舒加樂， 鄒亞娟， 孫新明, 金承鈺

(上海交通大學 分析測試中心， 上海 200240)

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大氣細顆粒物致C57小鼠急性肺損傷的試驗

舒加樂， 鄒亞娟， 孫新明, 金承鈺

(上海交通大學 分析測試中心， 上海 200240)

研究大氣細顆粒物(PM)的急性毒效應對C57BL/6小鼠的肺及生理條件損傷的影響。用空氣采樣器采集大氣中直徑≤1.0 μm的懸浮顆粒物，以C57BL/6小鼠為試驗對象，采用氣管滴注的染毒方法，分空白對照組、生理鹽水對照組和染毒組，于染毒前、后24 h取20 μL全血用于血細胞分析，24 h后取肺及肝臟組織做電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP)元素分析。所收集PM1.0顆粒符合相關報道；染毒組血細胞分析自身對照發(fā)現(xiàn)染毒后有明顯感染癥狀；組織器官中肺組織中硅元素含量變化具有臨床觀察意義。大氣細顆粒物的吸入會引起小鼠的肺部炎癥及機體的免疫反應，從而造成對肺組織相關元素含量的改變。

大氣細顆粒物； 急性肺損傷； 血細胞分析； 電感耦合等離子體

0 引 言

PM1.0(Particulate Matter，PM)也稱大氣細粒子，指的是空氣中空氣動力學直徑≤1.0 μm的懸浮顆粒物，其粒徑小、比表面積大，易于富集空氣中的有毒有害物質，并可以隨著人的呼吸進入體內(nèi)，甚至進入到肺泡和血液中，導致各種疾病，它還是能見度降低的罪魁禍首。顆粒物粒徑大小不同,被吸入并沉積在呼吸系統(tǒng)的部位也就不同,對機體危害也有明顯差異。

有研究表明，PM短期波動會影響心血管疾病的就診率和入院率。Bell等[1]開展了美國202個城市 PM2.5變化與急診就診率關系的研究 ，發(fā)現(xiàn) PM2.5濃度每增加 10 μg/m3，心血管疾病急診就診率增加0．8%(95%CI：0.59%～1.01%)。王宛怡等[2]報道，北京市大氣PM10濃度每上升l0 μg/m3，當日心血管疾病門、急診的就診人次增加0．4%，滯后4 d的健康效應更明顯，就診率增加1．17%(95%CI：1.12%～1.21%)。基于對PM2.5健康危害的認識，細顆粒物目前已受到了全世界的普遍關注。美國EPA已經(jīng)于1997年頒布了細顆粒物空氣質量標準[3]，年均值為0.015 mg/m3,日均值為0.065 mg/m3，其限制非常嚴格。我國是顆粒物污染嚴重的國家，但細顆粒物的污染特征及對健康影響的研究目前仍處于起步階段。以往的研究資料以總懸浮性顆粒物(TSP)和吸入性顆粒物(PMIO)為主，關于PM1.0對健康影響的動物試驗資料還很缺乏。本試驗就從血液生理影響和肺實質器官微量元素變化兩方面探討PM1.0對小鼠肺組織急性損傷的作用機理。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

(1) 試劑。元素標準為Sigma公司產(chǎn)品，其他均為國產(chǎn)分析純，實驗用水為雙蒸水。

(2) 儀器。武漢天虹TH-150C型中流量采樣器(流量100 L/min)，分別配置PM2.5和PM1.0的切割頭、低溫高速離心機、三分類血細胞分析儀(pocH-100iv diff，Sysmex，Japan)、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP, Iris Advantage1000,ThermoJarrell ,USA)、激光動態(tài)光散射儀(PCS, Zetasizer Nano S, Malvern, UK)，掃描電子顯微鏡(SEM-EDS, Sirion200, FEI, USA-Oxford, UK)，凍干機(FreeZone?Stoppering Tray Dryers FreeZone?6, Liter，USA)。

1.2 PM1.0的采樣和處理

(1) 樣品的采集。采樣濾膜為直徑90 mm的玻璃纖維濾膜,選擇交通大學閔行校區(qū)綜合實驗樓。采樣時間上午8:00至次日上午8:00。采樣器距地面約20 m。

(2) 樣品的處理。顆粒物收集前后均在20℃稱量濾膜，計算出每個濾膜上總顆粒物的質量。將載有顆粒物的濾膜裁剪為小塊，浸入去離子蒸餾水中，超聲振蕩30 min×4次，洗脫顆粒物，震蕩液經(jīng)6層紗布過濾，濾液離心后收集下層懸液冷凍真空干燥，得到PM1.0在-20℃保存，染毒時，用0.9%生理鹽水配制成需要的濃度，使用前超聲振蕩15 min混勻。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組方法

選擇雄性C57BL/6品系小鼠[4]，由中國科學院提供，體重23～29 g,共12只。所有的小鼠均飼養(yǎng)在SPF級動物房中，依照體重，將C57BL/6品系小鼠隨機分成3組，每組4只，分別是空白組、生理鹽水對照、PM1.0染毒組。

1.3.2 染毒的方法

計算出凍干的PM顆粒粉末受毒劑量14 mg/kg，用生理鹽水配制成7 mg/mL濃度的受毒液，采用氣管滴注的方式染毒，氣管滴注量按照2 mL/kg BW單次染毒。

1.3.3 樣品采集

(1) 全血采集。在染毒前后的24 h，小鼠尾靜脈采血20 μL于EDTA-K2抗凝管中。30 min內(nèi)做血細胞分析。

(2) 組織臟器采集。小鼠染毒24 h后處死，采集肺臟及肝臟，用濾紙吸干稱量后鋁箔紙包裹4℃保存并送樣。

1.4 樣品處理

1.4.1 大氣細顆粒物(PM1.0)性狀分析

采用DLS表征測試手段分析染毒液體中PM顆粒的分布情況，SEM觀察PM顆粒的分散性以及尺度。

1.4.2 三分類全血細胞儀血液常規(guī)值分析

1.4.3 ICP-MS元素分析

直接取新鮮肺臟及肝臟組織放置于聚四氟乙烯消解罐中，加5 mL濃硝酸，次日加1 mL 30%H2O2，隨后微波消解，使用2%硝酸定容至10.0 mL之后用于ICP分析。

測試組織中8種微量元素Ca、Cu、Fe、Mg、Mg、Se、Si、Zn在臟器組織中的含量變化。

2 結 果

2.1 PM1.0顆粒表征

采用PCS、SEM等表征PM1.0顆粒的形態(tài)、原始尺度以及溶液中分散形態(tài)。由圖1(a)可見，染毒液中PM顆粒分布主要以兩種平均粒徑為主(φ≈0.1～0.8 μm)，均小于1 μm。圖1(b)為不同放大倍率的SEM掃描圖，由圖可見,此次收集的大氣細顆粒物多為圓形顆粒物，粒徑約1 μm，但存在部分聚集顆粒。由PCS和SEM結果可以認為染毒液中的顆粒尺度符合PM1.0的描述標準。

2.2 C57BL/6小鼠血液學數(shù)值測定結果

血液常規(guī)值測定結果如表1所示，14個測定項目，血液學數(shù)值染毒前后自身比對?？瞻讓φ战M平均血紅蛋白濃度(MCHC)上升、粒細胞總數(shù)(W-LCC)下降，差異達到顯著水平P<0.05；生理鹽水對照組白細胞(WBC)上升、血紅蛋白(HGB)下降、血細胞壓積(HCT)下降、血小板(PLT)下降、淋巴細胞總數(shù)(W-SCC)上升、粒細胞總數(shù)(W-LCC)上升，差異達到顯著水平P<0.05；染毒組白細胞(WBC)下降、血紅蛋白(HGB)下降、中間細胞百分數(shù)(W-MCR)下降、淋巴細胞總數(shù)(W-SCC)上升，差異達到顯著水平P<0.05，血小板(PLT)下降，差異達到極顯著水平P<0.01。

(a) PCS對PM1.0顆粒粒徑的表征

(b) SEM對PM1.0顆粒形態(tài)的表征

圖1 PM1.0顆粒表征

2.3 肺組織中元素含量對照

8種微量元素在肺組織中含量的變化結果見表2。① 生理鹽水對照組與空白對照組相比較硅元素變化差異顯著P<0.05。② 染毒組與空白對照組相比較鈣、鎂元素變化差異顯著P<0.05；硅元素差異變化極顯著P<0.01。

2.4 肝臟組織中元素含量對照

8種微量元素在肺組織中含量的變化結果見表3。① 生理鹽水對照組與空白對照組相比較元素變化無明顯差異P﹥0.05。② 染毒組與空白對照組比較，鎂元素差異變化顯著P<0.05。

表1 C57BL/6小鼠染毒后24 h血液學數(shù)值測定結果

注：自身比較，*P<0.05，**P<0.01，↑均值上升，↓均值下降

表2 肺組織中元素含量分析 mg/L

注：組間比較，*P<0.05，**P<0.01

表3 肝臟組織中元素含量分析 mg/L

注：組間比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導致的急性、進行性呼吸衰竭。引起急性肺損傷的原因或高危因素很多，可以分為肺內(nèi)因素(直接因素)和肺外因素(間接因素)。炎癥反應、肺組織損傷和纖維化是急性肺損傷主要的發(fā)病機制和病理改變。小鼠的血液生理正常指標會隨著種群、性別、周齡、飼養(yǎng)環(huán)境等一系列的環(huán)境因素改變而改變[5-7]。所以本次試驗以小鼠血液生理指標觀察肺損傷后的炎癥反應，并以小鼠自身試驗前后的指標相比較，來探討實驗結果。Sorensen[8]以人群為研究對象發(fā)現(xiàn), 個體PM2.5的接觸量與血中血小板數(shù)和纖維蛋白原濃度無關, 與紅細胞、血紅蛋白濃度僅在女性中發(fā)現(xiàn)有明顯關系( PM2.5每上升10 μg/ m3紅細胞數(shù)上升2.3%,P<0.01; 血紅蛋白濃度上升2.6%,P<0.01) 。Donaldson[9]認為紅細胞數(shù)上升可使血黏度增加, 而血黏度增加是導致心血管疾病的危險因素。本次試驗為急性毒性試驗，所以空白組對照組平均血紅蛋白量(MCH)、粒細胞總數(shù)(W-LCC)差異雖然達到顯著水平(P<0.05),但是沒有比較學意義。生理鹽水對照和染毒組中白細胞(WBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)、淋巴細胞總數(shù)(W-SCC)都有差異性變化且總趨勢表現(xiàn)為炎性感染的淋巴細胞增多，而染毒組中血小板(PLT)下降差異達到極顯著水平(P<0.01)。這些血液指標的差異可以有限地反映出急性炎癥感染情況。所以從本試驗看，不管是生理鹽水還是PM液體給動物鼻腔受毒，都會引起動物的炎性反應，而PM顆粒受毒時，炎性癥狀會更明顯，即PM顆粒溶液對動物機體的危害性更大。

有關人體臟器組織中微量元素的含量國內(nèi)外已有大量的文獻報道，而對于動物尤其是實驗動物的相關報道卻很少。測定實驗動物微量元素的含量對醫(yī)學研究中建立實驗動物模型及探討微量元素在生理和病理過程中的作用有著重要的意義。幾乎所有的必需礦物元素，無論是常量還是微量元素，在細胞體內(nèi)都具有一種或多種催化功能。Clarke 等[10]給狗吸入濃集的大氣細顆粒物( Concentrated Ambient Particles, CAPs) 發(fā)現(xiàn), 當采用混合線性回歸統(tǒng)計后, 顆粒物的具體組分與狗的生物學反應密切相關。如CAPs 中的硫酸鹽濃度與外周血白細胞計數(shù)增加相關, 炭黑、鋁、錳、硅、鋅等元素與血液中多形核白細胞數(shù)目增加有關, 鈉元素可以引起血液淋巴細胞數(shù)目的增加, 而鋁、錳、硅則可減少淋巴細胞的數(shù)量等。采用因素分值法分析后還發(fā)現(xiàn), 支氣管肺泡灌洗液( Bronchoalveolar Lavage, BAL) 中性粒細胞百分比和外周血白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數(shù)目的增加與鋁、硅元素密切相關; BAL 中巨噬細胞和血液中性粒細胞數(shù)量的增加與釩、鎳元素有關; 血液紅細胞計數(shù)、血紅蛋白水平的明顯下降與硫元素有關。這些數(shù)據(jù)都提示了細顆粒物的吸入有可能使健康機體的肺功能和血液系統(tǒng)產(chǎn)生微妙的變化, 而血液細胞數(shù)量與組成的變化有可能是造成日后心血管病變的一個潛在隱患。本次試驗根據(jù)相關文獻[10-14]選出8種微量元素，測試其在實驗動物器官(肺及肝臟)中的元素含量變化。發(fā)現(xiàn)在肺組織中硅的元素變化差異極顯著(P<0.01)。這與Batalha 等[ 15]的研究結果相吻合。Batalha 等發(fā)現(xiàn)短期接觸濃集的細顆粒物( CAPs) , 健康的SD 大鼠和患慢性支氣管炎( CB) 的SD 大鼠的肺小動脈都會發(fā)生收縮( 測血管的L/W比值, 即血管腔直徑與血管壁厚度之比) , 而該效應與CAPs 的濃度和它的組成顆粒(硅、硫酸鹽、鉛、元素碳及有機碳等)的成分濃度有關。之所以產(chǎn)生這些變化，分析其可能的原因，其中比較合理的解釋是因為硅顆粒表面的氧自由基可導致活性氧生成增加及前炎癥因子產(chǎn)生, 因此認為可能是氧自由基在起作用[16-17]。本次試驗在肝臟組織中發(fā)現(xiàn)含量變化顯著的鎂元素在急性毒性實驗中作為數(shù)據(jù)參考值，就不做比較學討論。

4 結 語

關于PM1.0對機體的損傷機制是一個及其復雜過程，本次試驗只是初步探討了血液生理指標和組織臟器微量元素含量改變在PM1.0急性肺損傷中的作用，從實驗中我們得到了動物免疫力下降并伴有炎癥感染的結果，也發(fā)現(xiàn)了染毒后肺組織臟器中硅元素含量的明顯變化。對于PM1.0對健康影響的其他途徑，以及各途徑之間的共同作用和相互聯(lián)系，乃至作用之后具體的調(diào)節(jié)方式，都需要今后更加深入并完善我們的試驗研究方案。我們期待設計更加合理的流行病學和生物學研究方向，為PM引起的疾病防治提供更加充實的證據(jù)，服務于我國大氣污染的控制和公眾健康水平的提高。

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Acute Pulmonary Injury Induced by Atmospheric Particulate Matter in C57Mice

SHUJia-le,ZOUYa-juan,SUNXin-ming,JINCheng-yu

(Instrumental Analysis Center, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China)

The study is to explore the acute pulmonary toxicity effects on C57BL/6 mice of atmospheric fine particulate matter (PM) and conditions of physiological injury. PM1.0was collected by dust sampling, C57BL/6 mice were considered as test subjects. By using intratracheal instillation exposure method, these mice were divided into three groups: sub-control group, saline control group and the treated groups. 20 μL whole blood was taken prior to exposure and 24 hours after exposure for blood cell analysis, and lung and liver tissues were examined by ICP for elemental analysis. PM1.0particles collected in line with the relevant reports; obvious symptoms of infection were found in exposed groups via self-control analysis of blood cells after exposure; changes in lung tissue and organ tissue of silicon content had clinical significance. Inhaled airborne fine particulate matter could cause the immune response, result in changes in the lung tissue of mice relevant element contents.

particulate matter(PM); acute lung injury; blood cell analysis; inductively coupled plasma(ICP)

2014-08-01

舒加樂(1979-)，男，上海人，碩士生，研究方向：實驗動物生理、病理。Tel.：021-34207514-104；E-mail：salenshu@sjtu.edu.cn

金承鈺(1974-)，女，江蘇常州人，博士，副研究員，研究方向：納米顆粒安全生物安全性評價。

Tel.：13916696268；E-mail：cyjin@sjtu.edu.cn

Q 954

A

1006-7167(2015)03-0058-05