胃癌3號染色體短臂抑癌基因CpG島甲基化表型研究

韓梅1史冬濤2曹健2田文妍2張洪濤3陳衛(wèi)昌2#

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院特需病房1(215006)消化科2蘇州大學(xué)癌癥分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室3

*基金項(xiàng)目：2012年蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(SYS201226)、2014年度江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目(14KJB320014)

背景：3號染色體短臂(3p)抑癌基因CpG島甲基化表型(CIMP)涉及的甲基化異常見于多種類型的癌癥中，但與胃癌的關(guān)系迄今仍未闡明。目的：研究胃癌中3p抑癌基因啟動子區(qū)CIMP的臨床意義。方法：采用甲基化特異性PCR(MSP)法檢測100例胃癌組織及其對應(yīng)癌旁組織中hOGG1、VHL、RAR-B、hMLH1、SEMA3B、RASSF1A、BLU和FHIT共8個抑癌基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)。以每份樣本中含有4個及以上甲基化基因定義為高CIMP水平(CIMP-H)。分析CIMP-H與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果：胃癌組織中VHL(P=0.030)、hMLH1(P<0.001)、SEMA3B(P=0.003)、RASSF1A(P<0.001)和FHIT(P<0.001)基因甲基化陽性率顯著高于癌旁組織。胃癌組織和對應(yīng)癌旁組織中CIMP-H發(fā)生率分別為44.0%和4.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。胃癌組織CIMP-H與腫瘤分化程度呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.004)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)(P=0.005)，而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、浸潤深度和TNM分期均無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論：3p CIMP異常狀態(tài)可能在胃癌形成早期已發(fā)生，并影響腫瘤分化，導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

關(guān)鍵詞胃腫瘤；3號染色體短臂；基因，腫瘤抑制；CpG島甲基化表型

CpG Island Methylator Phenotype

胃癌形成不僅涉及多個遺傳基因缺陷，還與基因表觀遺傳改變有關(guān)。DNA甲基化是最重要的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，抑癌基因DNA高甲基化可使抑癌基因表達(dá)失活，其結(jié)果類同于基因缺失或突變而造成的基因功能喪失，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[1]。已往研究多以單一基因?yàn)闄z測對象，往往很難發(fā)現(xiàn)敏感性和特異性俱佳的生物學(xué)標(biāo)記。CpG島甲基化表型(CpG island methylator phenotype, CIMP)可引起多個抑癌基因失活[2-3]，故檢測CIMP對腫瘤的診斷、化療療效預(yù)測和預(yù)后評估的價值優(yōu)于單一基因檢測。3號染色體短臂(3p)上存在大量腫瘤抑制基因，其啟動子區(qū)CIMP在肺癌、食管癌、宮頸癌等中的作用已有報(bào)道[4-6]。但DNA甲基化具有腫瘤特異性，即不同腫瘤中抑癌基因甲基化圖譜和頻率不完全相同[7]，3p抑癌基因CIMP涉及的甲基化異常與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系迄今仍未被闡明。本研究通過檢測胃癌組織和對應(yīng)癌旁組織中3p hOGG1(3p26)、VHL(3p25)、RAR-B(3p24)、hMLH1(3p21.3)、SEMA3B(3p21.3)、RASSF1A(3p21.3)、BLU(3p21.3)和FHIT(3p14.2)8個抑癌基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀況及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，旨在探討3p CIMP與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

對象與方法

一、資料來源

收集2008年1月-2008年12月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科接受手術(shù)治療的100例胃癌患者的組織標(biāo)本，所有患者均無胃癌家族史，術(shù)前均未行放、化療。其中男64例，女36例；年齡27~80歲，中位年齡62歲；按2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分為：Ⅰ期19例，Ⅱ期35例，Ⅲ期19例，Ⅳ期27例；按分化程度分為高分化腺癌10例、中分化腺癌31例、低分化腺癌59例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例；浸潤深度不超過黏膜下層的早期癌10例，浸潤深度達(dá)肌層及以下的進(jìn)展期癌90例。對應(yīng)癌旁胃黏膜組織取自距腫瘤邊緣≥5 cm處的正常組織，均經(jīng)病理檢查證實(shí)。所有組織樣本于離體0.5 h內(nèi)放入液氮內(nèi)凍存。

二、方法

按照CpG基因快速DNA改良提取試劑盒(S7824)說明書提取組織樣本DNA，然后行甲基化特異性PCR(MSP)檢測，PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色置紫外燈下觀察。將SssⅠ甲基化酶處理的基因組DNA作為陽性對照，雙蒸水處理的基因組DNA作為陰性對照。

三、CIMP定義

將≥50%的基因發(fā)生甲基化判為高CIMP水平(CIMP-H)，<50%判為低CIMP水平(CIMP-L)[8]。本實(shí)驗(yàn)共檢測8個基因，即hOGG1(3p26)、VHL(3p25)、RAR-B(3p24)、hMLH1(3p21.3)、SEMA3B(3p21.3)、RASSF1A(3p21.3)、BLU(3p21.3)和FHIT(3p14.2)，以每份樣本中含有4個及以上甲基化基因?yàn)镃IMP-H，低于4個甲基化基因?yàn)镃IMP-L。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，分類變量采用樣本數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、3p抑癌基因甲基化陽性率

8個基因甲基化典型示例見圖1。100例胃癌樣本中，99例(99.0%)至少1個基因發(fā)生了啟動子區(qū)甲基化，其中1個基因甲基化2例，2個基因同時甲基化27例，3個基因26例，4個基因35例，5個基因7例，6個基因1例，7個基因1例。對應(yīng)癌旁組織中分別有47例發(fā)生1個基因甲基化， 2個基因同時甲基化32例，3個基因6例，4個基因4例，無一例發(fā)生5個或以上基因同時甲基化。胃癌與癌旁組織中VHL(P=0.030)、hMLH1(P<0.001)、SEMA3B(P=0.003)、RASSF1A(P<0.001)和FHIT(P<0.001)基因甲基化陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。胃癌組織中hOGG1與RASSF1A、FHIT與BLU、FHIT與RAR-B甲基化顯著相關(guān)(P=0.049、P=0.015和P=0.025)。

二、3p CIMP-H發(fā)生率

胃癌和癌旁組織CIMP-H發(fā)生率分別為44.0%(44/100)和4.0%(4/100)，CIMP-L發(fā)生率分別為56.0%(56/100)和96.0%(96/100)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

三、胃癌組織CIMP狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系

胃癌組織CIMP-H與腫瘤分化程度密切相關(guān)，分化程度越差，CIMP-H發(fā)生率越高(P=0.004)；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亦顯著相關(guān)，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的CIMP-H發(fā)生率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著增高(P=0.005)；而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、浸潤深度和TNM分期均無關(guān)(P>0.05)(表2)。原發(fā)腫瘤中3p基因失活會導(dǎo)致廣泛的生物學(xué)進(jìn)程異常，早期關(guān)于胃癌等位基因丟失的研究結(jié)果顯示，3p雜合性丟失(LOH)的發(fā)生率為21.7%~38.3%，但無法解釋那些未發(fā)生LOH者的發(fā)病機(jī)制[9-10]，因而推測，除已發(fā)現(xiàn)的LOH機(jī)制外，還應(yīng)包括基因甲基化異常。

T：胃癌組織；N：對應(yīng)癌旁組織；pos：陽性對照；water：陰性對照；M：甲基化；U：未甲基化

表1胃癌和對應(yīng)癌旁組織中3p上各基因啟動子甲基化頻率n(%)

基 因胃癌組織(n=100)癌旁組織(n=100)P值hOGG1 U93(93.0)98(98.0)0.172 M7(7.0)2(2.0)VHL U91(91.0)98(98.0)0.030 M9(9.0)2(2.0)RAR-B U82(82.0)87(87.0)0.329 M18(18.0)13(13.0)hMLH1 U42(42.0)92(92.0)0.000 M58(58.0)8(8.0)SEMA3B U44(44.0)65(65.0)0.003 M56(56.0)35(35.0)RASSF1A U57(57.0)95(95.0)0.000 M43(43.0)5(5.0)BLU U36(36.0)45(45.0)0.195 M64(64.0)55(55.0)FHIT U33(33.0)75(75.0)0.000 M67(67.0)25(25.0)

表2　CIMP與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

討論

本研究檢測了100例組織胃癌及其對應(yīng)癌旁組織中3p上8個抑癌基因的啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，胃癌組織中甲基化陽性率分別為hOGG1 7.0%、VHL 9.0%、RAR-B 18.0%、hMLH1 58.0%、SEMA3B 56.0%、RASSF1A 43.0%、BLU 64.0%、FHIT 67.0%；癌旁組織中甲基化陽性率分別為hOGG1 2.0%、VHL 2.0%、RAR-B 13.0%、hMLH1 8.0%、SEMA3B 35.0%、RASSF1A 5.0%、BLU 55.0%、FHIT 25.0%。胃癌和癌旁組織中VHL、hMLH1、SEMA3B、RASSF1A和FHIT基因甲基化陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。hMLH1、SEMA3B、RASSF1A和BLU的結(jié)果與既往研究相類似[11-14]。hOGG1和RAR-B基因甲基化與胃癌的關(guān)系既往未見報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，這兩個基因甲基化陽性率在胃癌和癌旁組織間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故尚不能認(rèn)為hOGG1和RAR-B基因啟動子區(qū)甲基化與胃癌的發(fā)生有關(guān)。既往僅有2篇文獻(xiàn)[15-16]顯示在胃癌組織中未發(fā)現(xiàn)VHL基因甲基化，與本研究結(jié)果不符合。分析其原因，可能與受試者所處的環(huán)境不同有關(guān)，目前認(rèn)為飲食、藥物等外界環(huán)境是影響DNA甲基化的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)，與一碳代謝相關(guān)的飲食因素可直接影響甲基供給，從而影響DNA甲基化過程。這些營養(yǎng)因素包括維生素B12、維生素B6、葉酸、蛋氨酸和維生素復(fù)合物[17-18]。今后的研究中如能去除環(huán)境因素的影響，則可更真實(shí)地反映受試者的DNA甲基化狀態(tài)。

本研究中，99.0%的胃癌至少有1個基因發(fā)生啟動子區(qū)甲基化。統(tǒng)計(jì)分析胃癌組織中2個基因甲基化之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，hOGG1與RASSF1A、FHIT與BLU、FHIT與RAR-B甲基化顯著相關(guān)(P=0.049、P=0.015和P=0.025)，這些相關(guān)性表明胃癌3p位點(diǎn)上有些抑癌基因啟動子區(qū)甲基化是同步的。胃癌組織樣本和癌旁組織樣本中的CIMP-H發(fā)生率分別為44.0%和4.0%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，提示3p CIMP可能在胃癌發(fā)生中起有重要作用。

目前普遍認(rèn)為，DNA甲基化異常是腫瘤發(fā)生中的早期事件，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌前期病變中存在的腫瘤抑制基因甲基化是其基因表達(dá)沉默的主要原因，并隨腫瘤病程的演進(jìn)，甲基化陽性率逐步升高[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，3p CIMP-H與胃癌浸潤深度和TNM分期均無關(guān)(P>0.05)，而與腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)。因此，3p CIMP-H可能反映了胃癌分化、轉(zhuǎn)移潛能，而是否在胃癌形成早期就已發(fā)生還有待進(jìn)一步研究。

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(2015-02-23收稿；2015-04-05修回)

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A Study on CpG Island Methylator Phenotype involving Tumor Suppressor Genes on Chromosome 3p in Gastric CancerHANMei1,SHIDongtao2,CAOJian2,TIANWenyan2,ZHANGHongtao3,CHENWeichang2.1SpecialRequirementWard,2DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,JiangsuProvince(215006);3LaboratoryofMedicalGenetics,SchoolofBasicMedicine&BiologicalSciences,SoochowUniversity,Suzhou,JiangsuProvince

Correspondence to: CHEN Weichang, Email: 992841662@qq.com

Background: CpG island methylator phenotype (CIMP) involving tumor suppressor gene (TSG) on short arm of chromosome 3 (chromosome 3p) has been found in various types of cancers. However, its correlation with gastric cancer has not been clarified. Aims: To study the clinical significance of CIMP involving TSG on chromosome 3p in gastric cancer. Methods: Methylation specific PCR (MSP) was used to examine methylation profiles for hOGG1, VHL, RAR-B, hMLH1, SEMA3B, RASSF1A, BLU and FHIT harbored in chromosome 3p in 100 gastric cancer and paired paracancerous tissues. High CIMP (CIMP-H) was referred for those samples having four or more synchronously methylated genes. Relationship between CIMP-H and clinicopathological characteristics in gastric cancer was analyzed. Results: Positive methylation rates of VHL (P=0.030), hMLH1 (P<0.001), SEMA3B (P=0.003), RASSF1A (P<0.001) and FHIT (P<0.001) were significantly higher in gastric cancer tissue than in paracancerous tissue. Incidence of CIMP-H rate in gastric cancer tissue was significantly higher than that in paracancerous tissue (44.0%vs. 4.0%,P<0.001). CIMP-H was negatively correlated with degree of tumor differentiation (P=0.004), and positively correlated with lymph node metastasis (P=0.005), but not correlated with gender, age, tumor location, tumor size, depth of infiltration and TNM staging (P>0.05). Conclusions: CIMP on chromosome 3p may occur in early stage of oncogenesis of gastric cancer, and influencing tumor differentiation and lymph node metastasis.

Key wordsStomach Neoplasms;Short Arm of Chromosome 3p;Genes,Tumor Suppressor;

通信作者#本文，Email: 992841662@qq.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.10.003