楊 巍 ，任雪嬌，崔學宇，慈佳賓，任啟彪，楊偉光,吳春勝

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，吉林 長春 130118；2 吉林省種子管理總站，吉林 長春 130062)

玉米單倍體誘導系JS6-2誘導效果的研究

楊 巍1，任雪嬌1，崔學宇1，慈佳賓1，任啟彪2，楊偉光1,吳春勝1

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，吉林 長春 130118；2 吉林省種子管理總站，吉林 長春 130062)

【目的】 探討玉米單倍體誘導系JS6-2對不同基礎材料、不同授粉時期和果穗不同部位的誘導效果，為玉米單倍體育種技術(shù)的應用提供理論依據(jù)?！痉椒ā?以玉米單倍體誘導系JS6-2為誘導材料，Stock6和農(nóng)大高誘1號為對照，對不同基礎材料進行了雜交誘導，同時比較了不同授粉時期、不同果穗部位對單倍體誘導率的影響。【結(jié)果】 JS6-2對自交系及雜交種均具有誘導產(chǎn)生單倍體的能力，對自交系誘導中，JS6-2單倍體誘導率(8.29%)明顯高于農(nóng)大高誘1號(1.70%)和Stock6(0.66%)；對雜交種誘導中，JS6-2單倍體誘導率(8.22%)同樣明顯高于其他2個誘導系(1.35%和0.76%)。JS6-2雜交誘導單倍體最佳時期為雌穗吐絲后3～8 d；果穗頂部的單倍體誘導率(6.87%)高于底部(5.61%)。【結(jié)論】 玉米單倍體誘導系JS6-2的誘導效果明顯好于農(nóng)大高誘1號和Stock6；Reid、No Reid材料以及Reid×DOM和No Reid×DOM雜優(yōu)模式材料的單倍體誘導率高；田間雜交誘導時，建議在雌穗吐絲3～5 d整齊剪斷花絲進行雜交誘導，單倍體誘導效果好。

玉米；單倍體誘導系；誘導效果

玉米單倍體育種(Haploid Breeding)技術(shù)是傳統(tǒng)育種技術(shù)的革命，與分子育種技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)形成了現(xiàn)代玉米育種技術(shù)的新體系[1-4]。國內(nèi)外各大公司、科研院所和高等院校相繼開展了玉米單倍體育種，以加速培育玉米優(yōu)良自交系、育成新品種步伐，并應用于玉米育種實踐[5]。然而玉米單倍體育種受兩個因素限制：一是難以獲得足夠數(shù)量的單倍體，即單倍體誘導率低，Stock6僅為3%[6-9]；二是單倍體二倍化困難，即加倍率低，單倍體植株的自然加倍率僅在0.4%～1.2%[10]。玉米單倍體誘導效率的提高可以大大提升單倍體育種的效率，同時可以節(jié)約育種成本[11-12]。因此，如何提高單倍體誘導效率一直是人們探索的重要課題。研究表明，單倍體誘導率的高低與不同基礎材料及雜交組合的雙親有關(guān)；同一父本誘導系對不同母本雜交誘導產(chǎn)生的單倍體頻率均存在著顯著差異[6,9]。本研究以自選單倍體誘導系JS6-2為父本，Stock6和農(nóng)大高誘1號為對照，研究誘導系JS6-2對玉米不同母本基因型材料、不同授粉時期、果穗不同部位的誘導效果，以期為玉米單倍體育種奠定基礎。

1 材料與方法

供試材料為吉林農(nóng)業(yè)大學2007年以Stock6/吉高誘3為基礎材料，采取南北穿梭育種，于2010年育成的誘導率高、遺傳標記明顯的高頻率單倍體誘導系JS6-2。Stock6和農(nóng)大高誘1號(Cau ho 1)為外引誘導系。本試驗共進行如下3方面處理。

1.1 不同母本基礎材料對單倍體誘導率的影響

用于誘導的基礎材料包括自交系和雜交種2種，其中，10個骨干自交系為2011年由中國東北春玉米區(qū)選擇，10個雜交組合為10個自交系以不同雜種優(yōu)勢模式組配而成(表1)。

注：DOM為旅大紅骨群+塘四平頭群。表2同。

Note:DOM stands for Lüda Red Cob and Tangsipingtou germplasms.The same for table 2.

2012年夏，于吉林農(nóng)業(yè)大學種子工程玉米育種基地，以基礎材料為母本，JS6-2、Stock6、農(nóng)大高誘1號為父本，于母本吐絲后3～4 d后進行雜交誘導。每個基礎材料10～20穗，收獲后挑選無色胚芽尖、紫色粒頂?shù)淖蚜闇蕟伪扼w。2012年冬，于吉林農(nóng)業(yè)大學海南育種基地，結(jié)合植株標記進行進一步的田間鑒定。依據(jù)田間鑒定結(jié)果統(tǒng)計單倍體誘導率。單倍體誘導率=(準單倍體粒數(shù)/雜交總粒數(shù))×100%。

1.2 不同授粉時期對單倍體誘導率的影響

2012年和2013年，于吉林農(nóng)業(yè)大學海南育種基地，以鄭單958、吉農(nóng)玉833、農(nóng)華101、吉農(nóng)玉719為母本，父本誘導系為JS6-2，選擇不同授粉時期進行授粉。根據(jù)母本雌穗吐絲后的時間進行授粉時期的劃分：剪開苞葉授粉定義為0 d，剛吐絲時定義為1 d，依次往后記錄吐絲后的時間。具體分為以下3個處理：早期授粉0～2 d，中期授粉3～5 d，晚期授粉6～8 d。單倍體統(tǒng)計與鑒定同1.1節(jié)。

1.3 不同果穗部位單倍體誘導率的差異

2012年冬，選用5個雜交種鄭單958、先玉335、利民33、農(nóng)華101、吉農(nóng)玉833，種植于吉林農(nóng)業(yè)大學海南三亞育種基地，其遺傳基礎見表2。以誘導系JS6-2為父本，雜交誘導各雜交種30穗。收獲后選擇結(jié)實性好的果穗，按底部(約為果穗長度的1/2)和頂部(同上)分開脫粒。脫粒后根據(jù)籽粒遺傳標記進行單倍體的初步鑒定。2013年夏，在吉林長春對單倍體進行進一步的種植鑒定，具體鑒定方法同1.1節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單倍體誘導系JS6-2對不同玉米基礎材料的誘導效果

2.1.1 誘導系JS6-2對不同自交系的誘導效果 誘導系JS6-2、Stock6和農(nóng)大高誘1號對不同玉米自交系的誘導效果見表3。由表3可知，誘導系JS6-2、Stock6和農(nóng)大高誘1號對玉米自交系均具有產(chǎn)生孤雌生殖單倍體的能力，其中JS6-2的平均單倍體誘導率為8.29%，農(nóng)大高誘1號的平均單倍體誘導率為1.70%，Stock6的平均單倍體誘導率最低，為0.66%。JS6-2的單倍體誘導率極顯著高于其他2個誘導系，而農(nóng)大高誘1號與Stock6的單倍體誘導率無顯著差異。

注：不同大寫字母表示0.01水平下差異極顯著，不同小寫字母表示0.05水平下差異顯著。下表同。

Note:Capital letters stand for significant difference at 0.01 level,while small letters stand for significant difference at 0.05 level.The same below.

不同母本基礎材料的單倍體誘導率存在顯著差異。JS6-2對自交系材料誘導中，PH4CV的單倍體誘導率最高，為9.86%，吉853的單倍體誘導率最低，為5.69%，變異幅度4.17%。Stock6對自交系材料誘導中，鄭58的單倍體誘導率最高，達到1.64%，吉853、S122的單倍體誘導率最低，為0，變異幅度1.64%。農(nóng)大高誘1號對自交系材料誘導中，鄭58和PH4CV的單倍體誘導率較高，達到3.19%和3.18%，吉853的單倍體誘導率最低，為0，變異幅度3.19%。

2.1.2 誘導系JS6-2對不同雜交組合的誘導效果 單倍體誘導系JS6-2、Stock6和農(nóng)大高誘1號對不同雜交組合的誘導效果見表4。由表4可知，3個誘導系中對雜交組合的平均單倍體誘導率同樣以JS6-2最高，為8.22%；其次是農(nóng)大高誘1號，為1.35%；Stock6最低，為0.76%。JS6-2的單倍體誘導率同樣極顯著高于其他2個誘導系，其他2個誘導系的單倍體誘導率無顯著差異。

JS6-2對不同雜交材料誘導中， PH6WC×S122、PH4CV×PHB1M、PHB1M×丹340的單倍體誘導率較高，分別為10.13%，9.93%和9.79%，PHGJ4×丹340最低，單倍體誘導率為4.97%,變異幅度5.16%。Stock6單倍體誘導率最高的組合為PHB1M×丹340，誘導率1.33%，最低的PHB1M×S122，誘導率0，變異幅度1.33%。農(nóng)大高誘1號單倍體誘導率最高的組合為PHB1M×丹340，誘導率2.71%，最低的組合為PHB1M×S122，誘導率0.81%，變異幅度1.90%。

綜上所述，單倍體誘導系JS6-2對母本基礎材料的誘導率極顯著高于其他2個誘導系。不同基礎材料存在差異，自交系中，Reid、No Reid材料誘導率高，而DOM則低；雜交種中，Reid×DOM、No Reid×DOM以及Reid、No Reid群內(nèi)誘導率高，而DOM則低。因此，選用適當基礎材料對提高單倍體誘導率有一定作用。

2.2 不同授粉時期對單倍體誘導率的影響

不同授粉時期JS6-2對不同材料單倍體誘導率的影響結(jié)果見表5。由表5可以看出，不同授粉時期JS6-2雜交誘導單倍體以雌穗吐絲后3～5 d、6～8 d的單倍體誘導率較高，分別為8.56%和8.75%，極顯著高于0～2 d的單倍體誘導率(5.19%)。說明JS6-2雜交誘導單倍體最佳時期為雌穗吐絲后3～8 d。此時雌穗花絲基本全部吐出，便于整齊剪斷進行雜交。由于雌穗吐絲3～5 d單倍體結(jié)實率較6～8 d高，推薦雌穗吐絲3～5 d進行雜交誘導。不同品種(雜交組合)在不同雜交誘導授粉時期誘導率沒有顯著差異。

2.3 果穗不同部位對單倍體誘導率的影響

由表6可知，鄭單958、先玉335和吉農(nóng)玉833等3個雜交種果穗頂部的單倍體誘導率均明顯高于底部，其中鄭單958果穗頂部和底部的單倍體誘導率分別為7.93%和5.45%，先玉335果穗頂部和底部的單倍體誘導率分別為8.05%和5.31%，吉農(nóng)玉833果穗頂部和底部的單倍體誘導率分別為8.31%和6.15%。而利民33和農(nóng)華101果穗頂部的單倍體誘導率低于底部，其中利民33果穗頂部和底部的單倍體誘導率分別為4.80%和5.02%，農(nóng)華101果穗頂部和底部的單倍體誘導率分別為5.72%和 6.11%；但底部與頂部的單倍體誘導率相差不大。綜合5個品種果穗頂部與底部來看，果穗頂部的單倍體誘導率(6.87%)高于底部(5.61%)。

綜合整個果穗平均單倍體誘導率同樣發(fā)現(xiàn)，不同品種(不同基礎材料)的單倍體誘導率存在差異。本研究中吉農(nóng)玉833最高，為7.23%，利民33最低，為4.91%，差異顯著。前者雜優(yōu)模式是Reid×DOM，后者雜優(yōu)模式是Reid×No Reid。

3 討 論

3.1 單倍體誘導系JS6-2的誘導效果

自1956年Coe育成單倍體誘導系Stock6，Chang提出玉米單倍體育種的流程之后，國內(nèi)外育種單位與機構(gòu)相繼開展了玉米單倍體育種工作。如杜邦先鋒、孟山都等國際公司已經(jīng)大規(guī)模運用，實現(xiàn)了“工廠化”，但在主要技術(shù)上存在嚴重缺陷，其中，單倍體誘導率及加倍率低是限制玉米單倍體育種的瓶頸。

2010年吉林農(nóng)業(yè)大學對Stock6進行了遺傳改良，從中選育出新的單倍體誘導系JS6-2。本研究在2012年至2013年，以玉米單倍體誘導系JS6-2為材料，Stock6和農(nóng)大高誘1號為對照，研究了誘導系JS6-2對不同基因型材料的誘導效果，結(jié)果表明，JS6-2對玉米自交系及雜交種均具有誘導產(chǎn)生單倍體的能力，JS6-2的誘導率(8.22%～8.29%)明顯高于農(nóng)大高誘1號和Stock6。JS6-2誘導率高，農(nóng)藝性狀優(yōu)良，抗玉米大斑病強，花粉量大，為較好的單倍體誘導系。該誘導系的育成，對玉米單倍體育種將具有一定作用。

3.2 玉米單倍體育種中母本基因型的選擇

不同母本基礎材料的單倍體誘導率和加倍率存在顯著差異[2-3,13]。本研究結(jié)果表明，不同母本基因型材料間單倍體誘導率差異顯著，自交系中，Reid、No Reid群誘導率高；雜交種中，Reid×DOM、No Reid×DOM 雜優(yōu)模式誘導率高。這與Rober等[14]、劉志增等[15]的研究結(jié)果相一致。Chase[16]認為這種影響源于母本基因型所產(chǎn)生的雌配子中有害基因頻率的不同。

3.3 雜交誘導授粉時期和授粉部位的選擇

本研究結(jié)果表明，在雌穗吐絲中期(3～5 d)、晚期(6～8 d)雜交授粉的單倍體平均誘導率高。 Chase[17]、Seaney[18]的研究結(jié)果均表明，通過延遲授粉的手段可以提高單倍體的誘導率。田間雜交實踐表明，中期授粉的結(jié)實率常高于中后期授粉的結(jié)實率，因此認為田間雜交誘導時，雌穗吐絲后3～4 d整齊剪斷花絲，4～5 d進行雜交誘導，效果更好。

本研究亦發(fā)現(xiàn)果穗頂部籽粒的單倍體誘導率高于底部。這與Sarkar等[19]、Chalyk[20]、Rotarenco等[21]的研究結(jié)果相類似。推測位于果穗頂部的未成熟卵細胞較果穗下部的成熟卵細胞在未受精的情況下更容易發(fā)育成單倍體幼胚[20]。玉米花絲是逐步伸長的，由于在生長過程中花絲直徑增大，授粉后在下部花絲中可能有更多的花粉管通向胚囊，盡管誘導系花粉的精子與極核結(jié)合形成單授精，可能有其他花粉的精子進入胚囊作為補償精子與卵細胞結(jié)合，進而形成異核受精而完成雙授精，這可能造成果穗下部誘導率較果穗上部低。

4 結(jié) 論

1)玉米單倍體誘導系JS6-2對玉米自交系及雜交種均具有誘導產(chǎn)生單倍體的能力，其誘導效果明顯高于農(nóng)大高誘1號和Stock6。

2)不同基因型材料間的單倍體誘導率存在顯著差異，自交系中，Reid、No Reid群誘導率高；雜交種中，Reid×DOM、No Reid×DOM雜優(yōu)模式的單倍體誘導率高。

3)雌穗吐絲后3～5 d的中期授粉，單倍體誘導率高于早期授粉。因此建議田間雜交誘導時，雌穗吐絲后3～4 d整齊剪斷花絲，3～5 d進行雜交，單倍體誘導效果更好。

4)果穗頂部的單倍體誘導率高于底部。

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Induced rate of maize haploid inducer JS6-2

YANG Wei1,REN Xue-jiao1,CUI Xue-yu1,CI Jia-bin1,REN Qi-biao2,YANG Wei-guang1,WU Chun-sheng1

(1CollegeofAgronomy,JilinAgricultureUniversity,Changchun,Jilin130118,China；2JilinSeedAdministrationStation,Changchun,Jilin130062,China)

【Objective】 Induction effects of maize haploid inducer JS6-2 with different germplasms,artificial pollination times and sites were studied to improve maize haploid breeding.【Method】 Using JS6-2 as inducing line and Stock6 and Cau ho 1 as control,induction rates between inbred lines and hybrids with different artificial pollination times and sites of ear were compared.【Result】 JS6-2 had the ability of inducing inbred lines and hybrids.The induction rates of JS6-2 for inbred lines and hybrids were higher than Cau ho 1 and Stock6.The average induction rates for inbred lines were 8.29%,1.70% and 0.66%,while those for hybrids were 8.22%,1.35% and 0.76%,respectively.【Conclusion】 JS6-2 was much more efficient than Cau ho 1 and Stock6 in induction of inbred and hybrid lines.Reid,No Reid,Reid×DOM,and No Reid×DOM had high induction rates.Optimal artificial pollination period for inducer JS6-2 was 3-5 d after silking at top site of ear.

maize;haploid induce lines;effect of induction

2014-11-11

吉林農(nóng)業(yè)大學科研啟動基金項目(201204)；國家“863計劃”項目(2011AA10A103)；農(nóng)業(yè)部948項目(2011-G1-21)；國家農(nóng)轉(zhuǎn)資金項目(2014GB2B100006)；吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(2013001J-1)；國家轉(zhuǎn)基因重大專項(2014ZX800305B)；國家科技支撐計劃項目(2014BAD01B01)

楊 巍(1981-)，男，吉林白山人，助理研究員，博士，主要從事玉米遺傳育種及作物栽培研究。 E-mail：davidyoung588@126.com

楊偉光(1960-)，男，吉林梨樹人，教授，博士生導師，主要從事玉米遺傳育種研究。E-mail：ywg789@126.com

時間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.004

S335.4；S513.035.2

A

1671-9387(2015)07-0089-06

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.004.html