李夢茜 張振旺

（河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 宜州 5463000）

頭霉素C是頭霉素類的一種，屬?-內(nèi)酰胺類抗生素。頭霉素以其對 ?-內(nèi)酰胺酶（包括青霉素酶和頭孢菌素酶）的優(yōu)良抗性而引人注目，其原因是在其分子結(jié)構(gòu) C7 位上存在一個甲氧基[1]，由此，其通常作為生產(chǎn)半合成抗生素（頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢美唑,替莫西林）的原料藥[2,3]。所有自然產(chǎn)生的 ?-內(nèi)酰胺類抗生素的生物合成都是從三個氨基酸開始的，L-α-氨基己二酸(L-α-aminoadipic acid，α-AAA)，L-半胱氨酸(L-cysteine)和 L-纈氨酸(L-valine)[4]。其中 L-α-氨基己二酸是一個非蛋白質(zhì)氨基酸，來源于賴氨酸(lysine)的合成途徑(真菌)，也可以由賴氨酸的分解產(chǎn)生（放線菌）[5]。

本研究對頭霉素C發(fā)酵過程中氨基酸添加濃度、添加時間、添加方式等進(jìn)行研究，證明L-α-氨基己二酸和谷氨酸能夠促進(jìn)產(chǎn)物頭霉素C的生物合成，并確定了較好的添加控制工藝。

1 材料和方法

1.1 菌種

放線菌Streptomyces sp.OFR 1022，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(%)：葡萄糖 1，蛋白胨1，酵母提取物0.5，自來水配制。

發(fā)酵合成培養(yǎng)基(%)：淀粉5，葡萄糖2，棉籽餅粉4，燕麥粉 1，KH2PO4 0.03，Na2HPO4·12H2O 0.05，MgSO4·7H2O 0.15，pH6.5，自來水配制。各種氨基酸待培養(yǎng)基滅菌后再分別加入。

1.3 培養(yǎng)方法

（1）斜面培養(yǎng)：將保存于牛奶凍干管中的孢子接到茄瓶斜面，37℃恒溫培養(yǎng)5d，從中挑一個豐滿的菌落轉(zhuǎn)接到另一個斜面，37℃培養(yǎng)5 d。

（2）種子培養(yǎng)：由斜面挖塊接種子培養(yǎng)基，28℃，250 r/min搖床培養(yǎng)48 h。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基， 接種量10%，28℃，250r/min 搖床培養(yǎng)144 h(每個配方三個平行樣)后，終止發(fā)酵，取適量發(fā)酵液于25 ml離心管中，加入等體積的甲醇，振搖混勻20 min后離心(4000 rpm,10 min)，取上清，微孔濾膜過濾后檢測相關(guān)參數(shù)。

1.4 分析方法

頭霉素C含量測定：采用HPLC 法，Waters液相色譜儀,色譜柱：PLATISILTM ODS 5μ，250×4.6mm，流動相：A相為0.1% TFA(H2O)，B相為0.1% TFA(乙腈)流速 1.0 ml/min，檢測波長254nm，柱溫30℃。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的氨基酸對頭霉素C生物合成的影響

頭霉素C發(fā)酵開始前，在培養(yǎng)基中預(yù)先加入不同量的氨基酸，使其最終濃度分別為0.05% 、0.1% 和0.2%，培養(yǎng)144 h 后測定頭霉素C的含量，結(jié)果如圖1，圖2，圖3所示。

圖1 0.05%氨基酸加量對頭霉素C生物合成的影響

圖2 0.1%氨基酸加量對頭霉素C生物合成的影響

圖3 0.2%氨基酸加量對頭霉素C生物合成的影響

圖示數(shù)據(jù)表明，在添加的氨基酸中，賴氨酸，脯氨酸，L-a-氨基己二酸，谷氨酸，可較大程度地提高頭霉素C的生物合成，尤其添加0.1%的L-a-氨基己二酸時，頭霉素C的產(chǎn)量比對照提高了65.3% 。其余的氨基酸對頭霉素C的生物合成無明顯刺激作用，其中DL-蛋氨酸和L-蛋氨酸反而抑制頭霉素C的生物合成，這與Kaglival[6]報道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為一致。

2.2 氨基酸添加方式對頭霉素C生物合成的影響

上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在培養(yǎng)基中預(yù)先加入濃度為0.1%的脯氨酸，L-a-氨基己二酸，谷氨酸可顯著地促進(jìn)頭霉素 C的生物合成。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)預(yù)測，如果在發(fā)酵過程中采用中間補(bǔ)料的方式，可能會有更好的效果。因此，本實(shí)驗(yàn)又設(shè)計(jì)了下列兩種方式來研究添加時機(jī)與組合添加對頭霉素 C生物合成的影響。由于谷氨酸鈉為谷氨酸的鈉鹽，且價格相對低廉，在接下來的試驗(yàn)中同時添加了味素（99.9%的谷氨酸鈉）。

2.2.1 不同培養(yǎng)時間補(bǔ)入氨基酸對頭霉素C產(chǎn)量的影響

頭霉素C的分子結(jié)構(gòu)與母核前體L-a-氨基己二酸呈1∶1的摩爾對應(yīng)關(guān)系，假如菌體對前體的利用率能達(dá)到 80%，那么只需補(bǔ)入濃度為0.2%的前體，產(chǎn)物頭霉素C的產(chǎn)量即可達(dá)到較高單位(計(jì)算過程略)。前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig.1，F(xiàn)ig.2和Fig.3)表明，當(dāng)氨基酸加量達(dá)到0.1% 時就能取得較好的效果，從而提示對照培養(yǎng)基成分中本來就含有一定量的氨基酸。那么我們就選取濃度為0.1%的氨基酸加量，分別在0 h、48 h和72 h進(jìn)行補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)144 h后測定頭霉素C效價，結(jié)果見圖4。

圖4 氨基酸補(bǔ)加時間對頭霉素C生物合成的影響

2.2.2 氨基酸組合添加對頭霉素C生物合成的影響

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知脯氨酸，谷氨酸和 α-氨基己二酸在濃度為0.1%，0 h添加最有利于頭霉素C的生物合成，以此為基礎(chǔ)，我們考察了三種氨基酸的組合作用。因此選取組合后濃度為0.1%，0 h時將三者組合添加，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示，由結(jié)果可知，三種氨基酸的組合作用不顯著。

圖5 氨基酸組合添加對頭霉素C生物合成的影響

2.2.3 前體組合添加對頭霉素C生物合成的影響

由于L-α-氨基己二酸（α-AAA), L-半胱氨酸（L-Cys）和L-纈氨酸（L-Val）為頭霉素 C生物合成的前體，2.1試驗(yàn)已證實(shí)單獨(dú)添加L-Cys 和L-Val并不能提高頭霉素C的產(chǎn)量，但是，三者的組合添加或許會對產(chǎn)素有一定的幫助，因此選取組合后的濃度為0.1%，0 h時將三者組合添加，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6 所示，由結(jié)果可知，三種前體的組合作用并不明顯。

圖6 前體組合添加對頭霉素C生物合成的影響

在前期研究的基礎(chǔ)上，綜合上述研究結(jié)果我們獲得了發(fā)酵生產(chǎn)頭霉素C的較優(yōu)的培養(yǎng)基配方(%)：淀粉5，葡萄糖2，棉籽餅粉 4，燕麥粉 1，KH2PO4 0.03，Na2HPO4·12H2O 0.05,MgSO4·7H2O 0.15，pH6.5，自來水配制，0.1%的 α-氨基己二酸(價格昂貴)或谷氨酸(價格低廉)待培養(yǎng)基滅菌后加入。對優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，共三批，結(jié)果0 h時添加0.1% 的α-氨基己二酸，平均效價為3869.4 μg/ml，比對照(2386.1 μg/ml)高出62.2%。其次為0 h 時添加0.1% 的谷氨酸(或谷氨酸鈉)，平均產(chǎn)素效價為3421.6 μg/ml，比對照高出43.4%。

3 討論

在頭霉素C類抗生素的生物合成過程中，異青霉素N(IPN)的合成被認(rèn)為是限制性因素，它直接關(guān)系到抗生素產(chǎn)量的高低。添加脯氨酸，L-a-氨基己二酸，谷氨酸(或谷氨酸鈉)能夠提高頭霉素C的產(chǎn)量，我們不難發(fā)現(xiàn)這幾種物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)很相似，脯氨酸水解后變?yōu)楣劝彼幔劝彼峄瘜W(xué)名稱又稱為a-氨基戊二酸，他們的作用可能與a-氨基己二酸相似，直接參與異青霉素N(IPN)的合成。參與?-內(nèi)酰胺環(huán)合成的還有L-半胱氨酸和L-纈氨酸，但試驗(yàn)中兩者的添加并未提高頭霉素 C的產(chǎn)量，其原因正在研究當(dāng)中。氨基酸添加時機(jī)為0h時對產(chǎn)素的刺激最大，其根本原因可能在于中間補(bǔ)料時對搖瓶的發(fā)酵環(huán)境造成了不同程度的影響。在合成培養(yǎng)基中加入的不同氨基酸，它們似乎是以各自不同的方式影響頭霉素C 的生物合成，這些氨基酸可能具有前體、誘導(dǎo)物和發(fā)育調(diào)節(jié)劑等一種或多種作用而影響頭霉素C的合成。

[1]Kamogashira T, Nishida T, Sugawara M, et al. Process for the production of antibiotic Cephamycin C:US,4332891[P].1982-06-01.

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[5]Pérez-Llarena FJ, Rodríguez-García A, Enguita FJ, Martín JF,Liras P. The pcd gene encoding piperideine-6- carboxylate dehydrogenase involved in biosynthesis of alpha-aminoadipic acid is located in the cephamycin cluster of Streptomyces clavuligerus. J Bacteriol[J].1998,(180):4753-4756.

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