影響TLR1蛋白與下游配體的結(jié)合能力，最終影響下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞因子的釋放，還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，本研究下一步將比較分析TLR1基因在牦牛和其他牛中表達(dá)量的差異，從而確定TLR1基因在牦牛體內(nèi)的表達(dá)是否存在特異性。

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Expression analysis ofTLR1 gene in different tissues of Maiwa yak

CHEN Ya-binga,LAN Dao-liangb,HUANG Yonga,LIN Bao-shana,HUANG Caia,LI Jianb

(aCollegeofLifeScienceandTechnology,bCollegeofTibetanPlateauResearch,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan610041,China)

【Objective】 The study was designed to establish a real-time PCR assay for detection ofTLR1 gene,and to further analyze the expression pattern in tissues of yaks.【Method】 According to the sequence of yakTLR1 gene,the real-time PCR primers were designed,the real-time PCR was established,and theβ-actingene was chosen to normalize the expression level ofTLR1 gene.The established detection method was used to analyze the expression pattern ofTLR1 gene in different tissues of yak,including heart,liver,spleen,lung,kidney,large intestine,small intestine,stomach,mammary gland,muscle and ovary.【Result】 The electrophoresis results showed that bothTLR1 gene andβ-actingene included a signal band.The melting curve of target product showed that the product was specific to a single peak,suggesting the specificity of primers.Moreover,real-time quantitative PCR assay was established and used to detect the relative expression level ofTLR1 gene in different tissues,and the gene expression level in small intestine was selected as a baseline.The quantitative results showed thatTLR1 gene was expressed at eleven tissues examined.TLR1 gene had high expression levels in kidney,liver,spleen,lung,ovary,small intestine and low levels in stomach,mammary gland,heart,large intestine and muscle.【Conclusion】 There were differences on the transcription levels ofTLR1 mRNA in different tissues,which may be associated with the ability to recognize and defend pathogens for different tissues.

Maiwa yak;TLR1;real-time PCR;expression pattern in tissues

2014-04-18

中央高校青年教師基金項(xiàng)目(2014NZYQN37)

陳亞冰(1989-),男，河南許昌人，碩士，主要從事高原動(dòng)物免疫分子機(jī)制研究。E-mail:cybxc923410296@126.com

李 鍵(1967-)，男(藏族)，四川理縣人，教授，博士，主要從事動(dòng)物生殖調(diào)控研究。E-mail:lijian@swun.cn

時(shí)間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.011

Q786；S823.8+5

A

1671-9387(2015)01-0001-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.011.html