張有福，陳春艷，陳拓

(1.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,河南 洛陽　471003;2.中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所,甘肅 蘭州　730000)

?

兩種圓柏屬植物葉綠體膜脂肪酸組成和ATP酶活力的季節(jié)變化特征與比較

張有福1，陳春艷1，陳拓2

(1.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,河南 洛陽471003;2.中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所,甘肅 蘭州730000)

摘要：以2種常綠的祁連圓柏(SabinaprzewalskiiKom.)和圓柏(Sabinachinensis(Lin) Ant.)為材料，測定葉綠體膜脂脂肪酸組分及膜功能蛋白活力的季節(jié)變化，比較分析2種植物的種間差異.結(jié)果表明：祁連圓柏和圓柏葉綠體膜脂中不飽和脂肪酸亞油酸(18∶2)、亞麻酸(18∶3)與月平均氣溫呈顯著負(fù)相關(guān)，而飽和脂肪酸棕櫚酸(16∶0)和硬脂酸(18∶0)與月平均氣溫呈顯著正相關(guān)；K+Na+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase的活性也與月平均氣溫呈顯著負(fù)相關(guān).抗寒性強的祁連圓柏葉綠體膜脂中亞麻酸含量顯著低于抗寒性弱的圓柏，而其飽和脂肪酸花生四烯酸含量顯著高于圓柏.可見，季節(jié)性變化中不飽和脂肪酸的比例提高有利于圓柏屬植物抗寒性增強，但不飽和脂肪酸含量高低并不是物種間抗寒性強弱的決定因素.

關(guān)鍵詞：葉綠體；脂肪酸；ATP酶；圓柏；祁連圓柏

第一作者：張有福 (1978-) ，男，博士，副教授，主要從事植物逆境生理的研究.E-mail:zyfgau@163.com

植物細(xì)胞膜對環(huán)境變化極為敏感，其結(jié)構(gòu)與功能的改變是植物對環(huán)境脅迫最初與最基本的反應(yīng)[1].細(xì)胞膜是具有流動性的脂類和鑲嵌其中的蛋白質(zhì)分子組成.膜脂脂肪酸組分及其比例是決定膜流動性的關(guān)鍵因素，進(jìn)一步影響到膜蛋白質(zhì)的功能.研究發(fā)現(xiàn)，植物膜脂中不飽和脂肪酸比例高，有利于降低膜脂的相變溫度，從而降低植物細(xì)胞耐受低溫的臨界溫度，抗寒能力增強[2-3].然而膜脂組分和膜功能受到物種、環(huán)境及其二者相互作用的影響，其中高山常綠植物膜脂組分與溫度的關(guān)系仍不清楚.低溫是引起植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能季節(jié)變化的關(guān)鍵環(huán)境因子.常綠植物葉齡長，可經(jīng)歷整年的季節(jié)性溫度變化.常綠植物無疑是研究植物對季節(jié)性環(huán)境溫度改變適應(yīng)的理想材料.

葉綠體是最容易受到低溫傷害的細(xì)胞器，其內(nèi)部一些相關(guān)蛋白質(zhì)均對低溫敏感[4].在低溫脅迫條件下，葉綠體的超微結(jié)構(gòu)也易發(fā)生改變[5-6].研究發(fā)現(xiàn)，冬季低溫會導(dǎo)致圓柏葉綠體基粒間連接松弛、部分基粒溶解的受害現(xiàn)象，但祁連圓柏葉綠體受害癥狀不明顯[6]，說明二者葉綠體耐受低溫的能力存在差異.推測這種差異與葉綠體膜脂組分和功能蛋白密切相關(guān).因此，研究葉綠體膜脂組分和功能蛋白活性與環(huán)境溫度季節(jié)變化的關(guān)系尤為重要.

祁連圓柏(SabinaprzewalskiiKom.)和圓柏(Sabinachinensis(Lin) Ant.)是我國西部山區(qū)常見的常綠樹種.其中祁連圓柏主要分布在海拔2 600～4 000 m 的高山地區(qū)，而圓柏多分布在海拔500～1 900 m的丘陵地區(qū)[6].本研究通過分析兩種圓柏屬植物葉綠體膜脂脂肪酸組分和功能蛋白質(zhì)活性的季節(jié)變化，探索葉綠體膜脂脂肪酸組成與環(huán)境溫度變化的關(guān)系，為探討植物適應(yīng)高原氣候的機(jī)制提供借鑒和參考.

1材料與方法

1.1試驗區(qū)概況和樣品采集

試驗地位于蘭州市東南20 km處的榆中縣二陰山區(qū)(N 35°01′，E 103°33′)，海拔1 900 m.該區(qū)屬干旱、半干旱氣候區(qū)，氣候干燥，夏季溫和，冬季寒冷；年平均氣溫7.6 ℃，極端最高溫度28.4 ℃，極端最低溫度-13.9 ℃，年平均無霜期110 d；年平均降水量362 mm.材料培養(yǎng)和樣品采集如簡啟亮等所述[7].2004年5月，將兩樹種的3年生實生苗移栽于試驗地中.人工去除雜草，無遮陰.2006年的每月下旬采集樹冠中部外圍枝條上的葉樣，每種樹以10棵樹樣品混勻為1個重復(fù)，共3個重復(fù).采集的樣品用液氮固定后置于超低溫冰箱(-80 ℃) 中保存直到測定.

1.2試驗方法

參照Reeves和Hall的方法[8]，樣品在預(yù)冷的提取液(50 mmol/L HEPES-NaOH(pH 7.5)，0.4 mol/L蔗糖，10 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2)4 ℃研磨成勻漿，過4層紗布，1 000g離心1 min，取上清，6 000g離心10 min，取沉淀，用2 mL提取液將沉淀懸起，4 ℃保存?zhèn)溆?用80%的丙酮提取離體葉綠體中葉綠素含量.膜脂脂肪酸提取和脂肪酸甲酯制備按Morrison和Smith的方法進(jìn)行[9].葉綠體懸浮液加入2 mL CHCl3-CH3OH(1∶1,V/V)，待分層后，收集下層并低溫蒸干形成極性脂的粗體物，然后加入2 mL 1.5% KOH甲醇在60 ℃皂化30 min，加入BF3甲醇溶液反應(yīng)生成脂肪酸甲酯，加入正己烷將甲酯萃取.氣相色譜(CP-3800)運行按照以下程序，以3℃/min的速率升溫至250 ℃，然后保持5 min，載氣為N2，流速是300 cm/s.南京建成公司試劑盒法測定Ca2+Mg2+-ATP和K+Na+-ATP酶的活性，具體方法參見南京建成公司的ATP酶測試盒說明書.

1.3數(shù)據(jù)處理

成對樣本的t檢驗和相關(guān)分析采用SPSS 17.0軟件.

2結(jié)果與分析

2.1葉綠體膜脂脂肪酸組成及其季節(jié)變化

兩種圓柏屬植物葉綠體膜脂脂肪酸的成分主要有飽和脂肪酸棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)和花生四烯酸(20∶0)，不飽和脂肪酸油酸(18∶1)、亞油酸(18∶2)和亞麻酸(18∶3)， 其中不飽和度高的亞麻酸含量最高，其次為棕櫚酸，油酸最低；不飽和脂肪酸亞油酸和亞麻酸約占脂肪酸比例的60%.葉綠體不飽和脂肪酸的比例較高.它們的相對含量也發(fā)生明顯的季節(jié)性變化(圖1～2).在冬季，不飽和脂肪酸的比例提高，尤其亞油酸(18∶2)和亞麻酸(18∶3)比例明顯高于夏季；而飽和脂肪酸的比例降低，其中棕櫚酸(16∶0)和硬脂酸(18∶0)顯著低于其它季節(jié).推測冬季不飽和脂肪酸的比例提高利于低溫條件下膜功能的維持.

圖1　不同季節(jié)祁連圓柏葉綠體脂肪酸的組成Fig.1　Fatty acid composition in isolated chloroplastsof S.przewalskii in different seasons

2.2葉綠體K+Na+-ATP酶的季節(jié)變化

2種圓柏屬植物中葉綠體K+Na+-ATP酶活性的季節(jié)變化模式相似，均表現(xiàn)為冬季K+Na+-ATP酶活性高，而夏季低(圖3).可見，季節(jié)性降溫可提高葉綠體K+Na+-ATP酶的活性.

圖2　不同季節(jié)圓柏葉綠體脂肪酸的組成Fig.2　Fatty acid composition in isolated chloroplastsof S.chinensis in different seasons

圖3　不同月份祁連圓柏(SP)和圓柏(SC)葉綠體K+Na+-ATP酶的活性Fig.3　The K+Na+-ATPase activity in isolated chloroplasts of S.przewalskii (SP) andS.chinensis(SC) in different months

2.3葉綠體Ca2+Mg2+-ATP酶活的季節(jié)變化

如圖4所示，祁連圓柏和圓柏植物葉綠體Ca2+Mg2+-ATP酶的活性均表現(xiàn)為冬季高，而夏季低，這與二者K+Na+-ATP酶的季節(jié)變化趨勢也一致.季節(jié)性溫度的變化對Ca2+Mg2+-ATP和K+Na+-ATP酶活性的影響是一致的.

2.4兩種圓柏植物葉綠體脂肪酸組分和ATP酶的差異分析

經(jīng)成對樣本的t測驗，圓柏葉綠體膜脂中油酸(18∶1)和亞麻酸(18∶3)含量顯著高于祁連圓柏，而圓柏花生四烯酸(20∶0)含量顯著低于祁連圓柏(P<0.05，表1).祁連圓柏葉綠體膜脂中棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)和亞油酸(18∶2)含量與圓柏之間差異不顯著(P>0.05).葉綠體中Ca2+Mg2+-ATPase和K+Na+-ATPase的活性在兩種圓柏之間差異也不顯著(P>0.05).說明物種間膜脂組分受到飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸及其內(nèi)部組分差異的影響.

2.5葉綠體膜脂組成和ATP酶活性與氣溫的相關(guān)性

兩種圓柏屬植物葉綠體膜脂中不飽和脂肪酸油酸(18∶1)、亞油酸(18∶2)和亞麻酸(18∶3)與平均氣溫呈負(fù)相關(guān)，而飽和脂肪酸棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)和花生四烯酸(20∶0) 與月平均氣溫均呈正相關(guān)，其中棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸和亞麻酸與月平均氣溫之間相關(guān)性顯著(P<0.05，表2).葉綠體Ca2+Mg2+-ATPase和K+Na+-ATPase的活性與月平均氣溫呈極顯著性負(fù)相關(guān)(P<0.01).表明季節(jié)性溫度變化是影響葉綠體膜脂脂肪酸組分和ATP酶活性的重要因子.

圖4　不同月份祁連圓柏(SP)和圓柏(SC)葉綠體Ca2+Mg2+-ATP酶的活性Fig.4　The Ca2+Mg2+-ATPase activity in isolated chloroplasts of S.przewalskii and S.chinensis in different months

樹種16∶018∶018∶118∶218∶320∶0K+Na+-ATPCa2+Mg2+-ATPS.P22.4±1.52.0±0.46.4±0.621.1±1.729.5±1.318.5±2.66.41±0.66.3±0.7S.C24.7±1.61.7±0.59.8±1.119.0±1.136.9±1.57.9±1.56.47±0.55.0±0.5p0.1150.4590.0180.1050.0000.0010.9170.058

n=12；16∶0、18∶0、18∶1、18∶2、18∶3、20∶0的單位為%，Ca2+Mg2+-ATPase和K+Na+-ATPase單位為μmol/h/mg.

表2　月平均氣溫與葉綠體膜脂脂肪酸組分和ATP酶的泊松相關(guān)系數(shù)

*表示在0.05水平上相關(guān)性顯著.

3討論

類囊體膜屬于葉綠體光合膜系統(tǒng)，光合膜中包含有將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能所需的許多功能蛋白，維持膜流動和穩(wěn)定是植物正常生理代謝的基礎(chǔ)[10].本研究表明季節(jié)性低溫可誘導(dǎo)兩種圓柏屬植物葉綠體不飽和脂肪酸比例提高(表2).這有利于降低膜的相變溫度和維持低溫條件下植物膜的流動性與功能[11]；同時還有利于保護(hù)光合電子傳遞系統(tǒng)，減輕低溫導(dǎo)致的光抑制[12].可見，冬季兩種圓柏屬植物葉綠體膜脂不飽和脂肪酸的增加可提高耐受低溫的能力，也是二者適應(yīng)季節(jié)性溫度變化的反應(yīng).

一般認(rèn)為，植物膜脂中不飽和程度高的脂肪酸含量與其耐寒性正相關(guān)[13].祁連圓柏的抗寒性強，但不飽和程度高的亞麻酸含量卻顯著低于抗寒性弱的圓柏(P<0.05，表1).這與Roche[14]在小麥葉綠體類囊體膜脂肪酸的組成與其抗寒性的關(guān)系研究一致，即葉綠體膜脂脂肪酸組與物種間抗寒性強弱無直接關(guān)系，認(rèn)為低溫下膜不飽和脂肪酸的增加只是植物適應(yīng)低溫的一種普遍規(guī)律.膜功能和流動性不僅與膜脂組成有關(guān)，還可能與其他因素有關(guān)，如適宜的膜脂和膜蛋白比率及其相互作用是調(diào)節(jié)膜功能的關(guān)鍵因素[15].另外，祁連圓柏膜系統(tǒng)的穩(wěn)定也歸因于較強的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)[7,16].

葉綠體的ATP 酶是光合磷酸化的偶聯(lián)因子，是一種與葉綠體膜結(jié)合的復(fù)合蛋白，其活性大小也反映植物光合磷酸化的程度[17].ATP酶常常因低溫傷害而活力降低，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞生理代謝紊亂.冬季祁連圓柏和圓柏葉綠素總含量降低[7]，而單位葉綠素K+Na+-ATP和Ca2+Mg2+-ATP酶活性升高(圖3～4).通常低溫會誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平迅速提高，但細(xì)胞質(zhì)中過高的Ca2+濃度或者維持其高濃度時間過長均會干擾細(xì)胞的生理代謝，導(dǎo)致代謝紊亂，造成細(xì)胞死亡，包括葉綠體外膜和質(zhì)膜Ca2+Mg2+-ATP酶可以調(diào)節(jié)胞質(zhì)Ca2+濃度，有助于胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的維持，從而保證細(xì)胞的正常生理功能[18].因此，ATP酶活性提高有利于避免Ca2+對植物的毒害，也是2種圓柏屬植物抗寒性的增強原因.抗寒性強的祁連圓柏葉綠體Ca2+Mg2+-ATP酶活性明顯高于圓柏，但K+Na+-ATP酶活在兩種植物之間差異較小.推斷Ca2+Mg2+-ATP酶活性差異與圓柏屬植物種間耐寒性差異有關(guān)，這也與祁連圓柏光能轉(zhuǎn)化效率強于圓柏的研究結(jié)果相一致[19].既然祁連圓柏分布在光照強、氣溫低，且二者變化劇烈的高海拔地區(qū)，高的光化學(xué)轉(zhuǎn)化效率及其細(xì)胞內(nèi)離子和能量調(diào)節(jié)能力有利于適應(yīng)氣溫的急劇變化.

參考文獻(xiàn)

[1]王洪春.植物抗性生理[J].植物生理學(xué)通訊,1981(6):72-81

[2]Novitskaya G V,Suvorova T A,Trunova T I.Lipid composition of tomato leaves as related to plant cold tolerance[J].Russ J Plant Physiol,2000,47(6):728-733

[3]王萍,張成軍,陳國祥,等.低溫對水稻幼苗類囊體膜脂肪酸組分和膜脂過氧化的影響[J].中國水稻科學(xué),2006,20(4):401-405

[4]Guy C L.Cold acclimation and freezing stress tolerance:role of protein metabolism[J].Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,1990,41:187-23

[5]Kratsch H A,Wise R R.The ultrasturcture of chilling stress[J].Plant Cell Environ,2000,23:337-350

[6]張有福,陳銀萍,張滿效,等.兩種圓柏屬植物不同季節(jié)顯微和超微結(jié)構(gòu)變化與耐寒性的關(guān)系[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2006,17(8):1393-1397

[7]簡啟亮,文隴英,陳拓,等.祁連圓柏和圓柏色素含量及其花青苷合成酶活性的季節(jié)性變化[J].植物學(xué)報,2010,45 (6):698-704

[8]Reeves S G,Hall D O.Photosynthesis and nitrogen fixation.Higher plant chloroplasts and granna:general preparative procedures (excluding high carbon dioxide fixation ability chloroplasts)[M]∥Colowick S P，Kaplan N O.Methods of Enzymology.New York：Academic Press,1980：85-104

[9]Morrison W R,Smith L M,Preparation of fatty acid methyl esters and dimethyl acetals from lipids with boron trifluoride methanol[J].J Lipid Res,1964,5:600-608

[10]王靜,張成軍,陳國祥,等.低溫對灌漿期水稻劍葉光合色素和類囊體膜脂肪酸的影響[J].中國水稻科學(xué),2006,20(2):177-182

[11]Lyons J M.Chilling injury in plants[J].Annu Rev Plant Physiol,1973,24:445-446

[12]Moon B Y,Higashi S,Gombos Z,et al.Unsaturation of the membrane lipids of chloroplasts stabilizes the photosynthetic machinery against low-temperature photoinhibition in transgenic tobacco plants[J].PNAS,1995,92:6219-6223

[13]楊亞軍,鄭雷英,王新超.低溫對茶樹葉片膜脂脂肪酸和蛋白質(zhì)的影響[J].亞熱帶植物科學(xué),2005,34(1):5-9

[14]Roche D L.Changes in phospholipids composition of a winter wheat cultivar during germination at 2 ℃ and 24 ℃[J].Plant Physiol,1973,51:468-473

[15]Chapman D J,De-Felice J,Barber J.Growth temperature effects on.thylakoid membrane lipid and protein content of pea chloroplasts[J].Plant Physiol,1983,72:225-228

[16]陳曉莉,張鵬,張濤,等.不同海拔青海云杉與祁連圓柏葉片抗氧化酶活性的研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,44(1):118-122

[17]孫富,楊麗濤,謝曉娜,等.低溫脅迫對不同抗寒性甘蔗品種幼苗葉綠體生理代謝的影響[J].作物學(xué)報,2012,38(4):732-739

[18]鄭姍姍,李丹,蔣欣梅,等.漸降低溫脅迫對黃瓜幼苗葉綠體膜相關(guān)指標(biāo)的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報：理學(xué)版,2012,39(5):582-586

[19]張有福,陳春艷,陳拓,等.2種圓柏屬植物葉綠素?zé)晒鈱竟?jié)變化的響應(yīng)特征[J].植物研究,2010,30(3):289-293

(責(zé)任編輯李辛)

Seasonal variation characteristics and comparison in

chloroplast membrane fatty acid composition

and ATPase activity in twoSabinatrees

ZHANG You-fu1，CHEN Chun-yan1，CHEN Tuo2

(1.College of Henan Science and Technology University,Luoyang 471003,China;2.Cold and Arid Region

Environmental and Engineering Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

Abstract：Taking leaves ofSabinaprzewalskiiKom.andSabinachinensis(Lin) Ant as materials,chloroplast membrane fatty acid components and seasonal variation in membrane protein activity were measured to compare the inter-specific difference.The results showed that there was negative correlation between unsaturated fatty acid including linoleic acid (18∶2) and linolenic acid (18∶3) in chloroplast membrane lipid and monthly average temperature(MAT)inS.przewalskiiandS.chinensis.However the saturated fatty acid,such as palmitic acid (16∶0) and stearic acid (18∶0) were significantly positive correlated with MAT.The activity of K+Na+-ATPase and Ca2+Mg2+-ATPase in chloroplasts also appeared significantly negative correlation with MAT in bothSabinatrees.Compared withS.chinensischaracterized by weak cold-resistance,S.przewalskiihad significant lower linolenic acid and higher arachidonic acid.Therefore,increase of unsaturated fatty acids ratios in seasonal cold helpSabinatrees to improve cold-resistance,while the content of unsaturated fatty acid is not determinant of cold-resistance for different tree species.

Key words：chloroplasts；fatty acids；ATPase；Sabinachinensis；Sabinaprzewalskii

收稿日期：2015-10-13；修回日期：2015-10-28

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31200299)

中圖分類號：S 791.44

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)06-0094-05