金文進(jìn)，李春杰，王正鳳

（1．甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工學(xué)院，甘肅天水741025；2．草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實驗室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州730020；3．白銀市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，甘肅白銀730900）

禾草內(nèi)生真菌的多樣性及意義

金文進(jìn)1，2，李春杰2*，王正鳳3

（1．甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化工學(xué)院，甘肅天水741025；2．草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實驗室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州730020；3．白銀市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，甘肅白銀730900）

禾草內(nèi)生真菌是一個多樣性十分豐富的微生物類群，因其具有重要的生理和生態(tài)作用而成為當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。禾草內(nèi)生真菌的多樣性主要有種的多樣性、宿主多樣性、生境多樣性、形態(tài)多樣性以及遺傳多樣性。主要是感染冷季型禾草的香燭菌屬（Epichlo?）及其無性態(tài)Neotyphodium屬。全球生態(tài)環(huán)境復(fù)雜、宿主植物多樣性豐富，導(dǎo)致內(nèi)生真菌的多樣性更加豐富，從而會發(fā)現(xiàn)更多新的真菌分類單元，這在菌種收集和保藏方面獨(dú)具優(yōu)勢。內(nèi)生真菌可使禾草提高抗逆性并適應(yīng)逆境甚至極端環(huán)境條件，這對于深入探討內(nèi)生真菌－宿主之間的相互作用，有目的性和科學(xué)性地構(gòu)建新的禾草內(nèi)生真菌共生體及植物微生態(tài)系統(tǒng)的研究都具有十分重要的意義。

禾草；內(nèi)生真菌；多樣性

在禾草中度過全部或大部分生命周期，而外部不引起明顯病害癥狀的一大類真菌叫禾草－內(nèi)生真菌，其中，香柱菌屬（Epichlo?）的無性型Neotyphodium與禾草的關(guān)系最為密切而成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［1］。到19世紀(jì)70年代后期，內(nèi)生真菌與禾本科植物的互利共生關(guān)系才被逐步揭示［1-3］。禾草內(nèi)生真菌普遍存在并具有多樣性，在天然草地和人工草地的禾草中均有廣泛分布［4］。同時，自然生態(tài)系統(tǒng)中禾草－內(nèi)生真菌的關(guān)系復(fù)雜而多變，土壤養(yǎng)分難以滿足雙方的需求，表現(xiàn)出從拮抗到互利的多種共生關(guān)系［5-6］。禾草生存環(huán)境的異質(zhì)性及內(nèi)生真菌的遺傳多樣性都很高，這種差異不僅與禾草和內(nèi)生真菌的基因型有關(guān)，也與禾草的環(huán)境條件及內(nèi)生真菌的種類有關(guān)，因此，正是這種生境的特殊性決定了禾草內(nèi)生真菌的研究既有理論的廣度和深度，又有多方面的應(yīng)用潛力。從20世紀(jì)80年代中期起，國內(nèi)外在禾草內(nèi)生真菌的多樣性研究中取得了一定的成就［4，7-12］。本文將簡要概述這方面的研究進(jìn)展。

1 內(nèi)生真菌種類多樣性

第18屆國際植物會議上，真菌等的命名規(guī)則進(jìn)行了調(diào)整。利用這一規(guī)則，Leuchtmann［13］等將與禾草共生的香燭菌屬的有性型Epichlo?和其無性型Neotyphodium的種類通過重新組合共形成了43個分類單元，包括種、亞種和變種，將原來命名的一些種降級為變種、亞種或作為異名歸并，如：N.lolii變?yōu)镋.festucae var．lolii，E.clarkii變?yōu)镋.typhina subsp．clarkii，E.yangzii并入E.bromicola；原來的N.chilense和N.starrii兩個種未被承認(rèn)［14-31］（表1）。目前，許多帶內(nèi)生真菌的禾草仍有待于進(jìn)一步的鑒定、分類和命名［12，25，32-35］。然而，對于Epichlo?typhina而言，仍然是較大的一個種，宿主禾草包括12個屬，需要從形態(tài)、生理生化及系統(tǒng)發(fā)育等方面更進(jìn)一步的深入研究，很可能分解為幾個不同的種或種以下的分類單元。從目前的研究結(jié)果分析，平均每種宿主禾草有4～5種內(nèi)生真菌，按地球目前25萬種植物計算，內(nèi)生真菌總數(shù)可超過100萬種［36］。

近年來，我國在禾草內(nèi)生真菌種的多樣性研究中也成績顯著，新種不斷出現(xiàn)。2004年Li等［20］將分離于我國甘肅醉馬草（Achnatherum inebrians）的內(nèi)生真菌命名為E.gansuensis（Neotyphodium gansuense）；在此基礎(chǔ)上，2007年，美國Schardl教授實驗室又將分離于我國新疆的醉馬草內(nèi)生真菌命名為E.gansuensis var．inebrians（N.gansuense var．inebrians）［22］；后來，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王志偉課題組和南開大學(xué)高玉葆課題組分別在鵝觀草屬（Roegneria）、佛子茅屬（Calamagrostis）、羊茅屬（Festuca）、早熟禾屬（Poa）及羽茅（A.sibiricum）上相繼發(fā)現(xiàn)了8個種［14，18，26-28］。我國禾本科植物資源很豐富，已經(jīng)檢測到越來越多的禾草內(nèi)生真菌共生體［11-12，34］，相信更多的內(nèi)生真菌分類單元將會被發(fā)現(xiàn)。

2 內(nèi)生真菌形態(tài)多樣性

同種禾草的內(nèi)生真菌分布特征及形態(tài)學(xué)特征因地理區(qū)域而異［37］；張欣等［38］從內(nèi)蒙古中東部地區(qū)羽茅6個地理種群中共分離得到19株不同形態(tài)的Epichlo?屬真菌；Ren等［8］對內(nèi)蒙古羽茅不同地理種群中分離出的484株菌株形態(tài)特征進(jìn)行了分析，結(jié)果表現(xiàn)出較高的多樣性；金文進(jìn)［9］對我國甘肅、新疆、青海、內(nèi)蒙古等不同地理種群、不同組織的21株E.gansuensis菌株進(jìn)行形態(tài)多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些菌株的菌落顏色、質(zhì)地、生長速率、分生孢子大小、形狀等都存在較大的差異。Schulthess和Faeth［39］從天然禾草亞利桑那羊茅5個地理種群的葉片中共分離得到400多株不同形態(tài)的菌株；Simpson等［40］研究發(fā)現(xiàn)，相同基因型的菌株隨著培養(yǎng)時間的不同，其形態(tài)可發(fā)生可逆性的變化。導(dǎo)致形態(tài)多樣性的原因可能是：宿主植物和內(nèi)生真菌的基因型不同，環(huán)境及其基因型與環(huán)境的互作、協(xié)同進(jìn)化［41-42］；或是體外分離培養(yǎng)條件等的差異造成菌的形態(tài)多樣性。這也從另一個角度反映出：目前經(jīng)典的形態(tài)學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)已很難準(zhǔn)確地反映菌的分類學(xué)地位，必須建立與宿主植物內(nèi)環(huán)境相似的生態(tài)模型，確保內(nèi)生真菌的分離和培養(yǎng)，同時也應(yīng)該探究從活體植物組織內(nèi)直接檢測和鑒定內(nèi)生真菌的方法和技術(shù)。

3 宿主多樣性

禾草內(nèi)生真菌具有嚴(yán)格的宿主特異性［6，11，22，43］，因此，內(nèi)生真菌的多樣性很可能與宿主數(shù)有一定的關(guān)系。目前全世界至少已在80個屬290多種以上禾本科植物中發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生真菌，溫帶禾草可能有10%的種類帶有內(nèi)生真菌，而早熟禾亞科約30%的種有Epichlo?內(nèi)生真菌［6，44］。全世界已報道至少有30個屬的禾草帶有Epichlo?內(nèi)生真菌［4］，我國至少在25個屬的天然草地禾草中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌［11，20，23，33-34］。同種Epichlo?真菌甚至有不止一種禾草與其共生，如醉馬草和羽茅均可與E.gansuensis共生。不同宿主分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量和種類不同，同一宿主不同個體分離到的內(nèi)生真菌種類也有差異［45］。這可能與宿主植物本身基因型及其周圍環(huán)境因子有關(guān)［46］。從目前已有的文獻(xiàn)報道來看，同屬不同種的禾草也有感染，如早熟禾、羊茅等，說明宿主的多樣性不僅表現(xiàn)在屬上，而且還表現(xiàn)在種上。尚未發(fā)現(xiàn)有性態(tài)Epichlo?并產(chǎn)生子座的宿主種類仍然較多。

4 生境多樣性

禾草內(nèi)生真菌在南北半球不同的生態(tài)環(huán)境均有分布［15，22-23，47］，已報道的Epichlo?種主要分布在歐洲、北美洲、亞洲、南美洲和非洲的禾本科植物中（表1）；多個Epichlo?種和變種廣泛分布于世界各地不同生境中［6，28，32，47］，但侵染率卻呈現(xiàn)出豐富的多樣性，有些種群在不同的生境中相當(dāng)穩(wěn)定，有些則變化明顯［23，33-34，44，48］。這可能是：宿主植物和內(nèi)生真菌之間的相容性不同、侵染種子的菌絲失活；或是由于宿主植物的空間分布、種子的傳播方式不同，隨著空間和時間以及環(huán)境選擇壓力的變化，其侵染率也會相應(yīng)地發(fā)生改變［49］；或是因為真菌和植物基因之間的相互作用以及環(huán)境因素等共同造成［7］；中等侵染率的內(nèi)生真菌種群可能是不穩(wěn)定的，其侵染率有增加或降低的趨勢，這決定于所在環(huán)境條件的選擇［33，44］。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，一般在干旱、半干旱的地區(qū)被內(nèi)生真菌侵染的禾草種類較多、帶菌率較高，且極少發(fā)現(xiàn)有性態(tài)Epichlo?屬香燭；而濕潤地區(qū)則較易形成香燭。對于內(nèi)生真菌與醉馬草、披堿草等共生體，分布范圍可從海拔1000～4000 m，帶菌率可為0～100%。

5 遺傳多樣性

同一宿主內(nèi)生真菌不同菌株所產(chǎn)生的次生代謝成分并不相同，這就意味著宿主與內(nèi)生真菌可能進(jìn)行遺傳物質(zhì)的交換，從而導(dǎo)致它們遺傳性狀的多樣化。Epichlo?屬起源有3種途徑［50］：直接起源于Epichlo?屬的某個種；Epichlo?的種間雜交；Epichlo?與其無性態(tài)Neotyphodium雜交。全球不同生境禾草內(nèi)生真菌起源種不多，卻依靠雜交重組產(chǎn)生了新的遺傳特性，進(jìn)而適應(yīng)了不同的環(huán)境，產(chǎn)生了豐富的遺傳多樣性，出現(xiàn)了許多新的種、亞種及變種［13］。內(nèi)生真菌進(jìn)化的多樣性加上宿主的不斷進(jìn)化，增強(qiáng)了共生體的遺傳多樣性［51］。

分子標(biāo)記技術(shù)揭示禾草內(nèi)生真菌的種數(shù)不多，但種群的遺傳多樣性卻很豐富。Lappalinen和Ylimattila［10］利用RAPD技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，同種內(nèi)生真菌往往具有多樣化的遺傳型；De Jong等［52］利用SSR標(biāo)記評價了禾草內(nèi)生真菌的遺傳多樣性，結(jié)果表明Epichlo?菌之間的多態(tài)標(biāo)記超過了85%；Saha等［53］利用SSR標(biāo)記發(fā)現(xiàn)羊草內(nèi)生真菌的多樣性很豐富；Oberhofer和Leuchtmann［54］研究發(fā)現(xiàn)，H.europaeus是目前Epichlo?菌中多樣性最豐富的草種，已報到可以和Epichlo?的4個種共生；分離自我國不同生態(tài)區(qū)的瘋草內(nèi)生真菌具有一定的遺傳多樣性［42］；張欣等［38］研究發(fā)現(xiàn)不同地理種群內(nèi)生真菌菌株由于其地理分布廣、氣候差異大、群落類型差別也較大，從而造成不同地理種群內(nèi)生真菌形態(tài)上的分化以及種群間明顯的遺傳分化和較高的遺傳多樣性；魏宇昆等［7］通過形態(tài)學(xué)和RAPD方法對4個樣地所含的27個羽茅內(nèi)生真菌菌株的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，羽茅內(nèi)生真菌在形態(tài)和基因水平上均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。李偉等［11］對分離自我國的22株Epichlo?菌遺傳多樣性分析顯示：菌株間存在一定的遺傳多樣性；陳永敢等［12］利用RAPD標(biāo)記對我國Epichlo?內(nèi)生真菌進(jìn)行了真菌種類、宿主種類、采集地和菌株間的遺傳多樣性探討，結(jié)果也表明遺傳多樣性很豐富，許多不同宿主的菌株獨(dú)立聚類，同時不同地理，不同種類的菌株聚類也不同。

目前，美國肯塔基大學(xué)Christopher Schardl實驗室已經(jīng)完成E.festucae等內(nèi)生真菌的測序，澳大利亞維多利亞農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中心German Spangenberg實驗室已經(jīng)完成var．lolii和E.coenophiala等內(nèi)生真菌的序列。這將有利于進(jìn)一步深入研究禾草內(nèi)生真菌的功能基因多樣性。

6 禾草內(nèi)生真菌多樣性的意義

目前，有關(guān)內(nèi)生真菌的研究主要集中在分離，鑒定，人工接種及提高植物抗性方面。內(nèi)生真菌有些生長很慢，而且主要生長在宿主內(nèi)部組織，所以很容易被宿主表面雜菌覆蓋，有的甚至不適宜在體外基本培養(yǎng)基上生長。另外，內(nèi)生真菌產(chǎn)生的次生代謝物種類豐富而量很少，這就加大了其分離和鑒定等的難度。國內(nèi)外關(guān)于內(nèi)生真菌提高禾草抗逆性的研究結(jié)果也不盡一致［2，25］，新西蘭已成功人工構(gòu)建了抗逆、無毒的禾草共生體，我國尚處于試驗研究階段，但進(jìn)展良好。許多研究者還提出禾草內(nèi)生真菌的生物多樣性可能在生物群落和生態(tài)系統(tǒng)水平方面具有一定的作用：具有較強(qiáng)抗逆性的帶菌禾草能迅速占據(jù)生態(tài)位，具有更強(qiáng)的競爭優(yōu)勢［37］，導(dǎo)致能量的傳遞受到干擾，群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響植物群落的演替［55-57］。以上種種問題，使內(nèi)生真菌的多樣性研究顯得尤為重要，生物多樣性豐富的地區(qū)，內(nèi)生真菌的多樣性就更豐富，特定地區(qū)獨(dú)有的禾草植物研究，發(fā)現(xiàn)新菌的可能性會更大，同時全球生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，研究多樣性還可以收集和保藏菌種，而且極端環(huán)境多樣性的研究，很可能具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，這對于從各個層面上深入探討內(nèi)生真菌－宿主間的相互作用，了解它們和人類自身生存環(huán)境的密切關(guān)系，探究內(nèi)生真菌的生物學(xué)本質(zhì)及其未知的生態(tài)學(xué)作用具有重要的意義。另外，還可為植物微生態(tài)系統(tǒng)的研究提供更多的資料。

7 禾草內(nèi)生真菌多樣性的應(yīng)用前景

7．1 植物生長調(diào)節(jié)劑

研究認(rèn)為，內(nèi)生真菌促進(jìn)植物生長是因為它可以產(chǎn)生生長素等激素類物質(zhì)。人們從體外培養(yǎng)的高羊茅E. coenophiala內(nèi)生真菌中已分離到了IAA［58］，Latch等［59］認(rèn)為黑麥草感染植株生物量的增加可能與赤霉素（GA）有關(guān)。內(nèi)生真菌產(chǎn)生的次生代謝物很豐富，環(huán)境相容性好又不容易造成環(huán)境污染，所以將有望成為很好的植物生長調(diào)節(jié)劑的來源。

7．2 生物農(nóng)藥

黑麥草內(nèi)生枝頂孢菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)過胺已證實是一種廣譜昆蟲拒劑、E.uncinata代謝物是一種廣譜殺蟲物質(zhì)，從感染的早熟禾（P.am pla）分離到的黃酮類化合物對蚊子幼蟲有毒性，巴布達(dá)橄欖（Bontia daphnoides）雜草內(nèi)生真菌（Nodulisporium sp．）產(chǎn)生的一種吲哚二萜類代謝物具有殺滅大蒼蠅幼蟲的活性，黑麥草內(nèi)生真菌產(chǎn)生的生物堿有抗阿根廷莖象蟲（Listronotus bonariensis）的活性，有些內(nèi)生真菌的代謝物具有抗病原菌、抗線蟲等多種生物學(xué)活性［16，24，60-62］，這些為植物病蟲害的生物防治拓寬了新思路，可以直接從內(nèi)生真菌中尋找具有抗病、抗蟲作用的活性化合物，或利用尋找的先導(dǎo)化合物來研制新的生物農(nóng)藥，或把具有抗病、抗蟲活性的內(nèi)生真菌直接接入或感染植物作為拮抗菌或增產(chǎn)菌而發(fā)揮生防作用，也可將內(nèi)生真菌作為外源基因的載體，將某些基因?qū)氲絻?nèi)生真菌中，提高植物的抗病蟲能力，這些在農(nóng)業(yè)上已有成功應(yīng)用［63］。當(dāng)然，要使這些新思路全部成功并應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，還有許多諸如活性代謝物產(chǎn)生的遺傳背景、結(jié)構(gòu)與毒性關(guān)系、作用機(jī)制及其作用的穩(wěn)定性、持久性和針對性等復(fù)雜問題有待深入研究。

7．3 草坪草、牧草、禾谷類作物育種

內(nèi)生真菌具有雙重特性，所以篩選出既有抗蟲性和抗逆性又對植食動物無害的內(nèi)生真菌種類，是牧草育種科學(xué)家育種的新目標(biāo)。早在20世紀(jì)90年代，數(shù)十種帶菌的草坪草品種就已被新西蘭和美國內(nèi)生真菌學(xué)家與牧草育種家聯(lián)合培育出，后來又利用內(nèi)生真菌種類的多樣性、遺傳多樣性、產(chǎn)檢多樣性等相繼培育出優(yōu)質(zhì)、無毒的黑麥草以及高羊茅新品種［64-65］。新西蘭科學(xué)家還育成了防治飛機(jī)場鳥擊的機(jī)場綠化新品種［66］。我國人工草業(yè)正在蓬勃發(fā)展，這方面的研究才剛剛起步，尚缺乏具有自主知識產(chǎn)權(quán)的帶菌草坪草和帶菌抗逆無毒的牧草新種質(zhì)、新材料和新品種。從小麥（Triticum aestivum）近源屬、種入手，是各國都在積極嘗試將內(nèi)生真菌應(yīng)用于禾谷類糧食作物育種的新思路，但還未見效。也有人計劃將來源于我國天然草地的抗逆、無毒的Epichlo?內(nèi)生真菌菌系導(dǎo)入優(yōu)良牧草，進(jìn)而導(dǎo)入飼用的燕麥（Avena sativa）、大麥（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays），最終應(yīng)用于糧食作物小麥，創(chuàng)建禾草／禾谷類作物新種質(zhì)、新材料，為進(jìn)一步選育糧、飼作物新品種奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Research advances on diversity of grass Epichlo?endophytes

JIN Wenjin1，2，LI Chunjie2*，WANG Zhengfeng3
1.College of Chemical and Engineering，Gansu Industry College，Tianshui 741025，China；2.State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems，College of Pastoral Agriculture Science and Technology，Lanzhou University，Lanzhou 730020，China；3. Baiyin Institute of Agricultural Sciences，Baiyin 730900，China

Grass Epichlo?endophyte is a microorganism community with abundant biodiversity；it has become one of the most popular research topics，because of its ecological and physiological functions and the great application potentiality in the fields of agriculture and medicine as biocontrol agents and foreign gene carrier at home and abroad．In this review，the diversity of endophytic fungi in grasses have been summarized，mainly cool-season grasses infected with these endophytes mostly belong to Clavicipitaceae genera of Epichlo?（anamorph Neotyphodium）．It mainly included the diversities of fungal species，symbiotic host，habitat，morphology and genetics．Eco-environmental complex and abundant plant biodiversity lead rich diversity of endophytic fungi，and more and more new endophyte taxa should be discovered．This is more likely that has unique advantages in the collection and preservation of new fungi．Endophyte could improve the stress tolerance of host grass，make grass to be adapted under stressed even extreme environmental conditions．It has great significance to study deeply on interactions between plant and endophyte，and to build novel symbiosis and the micro-ecosystem of plants．

grass；endophytic fungus；diversity

10．11686／cyxb20150120 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

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2014-02-22；改回日期：2014-08-29

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973項目）課題（2014CB138702），國家自然科學(xué)基金項目（31372366）和蘭州市科技攻關(guān)計劃項目（2008-SY-12）資助。

金文進(jìn)（1971-），女，甘肅天水人，副教授，碩士。E-mail：jinwenjin06＠163．com

*通訊作者Corresponding author．E-mail：chunjie＠lzu．edu．cn