李延菁, 趙毅蒙, 李昊洋, 馬德順

(沈陽(yáng)大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng)　110044)

小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞牽引力在誘導(dǎo)分化過(guò)程中的變化

李延菁, 趙毅蒙, 李昊洋, 馬德順

(沈陽(yáng)大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng)110044)

摘要:對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化,然后使用顯微鏡追蹤法比較了小鼠BMSCs成脂誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞牽引力(CTF)的變化,用熒光抗體染色技術(shù)觀察了單個(gè)細(xì)胞平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的變化,用Western Blot技術(shù)觀察了分化前后α-SMA總量的變化.結(jié)果顯示:小鼠BMSCs成脂分化后CTF均方根值平均增高66%,單個(gè)細(xì)胞α-SMA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及總體質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著上升.這表明小鼠BMSCs成脂分化后α-SMA的表達(dá)顯著上升并導(dǎo)致了CTF的增強(qiáng),這與其在分化過(guò)程中分子組成和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化有關(guān).

關(guān)鍵詞:小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞; 誘導(dǎo)分化; 細(xì)胞牽引力

貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中,肌動(dòng)球蛋白和肌動(dòng)蛋白共同作用使細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)部張力,并對(duì)細(xì)胞外的基質(zhì)施加牽引力,這個(gè)力叫做細(xì)胞牽引力[1](Cell Traction Force,CTF).CTF的大小和變化對(duì)細(xì)胞的形態(tài)保持、生長(zhǎng)、繁殖、分化、貼壁、拖曳及信號(hào)傳導(dǎo)等生物過(guò)程具有極其重要的影響[2].20世紀(jì)初Kawai-Kowase K等發(fā)現(xiàn)平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)是影響CTF的關(guān)鍵性蛋白[3].隨后Kong H J等研究發(fā)現(xiàn)α-SMA與CTF呈正相關(guān)性[4].CTF與干細(xì)胞分化有著密切的相關(guān)性.2010年馬德順等發(fā)現(xiàn)人前交叉韌帶干細(xì)胞分化后CTF減小30%,且α-SMA表達(dá)量明顯降低[5].CTF與腫瘤形成也有著密切的相關(guān)性,且人腫瘤細(xì)胞的CTF變化趨勢(shì)與小鼠腫瘤細(xì)胞相反.2012年Kraning-Rush Casey M等對(duì)轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移的乳腺癌、前列腺癌和肺癌細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性細(xì)胞CTF明顯高于非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞[6].2014年張晶晶等發(fā)現(xiàn)小鼠肝腫瘤細(xì)胞與正常肝細(xì)胞相比,α-SMA下降47. 9%,CTF減小53.4%[7].2014年牛慶元等發(fā)現(xiàn)小鼠肺癌細(xì)胞與正常肺細(xì)胞相比,α-SMA蛋白含量明顯下降,CTF減少49%[8].細(xì)胞基因的改變同樣會(huì)影響細(xì)胞形態(tài),進(jìn)而影響CTF水平.2012年周歷等經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)人腎小球足細(xì)胞敲除Pinch-3基因后與正常細(xì)胞相比細(xì)胞投影面積增加近40%,CTF也減小近40%[9].骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有很強(qiáng)的自我復(fù)制和多向分化潛能,具有非常重要的研究?jī)r(jià)值.但關(guān)于其在分化過(guò)程中的力學(xué)特性還未見(jiàn)報(bào)道.我們采用定向誘導(dǎo)分化的方法,使BMSCs向成脂細(xì)胞分化,并比較細(xì)胞牽引力及α-SMA在此過(guò)程中的變化,旨在探討定向誘導(dǎo)分化對(duì)小鼠BMSCs的力學(xué)特性及α-SMA的影響.

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

C57BL/6j小鼠(4周齡),體重(20±2)g,購(gòu)于沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;H-DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司,優(yōu)級(jí)犢牛血清購(gòu)于德國(guó)Biochrom公司;雙抗(含青霉素、鏈霉素)、胰蛋白酶及鬼筆環(huán)肽購(gòu)自Sigma公司;胰島素購(gòu)自Solarbio公司;吲哚美辛及IBMX購(gòu)自Aladdin公司;地塞米松及油素紅O購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司.

1.2細(xì)胞的采集與培養(yǎng)

頸椎脫臼法處死C57BL/6j小鼠,在體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精內(nèi)殺菌5 min.無(wú)菌操作臺(tái)中解剖小鼠取其雙側(cè)脛骨及股骨,去除肌肉及結(jié)締組織,骨兩側(cè)剪斷暴露骨髓腔[10].用1 mL注射器吸取H-DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔,肉眼見(jiàn)紅色骨髓流出,骨頭由粉紅色變?yōu)榘咨礇_洗干凈,用200目濾網(wǎng)過(guò)濾骨髓細(xì)胞懸液,制備成單細(xì)胞懸液.

小鼠BMSCs的篩選使用差速貼壁法聯(lián)合24 h首次換液法.對(duì)BMSCs細(xì)胞計(jì)數(shù),以1.0×104個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種到含體積分?jǐn)?shù)為20%優(yōu)級(jí)犢牛血清的H-DMEM的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi).CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng),溫度設(shè)置為37 ℃,CO2體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為5%.1.5 h后棄貼壁細(xì)胞,收集上層細(xì)胞懸液,置于新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng).24 h后首次全量換液,之后每?jī)商彀肓繐Q液.待細(xì)胞長(zhǎng)至80%鋪滿瓶底時(shí)傳代培養(yǎng).

1.3BMSCs的成脂誘導(dǎo)分化

取第三代BMSCs進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化,將其分為誘導(dǎo)組和對(duì)照組.將誘導(dǎo)組BMSCs接種于6孔板,細(xì)胞培養(yǎng)24 h后換為成脂誘導(dǎo)液A液(含胎牛血清200 mg/L、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 U/mL的H-DMEM、地塞米松1 μmol/L、胰島素10 mg/L、吲哚美辛200 μmol/L、IBMX 0.5 μmol/L)[11],3天后換成成脂誘導(dǎo)B液(含胎牛血清200 mg/L、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 U/mL的H-DMEM、胰島素10 mg/L),重復(fù)以上步驟3次[12].每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞,待胞漿內(nèi)出現(xiàn)圓形空泡后,用PBS洗滌,體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗去固定液后油紅O浸染15 min,蒸餾水漂洗,鏡下觀察,若觀察到橘紅色脂肪滴證明成脂分化成功.對(duì)照組正常培養(yǎng)(含胎牛血清200 mg/L、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的H-DMEM).

1.4細(xì)胞牽引力的測(cè)算

1.4.1CTFM 技術(shù)的基本原理

CTFM技術(shù)是將細(xì)胞培養(yǎng)在剛性適中的含有熒光微珠的凝膠彈性基底表面,利用熒光倒置顯微鏡來(lái)追蹤觀察細(xì)胞存在和不存在情況下基質(zhì)的變化,并以此推算細(xì)胞牽引力的方法.

1.4.2操作步驟

將丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺按照設(shè)定的比例混合制備成硬度為3 000 Pa的底層凝膠,表層用同樣硬度的凝膠混合體積分?jǐn)?shù)為2%的熒光微珠.凝膠盤(pán)在接種細(xì)胞之前用I型膠原蛋白液進(jìn)行預(yù)處理后,滴入一滴Sulfo-SANPAH,并使用紫外光(UV)處理.將含有約1 500個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到凝膠盤(pán)上,培養(yǎng)1 h觀察其貼壁良好后加入培養(yǎng)液再培養(yǎng)5 h.在每個(gè)凝膠盤(pán)中選擇一個(gè)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),記錄由于細(xì)胞遷移導(dǎo)致的基底變形,利用熒光顯微鏡成像,將所得圖像資料上機(jī)分析.

1.4.3圖像數(shù)據(jù)的分析與處理

利用MATLAB7.0軟件運(yùn)行專(zhuān)用分析程序,計(jì)算BMSCs成脂分化前后的熒光微珠圖片,得出各樣本細(xì)胞牽引力的均方根,位移,牽引力最大值等各項(xiàng)數(shù)據(jù),將所得數(shù)據(jù)匯總錄入SPSS19.0進(jìn)行分析.

1.5熒光抗體染色技術(shù)

將小鼠BMSCs種在蓋玻片上,密度長(zhǎng)至70%～80%后用PBS清洗掉蓋玻片上的細(xì)胞培養(yǎng)液,體積分?jǐn)?shù)為3.7%的甲醛-PEMD固定10 min,PBS洗去固定液,體積分?jǐn)?shù)為0.1%TritonX-100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透10 min,PBS洗滌.山羊血清封閉30 min.一抗選用鼠抗α-SMA特異蛋白,冰箱中培養(yǎng)過(guò)夜,PBS洗凈未結(jié)合的一抗,二抗選用FITC標(biāo)記兔抗小鼠IgG.室溫下避光培養(yǎng)2 h.用PBS清洗三次和蒸餾水清洗一次.緩沖甘油封片,顯微鏡下觀察并拍照.

1.6Western Blot技術(shù)

分別取2 mL小鼠BMSCs成脂分化前后細(xì)胞培養(yǎng)液,1.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞,制備電泳樣本,BCA(蛋白定量分析)試劑盒檢測(cè)其濃度,取等量蛋白樣本注入10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的聚丙烯酰胺凝膠,90 V恒定電壓電泳,用電轉(zhuǎn)膜儀以70 V電壓轉(zhuǎn)膜,時(shí)間為90 min.用5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PBS-Tween20緩沖液處理1 h,一抗選用抗鼠α-SMA特異蛋白,二抗選用過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白,用ECL蛋白檢測(cè)試劑盒對(duì)α-SMA進(jìn)行檢測(cè)[13].

2結(jié)果

2.1細(xì)胞牽引力的變化

圖1小鼠BMSCs分化前后細(xì)胞牽引力的變化

Fig.1The changes of cell traction force in mice BMSCs before and after adipogenic differentiation

(a)—小鼠BMSCs分化前的位移; (b)—小鼠BMSCs分化前牽引力的測(cè)算結(jié)果;

(c)—小鼠BMSCs分化后的位移; (d)—小鼠BMSCs分化后牽引力的測(cè)算結(jié)果;

(e) —小鼠BMSCs對(duì)照組的位移; (f)—小鼠BMSCs對(duì)照組牽引力的測(cè)算結(jié)果.

應(yīng)用CTFM方法對(duì)小鼠BMSCs誘導(dǎo)成脂分化前后牽引力進(jìn)行測(cè)量.圖1分別為小鼠BMSCs誘導(dǎo)成脂分化前后的位移及CTF.結(jié)果顯示小鼠BMSCs在分化前后對(duì)比基質(zhì)上產(chǎn)生的最大位移由1.5 μm增長(zhǎng)為1.8 μm.小鼠BMSCs誘導(dǎo)成脂分化前后的均方根牽引力平均值由134 Pa增高到223 Pa,大約增長(zhǎng)了66%,較分化前升高,但對(duì)照組與分化前細(xì)胞牽引力及位移變化微小 (圖1).用SPSS19.0對(duì)分化前后數(shù)據(jù)進(jìn)行成對(duì)樣品t檢驗(yàn),結(jié)果顯示分化前與分化后數(shù)據(jù)差異顯著,分化前與對(duì)照組差異不顯著,分化后與對(duì)照組差異顯著(圖2).

圖2　小鼠BMSCs成脂分化前后及對(duì)照組的

2.2單細(xì)胞α-SMA蛋白的變化

A小鼠BMSCs分化前α-SMA蛋白比較疏松且含量低;小鼠BMSCs分化后α-SMA蛋白比較密集且含量高.對(duì)比分化前、分化后及對(duì)照組α-SMA情況,說(shuō)明小鼠BMSCs在成脂分化后其α-SMA蛋白含量明顯高于分化前及對(duì)照組的α-SMA蛋白含量,且分化前與對(duì)照組α-SMA水平相近,見(jiàn)圖3.

2.3α-SMA蛋白總量的變化

圖3小鼠BMSCs成脂分化前后α-SMA 分布的變化

Fig.3The changes of theα-SMA expression level in mice BMSCs before and after adipogenic differentiation

(a)—小鼠BMSCs成脂分化前α-SMA的分布;(b)—小鼠BMSCs成脂分化后α-SMA的分布;

(c)—對(duì)照組小鼠BMSCsα-SMA的分布.

利用Western Blot的方法測(cè)定小鼠BMSCs分化前后2mL細(xì)胞所含α-SMA蛋白總量的差異.所得條帶越寬說(shuō)明α-SMA總量越高.結(jié)果顯示分化后α-SMA蛋白濃度明顯高于分化前及對(duì)照組的濃度,分化前α-SMA蛋白總含量與對(duì)照組相近,說(shuō)明小鼠BMSCs成脂分化后α-SMA蛋白總含量顯著提高,見(jiàn)圖4.

圖4　小鼠BMSCs成脂分化前后α-SMA蛋白的變化

3討論

小鼠BMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化后CTF及α-SMA含量均顯著升高了,這一結(jié)果與我們之前研究的小鼠腫瘤細(xì)胞的力學(xué)特性相似,因?yàn)槟[瘤細(xì)胞是干細(xì)胞分化停止或正常細(xì)胞去分化的結(jié)果,所以,它們之間具有相似性是有科學(xué)道理的.小鼠BMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化后CTF及α-SMA的變化趨勢(shì)與人細(xì)胞的變化趨勢(shì)相反,這一點(diǎn)也與之前的研究成果吻合,說(shuō)明不同物種間α-SMA的調(diào)控機(jī)制有差異,具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究,但是,α-SMA與CTF的相關(guān)性是完全一致的,不論人類(lèi)細(xì)胞還是小鼠細(xì)胞α-SMA與CTF兩者之間均存在正相關(guān)性,因?yàn)镃TF的產(chǎn)生源于α-SMA的表達(dá),這一點(diǎn)與Chen J X等學(xué)者的研究成果相一致[14].小鼠BMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化后,CTF及α-SMA含量均明顯上升,這可能是由于成脂細(xì)胞的組成和結(jié)構(gòu)促進(jìn)了α-SMA的表達(dá)造成的,從而導(dǎo)致CTF的相應(yīng)變化,其詳細(xì)的變化機(jī)制和過(guò)程還有待于進(jìn)一步深入研究.

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【責(zé)任編輯: 李艷】

Changes of Cell Traction Force of Mice Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells during Induced Differentiation

LiYanjing,ZhaoYimeng,LiHaoyang,MaDeshun

(College of Life Science and Bioengineering, Shenyang University, Shenyang 110044, China)

Abstract:Mice bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) are induced to adipogenic differentiation, and then the changes of the cell traction force are observed and compared with cell traction force microscopy (CTFM), and theα-SMA protein changes of single cell are determined with fluorescent antibody staining technology, and the changes of totalα-SMA are observed using Western Blot technology before and after the induced to adipogenic differentiation in BMSCs. The results show that the root mean square of cell traction force (CTF) in mice BMSCs increases by 66% after induced to adipogenic differentiation, the level of both single cellα-SMA and totalα-SMA increases significantly. It shows that the increase of expression ofα-SMA causes a CTF to rise. It is related to changes in the process of differentiation of the molecular composition and internal structure.

Key words:BMSCs; induced differentiation; CTF

中圖分類(lèi)號(hào):R 734

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):2095-5456(2015)06-0446-05

作者簡(jiǎn)介:李延菁(1990-),女,遼寧朝陽(yáng)人,沈陽(yáng)大學(xué)碩士研究生; 馬德順(1962-),男(回族),遼寧沈陽(yáng)人,沈陽(yáng)大學(xué)教授,碩士研究生導(dǎo)師.

收稿日期:2015-04-14