李 偉，王 芳，殷元虎，郭春暉，殷溪瀚

(1.黑龍江省畜牧研究所 161005；2.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院 161006；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院 163319)

蛋白質(zhì)組學(xué)在牛屬動物疾病中的研究與應(yīng)用

李 偉1，王 芳2，殷元虎1，郭春暉1，殷溪瀚3

(1.黑龍江省畜牧研究所 161005；2.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院 161006；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院 163319)

蛋白質(zhì)組學(xué)是對基因組學(xué)研究的重要補充，生命的各個過程都受到蛋白質(zhì)間相互作用的控制。它是一個客觀的、復(fù)雜的、交錯并精密調(diào)控的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。在動物發(fā)育、生理生態(tài)、疾病等研究中得到廣泛應(yīng)用。如何利用系統(tǒng)生物學(xué)的理念，將這些研究成果加以整理、整合，從而在蛋白質(zhì)水平上對生命現(xiàn)象加以解釋，這需要遺傳學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、細胞生物學(xué)、工程學(xué)、數(shù)學(xué)、信息學(xué)等多學(xué)科學(xué)者共同的努力。本文介紹了蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展背景和關(guān)鍵技術(shù)的研究情況，并對蛋白質(zhì)組學(xué)在牛屬動物疾病中的研究與應(yīng)用進行了闡述。同時對蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展前景進行了討論。

蛋白質(zhì)組學(xué)；牛；疾?。簧镄畔W(xué)；乳房炎；蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

1 蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展背景

1953年，Watson和Crick建立了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，標(biāo)志著基因時代的到來。1990～2001年人類基因組計劃(Human Genomic Project ,HGP)的完成。2001年2月15日，在Nature上一篇“現(xiàn)在應(yīng)該是蛋白質(zhì)組了”的消息，宣布了人類蛋白質(zhì)組組織(Human Proteome Organization, HUPO)成立[1]，并提出了人類蛋白質(zhì)組計劃(Human Proteome Project，HPP)[2], 標(biāo)志著人類進入了后基因組時代。現(xiàn)在我們已經(jīng)知道，機體內(nèi)各種生命信息由不同基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯，傳遞到相應(yīng)蛋白質(zhì)進行表達，表現(xiàn)為生命活性。目前，以對生物體或細胞的所有蛋白質(zhì)進行鑒定和結(jié)構(gòu)功能分析為基礎(chǔ)，獲得蛋白質(zhì)水平上關(guān)于疾病發(fā)生，細胞代謝，營養(yǎng)吸收等過程的全面認識為研究目標(biāo)的蛋白質(zhì)組學(xué)越來越受到人們的重視。蛋白質(zhì)組(proteome)的概念最早由Wasinger V.C.(1995)[3]提出，是指由一個基因組編碼的所有蛋白質(zhì)。澳大利亞學(xué)者Wilkins M R & Williams K L(1997)[4]第一次在專著中使用并定義為：一個基因組或組織所表達全部蛋白質(zhì)。現(xiàn)在蛋白質(zhì)組可以理解為一種生物、個體、器官、組織、細胞及體液等的基因組所表達的全部蛋白質(zhì)[5]，蛋白質(zhì)組學(xué)研究內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等。需要指出的是一個蛋白質(zhì)組并不是一個基因組的直接產(chǎn)物，機體蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)量要遠遠多于基因組中基因的數(shù)量。蛋白質(zhì)之間的相互作用和協(xié)調(diào)是細胞代謝活動的基礎(chǔ)，在細胞增值，分化，凋亡和衰老等生命活動中，蛋白質(zhì)不僅有表達時間、表達量上的差異，而且能對外界環(huán)境刺激(物理、化學(xué)、生理、病理信號)等刺激產(chǎn)生反應(yīng)，形成基因緩沖從而適應(yīng)環(huán)境變化。生命每個過程都受到蛋白質(zhì)間相互作用的控制。它是一個客觀的、復(fù)雜的、交錯的并精密調(diào)控的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。因此，要得到細胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)組十分困難。為此，Humphery Smith et al.(1997)[6]提出功能蛋白質(zhì)組的概念，指在特定時間、特定環(huán)境和實驗條件下基因組所表達的蛋白質(zhì)。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域與研究內(nèi)容

蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)滲透到臨床醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、動物學(xué)、植物學(xué)、植物病理學(xué)、營養(yǎng)學(xué)等多個學(xué)科領(lǐng)域。主要分為三個方向：①對蛋白質(zhì)的大規(guī)模識別和翻譯后加工修飾的細微特征分析，稱為組成蛋白質(zhì)組學(xué)；②借助蛋白質(zhì)差異性顯示法進行分析蛋白質(zhì)的水平，稱為差異顯示蛋白質(zhì)組學(xué)(differential display proteomics)又叫比較蛋白質(zhì)組學(xué)(comparative proteomics)或表達蛋白質(zhì)組學(xué)(expression proteomics)；③應(yīng)用質(zhì)譜分析或酵母雙雜交法研究蛋白質(zhì)與蛋質(zhì)之間的相互作用，用以繪制某個體系的蛋白質(zhì)作用的網(wǎng)絡(luò)圖譜，稱為相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)。

蛋白質(zhì)組的研究一般分為3個步驟：第一，蛋白質(zhì)組分離技術(shù)。主要有雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)技術(shù)，因其高分辨率的優(yōu)點現(xiàn)在被人們廣泛使用，但也存在難以分離檢測低豐度蛋白，極端酸堿性蛋白和疏水蛋白等缺點。非平衡pH梯度電泳(nonequilibrium pH gradient electrophoresis, NEPHGE)，主要用于堿性蛋白質(zhì)的分離。Blue native-PAGE雙向電泳(BN- PAGE)，主要用于膜性蛋白復(fù)合體等分子量大的蛋白質(zhì)的分離。此外還有雙向高效柱層析技術(shù)和液相柱色譜分離技術(shù)。第二，蛋白質(zhì)的鑒定。80年代末以基質(zhì)輔助激光解析電離(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization, MALDI)和電噴霧電離(Electrospray Ionization ,ESI)[7，8]兩項技術(shù)為基礎(chǔ)，發(fā)展起來的基質(zhì)輔助飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desportion ionization，MALDI-TOF-MS)，是當(dāng)前最常用的分析技術(shù)。應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)可以得到蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide mass fingerprinting，PMF)，進而分析鑒定蛋白質(zhì)。現(xiàn)在一些分離與鑒定技術(shù)相結(jié)合的方法在實踐應(yīng)用效果較好如2-DE與免疫印跡技術(shù)相結(jié)合的方法-血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法(serum proteomics analysis, SERPA)，在篩選與腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)應(yīng)用較廣。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)(protein chip & protein microarray)，現(xiàn)在應(yīng)用較多的是蛋白質(zhì)芯片與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合的表面增強激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜 (surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)技術(shù)。生物分子相互作用的分析技術(shù)(biomolecular interaction analysis, BIA)與MALDI-TOF-MS結(jié)合形成生物傳感芯片質(zhì)譜，可用于蛋白質(zhì)的功能特性研究和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析。生物化學(xué)型蛋白質(zhì)芯片，將已知的生物活性分子結(jié)合到芯片表面，來捕獲樣品中的靶蛋白。同位素標(biāo)簽相對絕對定量(iTRAQ)技術(shù)[9,10]，能對肽段進行相對定量MS / MS，二級質(zhì)譜也就是串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。iTRAQ技術(shù)可檢測出低豐度蛋白、強堿性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。

第三，應(yīng)用生物信息學(xué)及蛋白質(zhì)組信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對鑒定結(jié)果進行存儲、處理、對比和分析。

注：引自 R. J. 辛普森. 2003. Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual[11]。

3 蛋白質(zhì)組技術(shù)在牛疾病上的研究

3.1 蛋白質(zhì)組技術(shù)在健康牛上的研究

首先需要對正常牛體不同組織和細胞的蛋白質(zhì)組有個基礎(chǔ)了解，才能進一步研究疾病對牛蛋白質(zhì)組的影響(牛麗莉 等，2009[12],楊永新 等，2010[13])。不同體細胞數(shù)牛乳中乳蛋白比較蛋白質(zhì)組學(xué)進行了研究(楊永新 等，2011)[14]。李珊珊(2011)[15]對圍產(chǎn)期奶牛血清蛋白質(zhì)組學(xué)進行了初步研究； Lu et al. (2013)[16]研究了干奶期奶牛的牛奶中與能量平衡相關(guān)的蛋白質(zhì)組和代謝組的變化。劉榮 等(2012)[17]優(yōu)化了奶牛乳腺上皮細胞核蛋白質(zhì)組雙向電泳方法，并在此基礎(chǔ)上研究了中藥王不留行對奶牛乳腺上皮細胞核蛋白質(zhì)組學(xué)的影響(劉榮，2012)[18]。

3.2 蛋白質(zhì)組技術(shù)在牛乳房炎上的研究

乳房炎是影響奶業(yè)生產(chǎn)的主要疾病，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的研究也較多(張勇，2009[19], 楊永新，2010[20])，而且越來越具針對性，學(xué)者們對大腸桿菌性乳房炎(楊永新 等，2010[21])和金黃色葡萄球菌乳房炎(Reinhardt , 2013[22])進行了蛋白質(zhì)組分析。學(xué)者們在蛋白質(zhì)組水平上研究亞臨床和臨床乳房炎的奶牛抵御不同病原體的反應(yīng)，并篩選了潛在蛋白質(zhì)的為生物標(biāo)記物，為更好地理解乳房炎發(fā)病機理提供了研究方向(Romana ，2012[23])。

3.3 蛋白質(zhì)組技術(shù)在牛布氏桿菌上的研究

牛布氏桿菌 (Br.Bovis)是一類革蘭氏陰性短小桿菌，可引起母畜傳染性流產(chǎn)。布魯氏菌是一種細胞內(nèi)的細菌病原體引起全球人畜共患病布魯氏菌病。布魯氏菌毒力依賴于它的能力過渡到宿主細胞內(nèi)的細胞內(nèi)的生活方式。因此，這種病原體必須檢測其細胞內(nèi)的定位，然后重新在宿主細胞內(nèi)調(diào)整基因表達。在牛布氏桿菌的研究方面，利用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選布魯菌高免疫原性膜蛋白作為DNA疫苗的免疫抗原候選分子是預(yù)防此病的新途徑(Roset，2013[24])。郭振華(2009)[25]對牛種布魯氏菌弱毒疫苗株s19與構(gòu)建株Δs19全菌蛋白的比較蛋白質(zhì)組進行了研究；趙永坤等(2012)[26]對感染牛布魯菌544A的巨噬細胞蛋白質(zhì)組學(xué)進行了分析。

3.4 蛋白質(zhì)組技術(shù)在牛其他臨床疾病上的研究

學(xué)者們分別對奶牛乳熱癥蛋白質(zhì)組學(xué)(夏成,2010[27])；蹄葉炎奶牛蛋白質(zhì)組學(xué)(Sun,2013[28])；結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)組學(xué)(陸曄 等，2011[29])，學(xué)者們利用雙向電泳與免疫印跡相結(jié)合篩選牛支原體免疫相關(guān)蛋白質(zhì)組(陳維 等，2012[30])；脲酶B亞單位疫苗免疫對奶牛血清蛋白質(zhì)組分的影響(袁廷杰 等,2012[31])等方面做了深入的研究和探索。Bouasria (2013)[32]研究了黏膜表面的逆境脅迫誘導(dǎo)表達控制系統(tǒng)(SICE)在乳酸乳球菌的治療性分子機制。奶牛酮病是一種常見的代謝性疾病。已知的診斷標(biāo)記酮癥，如丙酮和β-羥基丁酸(BHBA)，但疾病預(yù)測仍然是一個難題。Matthias(2012)[33]研究奶牛得酮癥的致病的機理。通過對患有酮病奶牛的牛奶蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)在整個哺乳期，高甘油磷酸膽堿GPC與低酮病的發(fā)病率高度相關(guān)，并指出牛奶GPC與磷酸膽堿(PC)的比是一種可靠選擇健康奶牛的指標(biāo)。犢牛運輸過程中，患肺炎和腹瀉是造成死亡的主要原因，袁廷杰 等(2012)[34]對運輸前后奶牛血清蛋白質(zhì)組進行了研究。Senthilkumaran et al.(2013)[35]收集了162頭運輸后犢牛的支氣管肺泡灌洗液(BALF),較低水平的膜聯(lián)蛋白A1和A2是斷奶和運輸育肥牛肺炎的易感性增加的潛在生物標(biāo)志物。手足口病是一種高度傳染性的病毒性疾病，野生的和家養(yǎng)的偶蹄類動物?？谔阋卟《九c宿主細胞之間的復(fù)雜關(guān)系，導(dǎo)致它的復(fù)制和傳播。 BHK-21細胞系是一個口蹄疫病毒感染的體外模型，通常用于制備病毒種子。為了更好地理解這種關(guān)系的分子基礎(chǔ)，Zhang(2013)[36]對感染口蹄疫病毒的幼倉鼠腎細胞蛋白質(zhì)組學(xué)進行了研究，結(jié)果質(zhì)譜確定了30個蛋白點改變(19個上調(diào)，下調(diào)2個病毒蛋白質(zhì)斑點)，其中包括蛋白質(zhì)代謝過程，細胞骨架蛋白微絲相關(guān)蛋白，應(yīng)激反應(yīng)蛋白和口蹄疫病毒蛋白。 Western blot分析進一步證實NME - 2蛋白在蛋白質(zhì)組的配置文件的差異表達。亞細胞定位證明NME2蛋白分布在BHK -21細胞的細胞質(zhì)和細胞核上。

4 展望

生命科學(xué)是需要證明的實驗性科學(xué)，生命科學(xué)的發(fā)展依賴于實驗技術(shù)的發(fā)展。雖然MS-蛋白質(zhì)組學(xué)開始走向成熟，并開始了通過儀器，樣品制備和計算分析相結(jié)合的多元發(fā)展模式，但蛋白質(zhì)組學(xué)仍需要技術(shù)的突破來推動蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展[37]。目前，還沒有與核酸擴增的PCR技術(shù)相似的蛋白質(zhì)擴增技術(shù)，對微量蛋白質(zhì)的檢測仍是問題。另一方面，單一學(xué)科很難詮釋蛋白質(zhì)間復(fù)雜的、動態(tài)的、連續(xù)的互為因果的關(guān)系。如何對這一龐大、抽象，又富于變化的問題加以分析，西方科學(xué)發(fā)展的經(jīng)典過程是將復(fù)雜的事物加以分割并建立不同的模型，用不同學(xué)科各自的學(xué)科工具對某一特定變化的細節(jié)問題加以研究，再用比較方法加以分析。當(dāng)這些研究積累到一定程度和深度時，再已某些理論為基礎(chǔ)用系統(tǒng)的思想提出因果的假設(shè)，在不斷的篩選、重復(fù)驗證的過程中，提出假說對事物的變化進行解釋。把一個學(xué)科的經(jīng)典理論引入到另一個學(xué)科中加以研究，往往會得到一個嶄新的領(lǐng)悟。例如19世紀Hermann von Helmholtz 在他的能量代謝研究中引入了熱力學(xué)第一定律，為我們對生物體內(nèi)能量平衡的研究奠定了理論基礎(chǔ)，改變了相應(yīng)領(lǐng)域的研究思路。為此，不難看出新理論、合理假設(shè)的提出相比研究技術(shù)的創(chuàng)新要更能引領(lǐng)了相應(yīng)學(xué)科的發(fā)展。 隨著學(xué)科的發(fā)展，學(xué)科分支越來越細。蛋白質(zhì)組學(xué)為我們提供了完全嶄新的思路直接運用系統(tǒng)生物學(xué)思想綜合運用各學(xué)科理論，從整體上研究生命現(xiàn)象。個人的力量是有限的，需要多學(xué)科的學(xué)者共同的努力，建立以國家、各學(xué)科為單位的開放的、發(fā)散的，具有創(chuàng)新意識的研究團隊或組織機構(gòu)并開展技術(shù)交流。

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