王偉佳，張秀明，胡紅霞

（中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心，廣東省重點實驗室，廣東中山 528403）

甾醇類新藥NSC67657誘導(dǎo)的HL60細胞單核系分化中β-catenin／ICAT蛋白差異表達及相互作用研究

王偉佳，張秀明，胡紅霞

（中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心，廣東省重點實驗室，廣東中山 528403）

中國圖書分類號：R329．2；R329．24；R394．2；R977．6

摘要：目的 分析甾醇類新藥NSC67657誘導(dǎo)HL60細胞單核系分化中，β-catenin／ICAT蛋白的差異表達及相互作用，探討NSC67657誘導(dǎo)細胞分化的作用機制。方法 應(yīng)用10 μmol·L－1NSC67657誘導(dǎo)HL60細胞分化，采用細胞化學(xué)染色和流式細胞技術(shù)評估細胞的分化方向和分化程度；通過RT-PCR和Western blot方法驗證藥物作用細胞前后β-cate-nin和ICAT基因和蛋白的表達差異；采用免疫共沉淀技術(shù)分析β-catenin與ICAT蛋白的相互作用情況；采用激光共聚焦技術(shù)協(xié)同分析目的蛋白的差異表達及細胞內(nèi)定位。結(jié)果

NSC67657可誘導(dǎo)HL60細胞向單核系分化。在10 μmol· L－1NSC67657作用5 d后，CD14的表達可達到90%以上，細胞化學(xué)染色支持細胞單核系分化結(jié)論。分化后ICAT基因和蛋白表達明顯升高（P＜0.01），而β-catenin基因和蛋白表達明顯下降（P＜0.05）。免疫共沉淀結(jié)果顯示，ICAT與β-catenin蛋白在細胞分化前后都存在相互作用，藥物誘導(dǎo)細胞分化后兩者蛋白相互作用條帶吸光度明顯增加。激光共聚焦結(jié)果顯示，ICAT蛋白和β-catenin蛋白在胞質(zhì)和胞核均有熒光，藥物誘導(dǎo)HL60細胞分化后，ICAT蛋白胞質(zhì)和胞核熒光均明顯增加，β-catenin蛋白在核內(nèi)熒光明顯減弱，但胞質(zhì)熒光強度增加，有蛋白胞質(zhì)轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。結(jié)論 NSC67657能夠誘導(dǎo)HL60細胞向單核系分化，且引起ICAT蛋白和β-catenin蛋白的表達差異；ICAT蛋白與β-catenin蛋白的相互作用增強及β-catenin蛋白從胞核向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，提示NSC67657可能通過下調(diào)并阻止β-catenin蛋白入核，從而導(dǎo)致HL60細胞單核系分化。

關(guān)鍵詞：NSC67657；分化，單核系；β-catenin／ICAT蛋白；表達差異；相互作用；HL60細胞

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－10－16 9：52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．028．html

NSC67657是美國癌癥研究中心（National Canc- er Institute，NCI）近期報道的甾醇類新藥，能夠高效促進人急性髓系白血病HL60細胞向單核系分化［1］。前期研究中，課題組采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選了細胞分化差異表達蛋白，其中β-catenin相關(guān)蛋白1（beta-catenin-interacting protein 1，ICAT）作為Wnt信號通路的關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子通過質(zhì)譜技術(shù)得到確認［2］。為了了解Wnt信號通路在細胞分化中的作用，本研究將對細胞分化前后ICAT蛋白及與之相關(guān)的β-連環(huán)素蛋白（β-catenin）的表達水平、相互作用及細胞內(nèi)定位進行分析，對Wnt信號通路在藥物誘導(dǎo)HL60單核系分化中的可能作用機制進行探討。

1　材料與方法

1．1細胞系與主要試劑 人髓系白血病細胞系HL60（上海細胞庫生命科學(xué)研究所）；甾醇類新藥NSC67657（美國癌癥研究中心）；細胞培養(yǎng)基IM-DM、胎牛血清（美國Gibco公司）；RT-PCR試劑盒（大連寶生物有限公司）；羊抗人ICAT多抗、兔抗人β-catenin多抗、辣根過氧化物酶標記抗羊、抗兔二抗及兔抗人β-tubulin單抗等（美國Santa Cruz公司）；抗CD14及其對照抗體（深圳晶美生物工程有限公司）；DAPI核熒光染料、RBITC標記抗羊二抗、FITC標記抗兔二抗（碧云天生物技術(shù)有限公司）；細胞蛋白抽提純化試劑盒（上海生物工程有限公司）。

1．2NSC67657誘導(dǎo)HL60細胞分化驗證 收集對數(shù)生長期非藥物處理HL60細胞和10 μmol·L－1的NSC67657作用5 d后的細胞，PBS洗滌3次，調(diào)節(jié)細胞濃度5×108·L－1，離心涂片，參照教材《血液學(xué)檢驗試驗指導(dǎo)》［3］分別對藥物作用前后細胞進行瑞氏染色、酯酶染色及NaF抑制試驗，觀察細胞形態(tài)。同樣取對數(shù)生長期HL60細胞，加入NSC67657誘導(dǎo)細胞分化，采用流式細胞技術(shù)檢測細胞表面分化抗原CD14的表達情況。對照組除未加藥物其余與處理組相同。

1．3NSC67657誘導(dǎo)HL60細胞分化中ICAT與β-catenin基因和蛋白的表達情況 收集對數(shù)生長期HL60細胞，調(diào)整細胞濃度為1×109·L－1，采用

10μmol·L－1的NSC67657作用HL60細胞，對照組除未加NSC67657外其余與處理組相同。處理組與對照組在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5 d，提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過30個循環(huán)擴增。產(chǎn)物經(jīng)0.15 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳，在Bio-Rad凝膠成像儀上觀察并分析光密度。引物設(shè)計如下：β-catenin正義5′-CTGCAGGGGTCCTCTGTG-3′，反義5′-TG-CATATGTCGCCACACC-3′；ICAT正義5′-GGGAAT-TCATGAACCGCGAGGGAGCAC-3′，反義5′-GGG-GATCCCAGCTACTGCCTCCG GTCTTCCGTCTC-3′。

同樣收集對照組與處理組細胞，用細胞裂解液裂解，提取總蛋白，Bradford法進行蛋白定量。取60 μg蛋白進行16%SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜、封閉、加入抗體孵育?；瘜W(xué)發(fā)光法顯色，于Bio-Rad凝膠儀上成像并進行密度分析。

1．4采用免疫共沉淀（Co-IP）分析ICAT蛋白與β-catenin蛋白之間的相互作用 收集非處理和NSC67657作用5 d后的HL60細胞，加入細胞裂解液和細胞蛋白酶抑制劑PMSF，待細胞充分裂解后加入8 μg抗β-catenin抗體，4℃緩慢搖晃孵育過夜；取100 μL protein A瓊脂糖珠，將protein A瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中，4℃緩慢搖晃孵育2～4 h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；免疫沉淀反應(yīng)后，低溫條件離心吸去上清，裂解緩洗滌；最后加入2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min，離心后取上清；采用抗ICAT抗體，依據(jù)上述Western blot方法確定結(jié)合蛋白。采用結(jié)腸癌SW480細胞蛋白做為陽性對照。

1．5激光共聚焦分析藥物作用HL60細胞前后ICAT與β-catenin蛋白的表達與定位 分別收集非處理和NSC67657作用5 d后的HL60細胞，冷丙酮固定30 min，經(jīng)過150 mL·L－1小牛血清封閉，PBS洗滌后，孵育不同種屬來源一抗，4℃過夜。再次洗滌后，先后滴加RBITC標記和FITC標記且針對不同種屬的二抗和DAPI染料，分別孵育30 min 和3 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1．6統(tǒng)計學(xué)分析 結(jié)果通過統(tǒng)計軟件SPSS 11.5分析。均值間比較使用t檢驗，藥物處理前后ICAT 與β-catenin表達比較采用配對t檢驗。

2　結(jié)果

2．1NSC67657誘導(dǎo)HL60細胞單核系分化驗證HL60細胞在NSC67657作用下增殖明顯受抑，瑞氏染色中，對照組HL-60細胞仍處于幼稚原始狀態(tài)，處理組可見明顯的單核系分化的細胞，如Fig 1A、B所示。酯酶染色中，對照組HL60細胞酯酶染色陽性，但不會被NaF抑制，NSC67657處理組NaF抑制率＞50%，如Fig 1C、D所示。對照組CD14＋細胞小于2%，藥物處理組CD14＋細胞大于90%，如Fig 1E、F所示。以上結(jié)果提示NSC67657已誘導(dǎo)HL60細胞完全分化。

Fig 1 Verification of HL60 cellular differentiation when induced by NSC67657

2．2NSC67657誘導(dǎo)HL60細胞分化前后ICAT／β-catenin差異表達分析 NSC67657作用HL60細胞5 d后，可見ICAT基因表達增加（P＜0.01），蛋白水平也相應(yīng)增加（P＜0.01），如Fig 2A、B所示。反之，β-catenin基因表達下調(diào)（P＜0.05），蛋白水平也相應(yīng)下調(diào)（P＜0.05），如Fig 2C、D所示。

2．3藥物誘導(dǎo)細胞分化前后ICAT蛋白與β-cate-nin蛋白之間相互作用確認 本實驗采用β-catenin一抗包被瓊脂糖珠，與之結(jié)合的ICAT蛋白被順利檢測，非藥物處理組與NSC67657誘導(dǎo)分化組樣本的上清液中均檢測到ICAT蛋白，提示該實驗樣本有ICAT蛋白的表達；Co-IP實驗顯示NSC67657處理

組ICAT蛋白條帶吸光度明顯高于非處理組，不僅驗證了β-catenin／ICAT蛋白存在相互作用，還提示藥物處理后ICAT蛋白與β-catenin蛋白相互作用有增強的趨勢，如Fig 3所示。

Fig 2 Differential expression of ICAT／β-catenin in HL60 cells when treated or not treated by NSC67657

Fig 3 Protein interaction between ICAT and β-catenin in HL60 cells when treated or not treated by NSC67657

2．4激光共聚焦檢測ICAT／β-catenin蛋白在細胞內(nèi)表達差異及細胞內(nèi)定位 實驗結(jié)果顯示，NSC67657作用HL60細胞后，ICAT蛋白（紅色標記）熒光強度明顯增加，細胞核內(nèi)及胞質(zhì)中均現(xiàn)熒光增強趨勢；相比之下，β-catenin蛋白（綠色熒光）熒光強度下降，尤其是細胞核內(nèi)熒光明顯減弱，而胞質(zhì)熒光強度增加，呈現(xiàn)熒光胞質(zhì)轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，提示β-catenin蛋白在藥物作用后可能入核減少，如Fig 4

所示。

Fig 4 Pictures from laser confocal microscopy to analyze the expression and intracellular location ofICAT／β-catenin proteins

3　討論

Wnt信號通路是一個復(fù)雜的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，其功能常見于胚胎發(fā)育期和癌癥，但也參與成年動物的正常生理。Wnt信號通路是細胞增殖分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)，參與了基因表達調(diào)節(jié)、細胞的遷移黏附、細胞極化等過程，同時還與其他信號通路存在交叉協(xié)同，參與干細胞的更新和分化［4］。其經(jīng)典的激活途徑是游離的β-catenin進入細胞核與輔轉(zhuǎn)錄因子LEF／TCF結(jié)合，調(diào)節(jié)下游基因如cyclin D1［5］、c-Myc［6］、PPARδ［7］、Tcf-1［8］和CD44［9］等的表達，這些基因的激活在細胞的增殖、分化以及惡性轉(zhuǎn)變中都發(fā)揮重要作用［10］。整個通路存在內(nèi)在平衡，一旦平衡打破，就可能成為腫瘤發(fā)生的重要誘因。ICAT蛋白是Wnt信號通路的重要調(diào)節(jié)因子，其可以與LEF／ TCF競爭性地結(jié)合β-catenin蛋白，從而抑制下游靶點激活［11］。雖然這些假說在其他研究中已經(jīng)得到證實，但NSC67657是否通過這條通路誘導(dǎo)HL60細胞單核系分化仍需進一步確認。

本研究驗證了HL60細胞單核系分化后ICAT基因和蛋白的表達上調(diào)，β-catenin基因和蛋白的表達下調(diào)，提示藥物可能通過誘導(dǎo)ICAT的表達升高，從而干預(yù)β-catenin與LEF／TCF的結(jié)合及下游靶點的激活。免疫共沉淀結(jié)果顯示，ICAT蛋白與β-cate-nin蛋白確實在細胞分化前后存在相互作用，且在藥物誘導(dǎo)細胞分化后作用增強，可能與ICAT蛋白高表達有關(guān)，但不能解釋β-catenin蛋白低表達的現(xiàn)象。激光共聚焦結(jié)果顯示，NSC67657誘導(dǎo)HL60細胞單核系分化后，ICAT蛋白在細胞核和胞質(zhì)均表達升高，β-catenin蛋白反之下降。有趣的是，β-catenin蛋白不但整體熒光減弱，還出現(xiàn)蛋白向胞質(zhì)轉(zhuǎn)位趨勢，這與Rhee等報道結(jié)果對應(yīng)。Rhee等［12］將10株頭頸部鱗狀細胞癌細胞株與正?？谇簧掀ぜ毎M行比較，結(jié)果顯示W(wǎng)nt10的水平在前者明顯增加。并且發(fā)現(xiàn)19個Wnt家族成員的11個在頭頸部鱗狀細胞癌細胞株中高表達，同時表達Wnt的癌細胞胞質(zhì)中β-catenin水平增高，并向胞核移位，提示了鱗狀細胞癌細胞的生長和存活與Wnt信號通路的相關(guān)性。雖然白血病細胞與頸部鱗狀癌細胞屬于不同種屬，但能為Wnt信號通路在腫瘤發(fā)病機制的研究提供借鑒。

本研究首次報道了甾醇類新藥NSC67657誘導(dǎo)HL60細胞分化的可能機制，作為高效誘導(dǎo)劑，其分子機制的深入研究將為后期化療藥物的開發(fā)及靶向治療提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。該研究僅為Wnt通路對分化作用的初步探討，其下游靶基因的變化趨勢，及ICAT蛋白受到抑制或Wnt信號通路受到激活的情況下，細胞是否仍然會被藥物誘導(dǎo)等一系列問題將是本課題組后續(xù)的研究重點。

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Differential expression and interaction of β-catenin／ICAT proteins in NSC67657 induced monocytic differentiation of HL60 cells

WANG Wei-jia，ZHANG Xiu-ming，HU Hong-xia
（Dept of Laboratory Medicine，Key Laboratory of Guangdong Province，Sun Yat-sun University Affiliated Zhongshan Hospital，Zhongshan Guangdong 528403，China）

Abstract：Aim To analyze differential expression and interaction of β-catenin／ICAT proteins in HL60 cells when they were induced into monocytic differentiation，and to figure out the mechanism of NSC67657 in cellu-lar induction．Methods HL60 cells were treated by 10 μmol·L－1NSC67657，and cellular differentiation could be observed by cytochemical staining and flow cytometry．Then，RT-PCR and Western blot were em-ployed to determine the differential expression of β-catenin／ICAT genes and proteins．Co-immunoprecipi-tation assay was used to confirm the interaction of β-catenin／ICAT proteins，and laser co-focus light mi-croscopy technology was used to co-indentify proteins differential expression and intracellular location．Re-sults HL60 cells could be induced into monocytic dif-ferentiation after 5 days treatment using 10μM NSC67657．The CD14（＋）%cells could be up to o-ver 90%，and cytochemical staining reports were con-sistent with this result．The expressions of ICAT gene and protein were up-regulated significantly（P＜ 0.01），but the expressions of β-catenin gene and pro-tein，on the contrary，were down-regulated（P＜0.05）when HL60 cells were induced into monocytic differen-tiation．From co-immunoprecipitation assay findings，ICAT protein interacted with β-catenin protein，and the absorbance of protein electrophoresis bands in-creased in differentiated cells．From laser co-focus light microscopy assay findings，the fluorescence of ICAT and β-catenin protein could be both observed in cytoplasm and nucleus．In drug treated HL60 cells，the fluorescence of ICAT protein was enhanced both in cytoplasm and nucleus，however，the fluorescence ofβ-catenin protein，which looked like transferring into different organelles，decreased significantly in nucleus，but increased in cytoplasm．Conclusions HL60 cells could be induced into monocytic differentiation by NSC67657 and β-catenin／ICAT proteins differentially expressed during cellular differentiation．The enhanced interaction of β-catenin／ICAT proteins and β-catenin protein transferring from nucleus into cytoplasm indi-

cates that NSC67657 probably induces HL60 cells into monocytic differentiation through down-regulating β-catenin protein and blocking β-catenin protein from nu-cleus．

Key words：NSC67657；monocytic differentiation；β-catenin／ICAT proteins；differential expression；inter-action；HL60 cells

作者簡介：王偉佳（1981－），男，博士后，研究方向：白血病化療新藥的開發(fā)與應(yīng)用，E-mail：xuelangchichao＠163．com；張秀明（1964－），男，碩士，教授，研究方向：蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在新藥開發(fā)研究中的應(yīng)用，通訊作者，E-mail：snow-touching＠hotmail．com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No 81301492）

收稿日期：2015－07－29，修回日期：2015－08－26

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）11－1547－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．014