許小向，蔣　艷，洪艷平*，胡潔芳，

吳少福1，尹小莉2，王純榮1

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書館，江西南昌330045)

紅巧梅花色苷樹脂靜態(tài)純化工藝研究

許小向1，蔣艷1，洪艷平1*，胡潔芳1，

吳少福1，尹小莉2，王純榮1

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書館，江西南昌330045)

摘要：以紅巧梅提取液為試驗(yàn)對象，通過考察樹脂的靜態(tài)吸附率和解吸率，從8種樹脂中優(yōu)選出DM-28為適合純化紅巧梅花色苷的樹脂，并研究了DM-28純化紅巧梅花色苷的工藝參數(shù)。結(jié)果表明，DM-28靜態(tài)純化紅巧梅花色苷的工藝參數(shù)為：在吸附溫度為50 ℃，最適吸附pH 2.8，吸附時(shí)間6 h的條件下進(jìn)行吸附，在40 ℃條件下以體積分?jǐn)?shù)為90% pH 5.0乙醇溶液解吸效果最好。純化后紅巧梅花色苷色價(jià)為純化前的4.84倍。

關(guān)鍵詞：紅巧梅；花色苷；樹脂純化

紅巧梅(GlobeAmaranth)，俗稱妃子紅茶，因其具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、解郁降火、補(bǔ)血、健脾胃、消炎、祛斑等功能活性，特別是對內(nèi)分泌紊亂引起的黃褐斑、雀斑、肝斑、色斑、暗瘡有明顯療效[1]，因此，紅巧梅常作為人們的一種日常養(yǎng)生保健飲用花茶。

花色苷是由花青素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類多酚類化合物，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等器官的細(xì)胞液中，在不同酸堿性環(huán)境下呈現(xiàn)出紅色、藍(lán)色或紫色等顏色，具有抗氧化[2]、抗炎癥[3]、

抗腫瘤[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]等生物活性，還具有延緩衰老、增強(qiáng)抵抗力、促進(jìn)血液循環(huán)的保健功效[6-8]。近幾年，因大孔樹脂理化性質(zhì)穩(wěn)定、分離性能優(yōu)良、使用方便、溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛地應(yīng)用于天然植物活性成分的提取分離[9-11]，利用大孔吸附樹脂純化天然植物花色苷多見于紫甘薯[12]、藍(lán)莓果[13]、葡萄[14]等果蔬中。目前，對花色苷提取、純化的研究有較多的文獻(xiàn)報(bào)道，但關(guān)于紅巧梅花色苷的研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)以紅巧梅為原料，通過測定花色苷提取得率，確定加熱水提法提取紅巧梅花色苷的提取工藝條件；再通過比較8種大孔樹脂對紅巧梅花色苷靜態(tài)吸附與解吸效果，篩選出適合純化紅巧梅花色苷的樹脂類型。以靜態(tài)條件下的吸附率和解吸率為考察指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)化出大孔樹脂 DM-28純化紅巧梅花色苷的工藝參數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步開發(fā)利用紅巧梅提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

紅巧梅：市場購買；實(shí)驗(yàn)藥品：無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、醋酸、醋酸鈉均為分析純；AB-8、DM-21、DM-28、DM-21、DM-2、DM-20、X-5、聚酰胺8種吸附樹脂(山東魯抗立科藥業(yè)有限公司)。

1.2儀器

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；Q-350B3型高速粉碎機(jī)，上海冰都電器有限公司生產(chǎn)；FA2104V型電子天平，上海青浦儀器有限公司生產(chǎn)；V-5600型可見光分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；TDL-5-A型低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；ZD-A30普通型真空冷凍干燥機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；HZQ-2冷凍恒溫振蕩器，金壇市國旺實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1紅巧梅預(yù)處理將干燥的紅巧梅置于Q-350B3型高速粉碎機(jī)中粉碎，密封待用。

1.3.2紅巧梅花色苷含量測定(1)緩沖液的配制。醋酸-醋酸鈉緩沖液：稱取6.8 g醋酸鈉定容500 mL，濃度為0.2 mol/mL；移取5.8 mL冰醋酸溶液定容500 mL，物質(zhì)的量的濃度為0.2 mol/mL，按醋酸和醋酸鈉不同體積比配置不同pH的醋酸-醋酸鈉緩沖液。

(2)紅巧梅花色苷最大吸收波長的確定。將一定量紅巧梅花色苷提取液稀釋，用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，使其吸光值在一定范圍內(nèi)，并在400～700 nm波長范圍內(nèi)掃描，繪制吸收光譜曲線，確定紅巧梅花色苷的最大吸收波長為530 nm，結(jié)果如圖1。

圖1　紅巧梅花色苷光譜掃描圖Fig.1　Spectrum scanogram of anthocyanins from Globe Amaranth

圖2　不同pH紅巧梅提取液的吸光值Fig.2　Absorbance of the extracts from Globe Amaranth in different pH

(3)花色苷提取得率的計(jì)算(以紅巧梅干質(zhì)量計(jì))及水提工藝的確定。取3.0 g紅巧梅粉末進(jìn)行水提，將提取液用蒸餾水定容至250 mL，準(zhǔn)確移取4 mL，加入不同pH醋酸鈉-醋酸緩沖液，定容至10 mL，在波長530 nm處測定其吸光值(A)，由圖2可知，提取液在pH4.0時(shí)所測吸光值最大，因此，待測液在測定吸光值前將pH全部調(diào)至4.0后再測定，花色苷提取得率按下面公式計(jì)算：

花色苷提取得率(mg/g)=(A/εL)×Mw × Df × V/Mt

式中A為pH 4.0時(shí)花色苷的吸光值；Mw是矢車菊花素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量449.2；ε是矢車菊素-3-葡萄糖苷消光系數(shù)26 900；L為光程1 cm；Df為稀釋因子；V為最終體積，mL；Mt為樣品質(zhì)量。

以紅巧梅花色苷提取得率為指標(biāo)，在考察pH、料液比、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定紅巧梅花色苷最佳水提工藝為pH 5.0、料液比1∶30(W∶V)、提取時(shí)間30 min、提取溫度50 ℃，以優(yōu)化條件所得提取液用于樹脂的純化。

1.3.3樹脂篩選(1)樹脂預(yù)處理。將大孔樹脂AB-8、DM-21、DM-28、DM-21D、DM-2、DM-20、X-5以體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇浸泡，不斷攪拌，除去氣泡后裝入柱中。用3倍柱床體積(BV)95%乙醇洗脫，洗至洗脫液透明并在蒸干后無殘?jiān)?或極少殘?jiān)?，然后用蒸餾水以相同流速清洗至無色無醇味。再依次用2倍BV 5% NaOH溶液浸泡后蒸餾水洗至pH為中性，2倍BV的4%鹽酸浸泡并以蒸餾水洗脫至pH中性；聚酰胺按文獻(xiàn)[15]方法處理；備用。

(2)靜態(tài)吸附和解吸性能比較。分別稱取活化處理的8種樹脂0.5 g置于250 mL具塞錐形瓶中，加入pH 4.0吸光值0.438(A0)紅巧梅花色苷粗提液50 mL，蓋緊瓶塞。在搖床中放置24 h，吸取上清液測定其吸光值(A1)。將充分吸飽的樹脂抽濾至干，各稱取0.5 g置于250 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL pH 4.0的80%乙醇溶液在搖床中解吸24 h，吸取上清液測定其吸光值(A2)，按下列公式計(jì)算各樹脂的靜態(tài)吸附率和解吸率。

1.3.4DM-28樹脂靜態(tài)吸附單因素和正交試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取活化處理的DM-28樹脂0.5g于250mL具塞三角瓶中，加入吸光值相同的花色苷提取液50mL，在搖床中放置一定時(shí)間，取上清液測定吸光值。以吸附率為指標(biāo)，分別考察吸附時(shí)間、溶液pH和溫度對大孔樹脂吸附效果的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)選出DM-28吸附紅巧梅花色苷的工藝條件，因素水平見表1。

表1　紅巧梅花色苷吸附正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.5DM-28樹脂靜態(tài)解吸稱取0.5 g按優(yōu)化條件吸附飽和的DM-28樹脂于250 mL具塞三角瓶中，加入相同體積的乙醇溶液在搖床中震蕩24 h后取上清液測定吸光值。通過解吸率考察乙醇溶液pH值、解吸溫度、乙醇濃度對吸附于DM-28樹脂上花色苷解吸的影響。

2結(jié)果與分析

2.1八種樹脂的吸附與解吸性能比較

由表2可知，8種大孔樹脂對紅巧梅花色苷均有一定的吸附性能，其中DM-28型、DM-21型相對其他樹脂來說，其吸附率都比較高，但結(jié)合解析率，DM-28型大孔樹脂對紅巧梅花色苷的解析率高于DM-21型，故選擇DM-28為本試驗(yàn)的最佳樹脂。

表2　八種樹脂對紅巧梅花色苷靜態(tài)吸附和解吸特性

2.2樹脂靜態(tài)吸附單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1吸附時(shí)間、pH值、吸附溫度對DM-28樹脂吸附率的影響由圖3(a)可知，隨時(shí)間的延長紅巧梅花色苷吸附率不斷增大，在6 h后吸附率基本不變，由此可知大孔樹脂已基本達(dá)到吸附飽和狀態(tài)，故選擇6 h為較適合的吸附時(shí)間；溶液的pH值對花色苷共軛結(jié)構(gòu)影響極大，因而影響其對光的吸收而使花色苷在可見光下呈現(xiàn)出不同的色澤。戴余軍等[9]在研究大孔樹脂對黑胡蘿卜花色苷純化工藝時(shí)，指出花色苷類物質(zhì)在酸性條件下較穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)測定了在酸性條件下DM-28對紅巧梅花色苷的吸附能力，結(jié)果如圖3(b)所示，隨著pH的增大，DM-28對紅巧梅花色苷的吸附率呈先升后降的趨勢。原因可能是由于溶液酸性的減弱，花色苷在溶液中存在的結(jié)構(gòu)形式發(fā)生變化而引起花色苷極性變化，從而影響樹脂對其的吸附力，并且由于結(jié)構(gòu)改變使花色苷溶液在530 nm波長下的吸收受到影響?？紤]到花色苷在酸性環(huán)境中具有較高的穩(wěn)定性，確定溶液pH 3.2時(shí)為較佳吸附pH值；圖3(c)結(jié)果表明，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度的升高有利于樹脂對花色苷的吸附，溫度過高反而降低樹脂對花色苷的吸附性能，原因可能存在于以下兩個(gè)方面：其一，較高溫度下花色苷分子的運(yùn)動(dòng)加劇，導(dǎo)致分子難以吸附在樹脂表面，且溫度的升高對花色苷有所破壞；第二，溫度升高增大了溶液中花色苷的溶解度，從而導(dǎo)致樹脂對花色苷的吸附效果下降。因此，在本試驗(yàn)的吸附過程中，在30 ℃吸附效果較好。

圖3　吸附時(shí)間(a)、pH值(b)和吸附溫度(c)對紅巧梅花色苷吸附率的影響Fig.3　Effect of adsorption time(a),pH(b) and temperature(c) on adsorption rate of anthocyanins from Globe Amaranth

2.2.2紅巧梅花色苷吸附正交試驗(yàn)結(jié)果由表3、表4、表5分析可知，各因素對樹脂吸附效果影響的程度依次為溫度>溶液pH>時(shí)間，且吸附溫度對樹脂吸附影響極顯著，溶液pH影響顯著，吸附時(shí)間影響不顯著。綜合極差分析、方差分析和多重比較分析結(jié)果可知，DM-28對紅巧梅花色苷的最佳吸附條件為A3B1C2，但與正交試驗(yàn)中吸附率最高的第4組組合A2B1C2不同，因此，為了考察條件組合的可靠性，通過重復(fù)性試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表6。

表 3　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理

(k1、k2、k3表示因素的每個(gè)水平的平均花色苷含量，極差R=同因素的k1、k2、k3中最大值-最小值)。

(k1,k2ork3shows the factors of each level of the average content of anthocyanins,Ris the same factor of the maximum and the minimum fromk1,k2,k3).

表 4　正交設(shè)計(jì)方差分析

P<0.01表示差異極顯著；P<0.05表示差異顯著。

P<0.01 shows extremely significant difference;P<0.05 shows significant differences.

表5　Duncan新復(fù)極差法多重比較結(jié)果

相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異顯著。

The same letter indicates no significant difference,different letters mean significant difference.

由表6可知，兩種處理對大孔樹脂吸附效果的影響差異不顯著。綜合考慮，確定最佳樹脂吸附條件組合為A2B1C2，即：時(shí)間6 h，溶液pH2.8，溫度30 ℃。

表 6　驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

2.3樹脂靜態(tài)解吸試驗(yàn)結(jié)果

按最佳吸附條件吸附飽和的DM-28樹脂在不同解吸溫度、不同pH的乙醇溶液、不同乙醇濃度下的解吸結(jié)果如圖4(a～c)所示，從圖4(a)中解吸溫度對紅巧梅花色苷的解吸效果可知，在溫度20～60 ℃內(nèi)紅巧梅花色苷的解吸率呈現(xiàn)先升后降的特征，相對較高的溫度下，分子運(yùn)動(dòng)相對較快而有利于解吸；同時(shí)因天然色素穩(wěn)定性不高，在溫度過高的情況下解吸較長的時(shí)間則可能引起色素的分解，測試結(jié)果表明，在溫度40 ℃時(shí)，紅巧梅花色苷解吸率達(dá)到較高值，因此，選定解吸溫度為40 ℃較適合。由圖4(b)可知，在pH 2～7范圍內(nèi)，解吸液的吸光值先增大后減小，在pH 5.0時(shí)解吸率達(dá)到最大，這可能與紅巧梅花色苷在酸性條件下以更為穩(wěn)定的氧鎓鹽結(jié)構(gòu)有關(guān)[17]，因此選擇pH 5.0的乙醇溶液進(jìn)行解吸較佳。圖4(c)表明，隨著乙醇溶度的增大，紅巧梅花色苷解吸率總體呈上升的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，解吸率達(dá)到最大值，故以90%的乙醇溶液進(jìn)行解吸較好。

圖 4　解吸溫度(a)、乙醇溶液pH(b)和乙醇濃度(c)對紅巧梅花色苷解吸率的影響Fig.4　Effect of desorption temperature(a),ethanol solution pH(b) and ethanol concentration(c) on desorption rate of anthocyanins from Globe Amaranth

2.4紅巧梅花色苷的色價(jià)測定

紅巧梅花色苷經(jīng)優(yōu)選的靜態(tài)樹脂吸附和解吸條件純化后，通過1.3.6所述方法測其色價(jià)，純化后花色苷色價(jià)為純化前的4.84倍，說明DM-28樹脂對紅巧梅花色苷的純化效果較好。

3結(jié)論

按紅巧梅花色苷優(yōu)選水提工藝，提取所得紅巧梅花色苷溶液用于樹脂純化，結(jié)合吸附率與解吸率，從8種大孔樹脂中篩選出DM-28為純化紅巧梅花色苷較佳的大孔樹脂類型。經(jīng)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)選出DM-28最佳靜態(tài)吸附工藝為：吸附時(shí)間6 h，溶液pH 2.8，吸附溫度30 ℃，在此條件下，吸附率達(dá)到86.26%；解吸液具有減弱被吸附物質(zhì)與樹脂之間吸附力的作用，解吸效果常受到解吸液濃度、解吸液pH及解吸溫度等多種因素的影響，本試驗(yàn)得到紅巧梅花色苷的解吸工藝參數(shù)為:解吸溫度40 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%、解吸pH5.0。經(jīng)DM-28純化后紅巧梅花色苷色價(jià)為純化前的4.84倍，結(jié)果表明DM-28型大孔樹脂對分離純化紅巧梅花色苷具有較好的效果。

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Purification of Anthocyanin fromGlobeAmaranthby

Macroporous Resin Static Adsorption

XU Xiao-xiang1，JIANG Yan1，HONG Yan-ping1*，HU Jie-fang1，

WU Shao-fu1，YIN Xiao-li2，WANG Chun-rong1

(1.Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Food，College of Food Science and Engineering，JAU,Nanchang 330045，China；2.Library of JAU，Nanchang 330045，China)

Abstract：Through detecting the static adsorption and desorption rates of anthocyanins in the solution of Globe Amaranth,DM-28 was employed as the most favorable adsorption resin for anthocyanins from Globe Amaranth in the eight types of resins,and the resin purification conditions were explored.The result showed that the preferable adsorption and desorption parameters were adsorption at 50 ℃ and at pH 2.8 for 6 h and the desorption at 40 ℃with 90% ethanol solution at pH 5.0.The color value of the purified natural pigment was 4.84 times that of the origin sample.

Key words：Globe Amaranth;anthocyanin;resin purification

作者簡介：許小向(1990—)，女，碩士生，主要從事食品科學(xué)研究，E-mail：495540418@qq.com；*通信作者：洪艷平，副教授，E-mail：jxndspxy74@aliyun.com。

基金項(xiàng)目：國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD10B04-3)和贛鄱英才“555”工程領(lǐng)軍人才培養(yǎng)計(jì)劃

收稿日期：2014-06-20修回日期：2014-10-09

中圖分類號：TS201.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-2286(2015)01-0163-06